賈莉莉+范李萍+李娟+陳全家+張海燕+王希東+曲延英

摘要： 海島棉作為新疆特有的資源，其優(yōu)良的纖維品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值都是其他作物不可替代的，因此選育抗性優(yōu)良的海島棉新品系（品種）顯得尤為重要。以海島棉K222、新海25、新海30為受體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)導(dǎo)入目的基因Bt，通過PCR檢測、Southern雜交、Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條檢測、抗蟲性鑒定等，隨后又對轉(zhuǎn)Bt基因海島棉品系的纖維品質(zhì)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)目的基因Bt的導(dǎo)入對9個(gè)海島棉品系的纖維品質(zhì)有不同程度的影響。PCR檢測結(jié)果表明，9個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因品系都含有目的基因，并且陽性率都在90%以上；由Southern雜交結(jié)果可看出，7個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因品系出現(xiàn)了雜交條帶，其中3個(gè)品系為單拷貝，3個(gè)品系為雙拷貝，1個(gè)品系為三拷貝。用Bt-Cry1Ab/1Ac免疫試紙條檢測轉(zhuǎn)Bt基因品系及對照，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因品系的試紙條上出現(xiàn)2條紫紅色條帶，而對照的試紙條上只出現(xiàn)1條紫紅色條帶，K2-ZKC66 的陽性率達(dá)到90%?？瓜x性鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Bt基因品系的葉片受危害較輕，葉片較為完整，對照葉片受危害較重，葉片不完整，7個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉品系校正死亡率都在60%以上。與對照相比，部分轉(zhuǎn)Bt基因海島棉品系上半部平均長度和長度整齊度顯著降低，斷裂比強(qiáng)度極顯著降低，斷裂伸長率極顯著增加，短纖維率顯著增加，成熟度極顯著降低，馬克隆值極顯著增加。結(jié)果顯示，7個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因品系的目的基因已成功整合到海島棉基因組中。與對照相比，轉(zhuǎn)基因品系纖維品質(zhì)差異顯著。

關(guān)鍵詞： 轉(zhuǎn)基因技術(shù)；海島棉；；Bt基因；抗蟲性；纖維品質(zhì)；生物育種

中圖分類號： Q785；S562.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0097-05

轉(zhuǎn)基因是一項(xiàng)新技術(shù)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一項(xiàng)新的產(chǎn)業(yè)。自1983年世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物煙草問世以來[1]，對轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲、抗除草劑、抗病及品質(zhì)改良方面的研究與應(yīng)用取得了巨大進(jìn)展[2-4]。1996—2014年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積從170萬hm2增至1.815億hm2，增加了100多倍，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物成為全球推廣種植最為迅速的作物，這也使轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為近代史上發(fā)展最快的作物改良技術(shù)。美國是全球轉(zhuǎn)基因作物種植的第一大國，種植的轉(zhuǎn)基因作物包括玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜、紫苜蓿、木瓜和南瓜等，其中棉花、大豆和玉米種植面積較廣。我國是世界上率先研究農(nóng)業(yè)生物育種的國家之一，轉(zhuǎn)基因育種的面積也一直位居世界前列，棉花是我國主要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有舉足輕重的地位[5]。近年來，隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，利用生物技術(shù)創(chuàng)新棉花種質(zhì)資源和培育新品種是一條非常有效的途徑，極大地推動了棉花遺傳育種的發(fā)展[6]。我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉作為生物育種創(chuàng)新成功的典范在國際上產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，將Bt基因轉(zhuǎn)入到棉花中后，可以使棉花表達(dá)殺蟲蛋白，從而能殺死目標(biāo)害蟲進(jìn)而可以減少殺蟲劑的使用[7-9]，抗蟲棉的種植與推廣在一定程度上降低了棉鈴蟲對棉花產(chǎn)量的影響，給棉花產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。隨著轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的長期種植，陸地棉抗蟲性得到了很大提高[10-13]。但是新疆特有的海島棉轉(zhuǎn)基因抗蟲性研究卻相對落后，至今仍未有轉(zhuǎn)基因抗蟲海島棉品系的報(bào)道。本試驗(yàn)利用前期通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得的轉(zhuǎn)基因海島棉品系（品種）開展PCR檢測及Southern雜交等室內(nèi)分子檢測，以及大田Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條檢測與室內(nèi)抗蟲性鑒定等，分析目的基因Bt轉(zhuǎn)入受體及表達(dá)的情況，為培育新疆地區(qū)抗蟲優(yōu)良的海島棉品種（品系）提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料是由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因Bt導(dǎo)入海島棉K222、新海25和新海30，經(jīng)過多代系統(tǒng)選育得到的高代轉(zhuǎn)基因材料[14-15]。目的基因Bt是由郭三堆研究員惠贈，現(xiàn)由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，Bt基因植物表達(dá)載體是由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的。本試驗(yàn)所用的品種（品系）為海島棉K222（對照）及其轉(zhuǎn)Bt基因的7個(gè)品系（K2-ZKC31、K2-ZKC37、K2-ZKC53、K2-ZKC58、K2-ZKC65、K2-ZKC66、K2-ZKC70），新海25（對照）及其轉(zhuǎn)Bt基因的XH25-ZKC和新海30（對照）及其轉(zhuǎn)Bt基因的XH30-ZKC。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PCR檢測及Southern雜交

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)種植待檢測樣品，苗期取樣，采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）提取棉花基因組DNA，PCR擴(kuò)增體系為25 μL，引物序列上游為5′-CAACGGTTCCGCTCTTTCTG-3′，下游為5′-CGTGGTTCTGCCCAAGGTAT-3′，擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，再用溴化乙錠染色10 min，凝膠成像儀拍照。根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無，可以初步判斷轉(zhuǎn)基因品系。

利用Southern雜交技術(shù)檢測目的基因是否整合到棉花基因組中及其拷貝數(shù)。取20 μg DNA，用HindⅢ于37 ℃酶切 6 h，35 V電泳至彌散條帶后轉(zhuǎn)印于尼龍膜，按照Roche公司的PCR DIG Probe Synthesis Kit說明進(jìn)行探針標(biāo)記、雜交和顯色處理。

1.2.2 Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條檢測

Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條能快速、定性檢測轉(zhuǎn)基因植株中是否含有特異性的 Bt-Cry1Ab、Bt-Cry1Ac蛋白。采用美國Agdia公司生產(chǎn)的免疫檢測試紙條檢測。首先采集PCR呈陽性植株葉片，按照試紙條檢測說明書進(jìn)行規(guī)范操作，若結(jié)果顯示2條紫紅色條帶，1條為質(zhì)控線，另1條為檢測線則為陽性品系；若結(jié)果只有1條紫紅色條帶則為非轉(zhuǎn)基因品系（品種）；若試紙條未出現(xiàn)任何1條條帶，則操作有誤，應(yīng)重新操作。根據(jù)是否出現(xiàn)2條紫紅色條帶，確定轉(zhuǎn)基因材料的株數(shù)，計(jì)算陽性率。

1.2.3 棉鈴蟲飼喂檢測

棉鈴蟲由中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所惠贈，蟲齡包括2、3、4齡。采集大小一致陽性植株的幼嫩葉片放入培養(yǎng)皿中，葉柄一端用浸濕的脫脂棉包裹，每張葉片接5頭蟲，用塑料膜包裹培養(yǎng)皿，放入室內(nèi)培養(yǎng)。5 d 后觀察葉片受危害情況，計(jì)算幼蟲校正死亡率。

幼蟲校正死亡率=（處理幼蟲死亡率-對照幼蟲死亡率）/（1-對照幼蟲死亡率）×100%?？瓜x性評判標(biāo)準(zhǔn)：校正死亡率>90%，高抗；60%<校正死亡率≤90%，抗??；40%<校正死亡率≤60%，中抗；校正死亡率≤40%，感病。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)Bt基因品系的分子檢測結(jié)果分析

2.1.1 PCR檢測結(jié)果分析

對轉(zhuǎn)Bt基因品系及對照進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增，以非轉(zhuǎn)基因品種K222、新海25和新海30為陰性對照，以含有目的片段的質(zhì)粒為陽性對照，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和拍照分析。由圖1、圖2可以看出，樣品均有特異性條帶，且與陽性對照質(zhì)粒條帶大小一致，均在 400 bp 左右，而陰性對照沒有擴(kuò)增出目的條帶，因此可初步判斷目的基因存在于棉花中。

2.1.2 Southern雜交結(jié)果分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)Bt基因品系的目的基因是否整合到棉花基因組中以及拷貝數(shù)，分別對PCR檢測得到的陽性植株進(jìn)行Southern Blotting分析（圖3）。結(jié)果表明，在9個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中，7個(gè)轉(zhuǎn)基因品系出現(xiàn)了雜交帶，陽性質(zhì)粒出現(xiàn)了雜交帶，陰性對照沒有出現(xiàn)雜交帶；3、4、6、7、9、11和13泳道出現(xiàn)了雜交帶，分別是K2-ZKC31、K2-ZKC37、K2-ZKC65、K2-ZKC70、K2-ZKC66、XH25-ZKC和XH30-ZKC，并且4、7和13顯示為雙拷貝，對應(yīng)的品系名稱分別是K2-ZKC37、K2-ZKC70和XH30-ZKC；3、6和9顯示為單拷貝，對應(yīng)的品系分別是K2-ZKC31、K2-ZKC65和K2-ZKC66；11（XH25-ZKC）顯示為三拷貝；2、10和12是陰性對照，都未出現(xiàn)雜交帶，通過以上結(jié)果可以證明，7個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的目的基因已經(jīng)整合到海島棉基因組中。

2.2 Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條檢測結(jié)果分析用Bt免疫試紙條檢測轉(zhuǎn)Bt基因品系，陽性結(jié)果在檢測試劑條上出現(xiàn)2條紫紅色條帶，1條為檢測線，另1條為質(zhì)控線，陰性結(jié)果只含有1條紫紅色質(zhì)控線（圖4）。經(jīng)過Bt免疫試紙條檢測后，其中圖4-A出現(xiàn)了2條紫紅色的條帶，為轉(zhuǎn)Bt基因品系，圖4-B只出現(xiàn)了1條紫紅色條帶，為非轉(zhuǎn)Bt基因品系。由Bt免疫試紙條統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1）可以看出，K2-ZKC66 的陽性率達(dá)到90%，其他（除K2-ZKC53和 K2-ZKC58 以外）轉(zhuǎn)Bt基因品系的陽性率略低，在30%～60%之間。

2.3 轉(zhuǎn)Bt基因品系抗蟲性檢測結(jié)果分析

棉葉接蟲5 d后，由圖5可以看出，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉葉片受棉鈴蟲危害較輕，整個(gè)葉片也較為完整，而對照組葉片受棉鈴蟲危害較重，整張葉片只剩下1/3，說明抗蟲棉能減緩棉鈴蟲對葉片的危害。由轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉抗蟲性鑒定結(jié)果（表2）可看出，7個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉品系幼蟲校正死亡率都在60%以上，其中K2-ZKC31、K2-ZKC66和K2-ZKC70的棉鈴蟲幼蟲校正死亡率在80%及其以上；XH25-ZKC和XH30-ZKC的幼蟲校正死亡率相對較低，均為66%。由幼蟲校正死亡率可以得到轉(zhuǎn)Bt基因海島棉的抗性級別，除K2-ZKC53和 K2-ZKC58外，其他轉(zhuǎn)Bt基因品系抗性為抗。

2.4 轉(zhuǎn)基因品系纖維品質(zhì)與對照比較分析

由表3可知，K2-ZKC37、K2-ZKC65和K2-ZKC66的上半部平均長度、長度整齊度極顯著低于對照，K2-ZKC70的上半部平均長度、長度整齊度顯著低于對照；K2-ZKC37、K2-ZKC65、K2-ZKC66和K2-ZKC70的斷裂比強(qiáng)度極顯著低于對照；K2-ZKC37、K2-ZKC65、K2-ZKC66的斷裂伸長率極顯著低于對照； K2-ZKC65、K2-ZKC66和K2-ZKC70的短纖維率極顯著高于對照，K2-ZKC37的短纖維率顯著高于對照；K2-ZKC37、K2-ZKC65、K2-ZKC66成熟度極顯著高于對照；K2-ZKC58和K2-ZKC70的馬克隆值極顯著高于對照。XH25-ZKC與XH25、XH30-ZKC與XH30的纖維品質(zhì)無顯著差異，都保持著原品系的性狀，可以說明Bt基因?qū)隭H25和XH30，沒有改變它們的纖維品質(zhì)。

3 討論

PCR檢測可以證明待測樣品中是否含有目的條帶，但會因引物設(shè)計(jì)不合理以及目的基因在受體中重排等原因使PCR檢測出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，所以還需要進(jìn)一步進(jìn)行Southern雜交檢測，它是在DNA水平上檢測目的基因是否整合到受體染色體上的技術(shù)。符家平等對轉(zhuǎn)Bt基因苧麻T0和T1代分子檢測，結(jié)果顯示PCR檢測呈陽性的T0和T1代植株做Southern雜交都得到了單一雜交條帶，表明外源基因片段轉(zhuǎn)入到受體中[16]。本試驗(yàn)中，PCR檢測轉(zhuǎn)Bt基因品系擴(kuò)增出目的條帶，可初步判斷Bt基因轉(zhuǎn)到了受體中，在進(jìn)一步的Southern 雜交檢測中，7個(gè)轉(zhuǎn)基因品系得到雜交條帶，可以證明這7個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的目的基因已經(jīng)整合到海島棉基因組中，已獲得的雜交條帶的拷貝數(shù)有單拷貝、雙拷貝和三拷貝等3種，檢測的轉(zhuǎn)基因品系中三拷貝的有1個(gè)，僅占14%，說明轉(zhuǎn)基因品系的遺傳穩(wěn)定性較高。本研究所用轉(zhuǎn)基因品系均是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的，農(nóng)桿菌介導(dǎo)過程中根癌農(nóng)桿菌是以低拷貝數(shù)整合到棉花基因組中的，而質(zhì)粒注射往往以多拷貝數(shù)整合到棉花基因組中[17]。李瓊等利用農(nóng)桿菌噴霧和質(zhì)粒注射處理后代植株，Southern雜交得出農(nóng)桿菌噴霧的平均單插入率高于質(zhì)粒注射，農(nóng)桿菌噴霧法也能轉(zhuǎn)化后代并且穩(wěn)定性較高[18]。

Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條可以定性檢測Bt毒蛋白。聶新輝等使用金標(biāo)Bt-Cry1Ab/1Ac試紙條檢測轉(zhuǎn)Bt基因棉花，得出轉(zhuǎn)Bt基因棉花的試紙條上出現(xiàn)2條紫紅色條帶，說明轉(zhuǎn)Bt基因棉花中含有Bt毒蛋白[19]。本試驗(yàn)中，K222轉(zhuǎn)Bt基因的部分品系以及XH25-ZKC和XH30-ZKC的試紙條檢測結(jié)果出現(xiàn)了2條紫紅色的條帶，可以說明部分轉(zhuǎn)基因品系中含有Bt毒蛋白。寧新民等用試紙條檢測外源抗蟲基因時(shí)，得出海島棉檢測線的清晰度比陸地棉低[20]，本試驗(yàn)結(jié)果與其有相似之處，這可能與外源基因轉(zhuǎn)入量有關(guān)或者與海島棉抗蟲基因的蛋白質(zhì)表達(dá)量有關(guān)[21-23]。

抗蟲性鑒定是在蛋白水平檢測轉(zhuǎn)Bt基因棉花。徐遙等所做棉鈴蟲的抗性試驗(yàn)報(bào)道得出Bt棉對棉鈴蟲有毒殺作用[24-26]。本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因品系葉片相對非轉(zhuǎn)基因品系（品種）葉片較完整，危害較輕，說明轉(zhuǎn)基因Bt棉能減緩棉鈴蟲對葉片的危害。李瑞奇等做轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲性鑒定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3代棉鈴蟲的校正死亡率和抗性都低于2代棉鈴蟲，并且隨著棉株生育期的進(jìn)展，棉株對棉鈴蟲的抗性明顯降低[27]。王峰等做抗蟲性鑒定試驗(yàn)得出，在2、3、4齡，棉鈴蟲發(fā)生盛期，陽性植株葉片對棉鈴蟲校正死亡率依次降低，植株的抗蟲性隨著植株的生長表現(xiàn)降低的趨勢[28]。本試驗(yàn)幼蟲校正死亡率大部分處于60%～85%之間，抗性級別處于抗，原因可能與采取棉株葉片時(shí)間、棉鈴蟲的齡數(shù)有關(guān)。

將Bt基因?qū)朊藁ê?，棉花農(nóng)藝性狀會發(fā)生一系列變化，其纖維品質(zhì)是非常重要的農(nóng)藝性狀，纖維品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和紡織工業(yè)。因?yàn)檗D(zhuǎn)Bt基因海島棉研究較少，所以前人都是以陸地棉為受體研究Bt基因?qū)牒筠r(nóng)藝性狀的改變[29-30]，得出Bt基因?qū)朊藁ê螅L度下降，強(qiáng)度提高，伸長率下降，馬克隆值升高[31]；轉(zhuǎn)Bt基因品系中部分品種上半部平均長度、整齊度、斷裂比強(qiáng)度、伸長率等高于非轉(zhuǎn)基因品種[32]；轉(zhuǎn)Bt+Sck基因?qū)雽γ藁ɡw維品質(zhì)無顯著影響[33]；轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的絨長下降、比強(qiáng)度不同程度增加以及纖維增粗[34]。其他目的基因?qū)腙懙孛藓?，其纖維品質(zhì)也發(fā)生不同程度的改變，轉(zhuǎn)基因棉花絨長和比強(qiáng)度不同程度增加，馬克隆值降低[35]；纖維長度及比強(qiáng)度下降、成熟度降低等[36]；轉(zhuǎn)基因棉花纖維品質(zhì)整體比受體顯著提高[37]。本研究將Bt基因?qū)牒u棉后，其纖維品質(zhì)發(fā)生的改變，填補(bǔ)了Bt基因?qū)雽u棉農(nóng)藝性狀研究的空白。在本研究中，與對照相比，部分轉(zhuǎn)Bt基因海島棉品系上半部平均長度和長度整齊度顯著降低、斷裂比強(qiáng)度極顯著降低、斷裂伸長率極顯著增加、短纖維率顯著增加、成熟度極顯著降低和馬克隆值極顯著增加，但也有個(gè)別品系的纖維品質(zhì)略高于對照。由于地區(qū)、材料以及數(shù)據(jù)處理之間的差異等造成轉(zhuǎn)基因與對照之間纖維品質(zhì)結(jié)果的不同，同一品種的不同株系間也會因性狀分離使纖維品質(zhì)表現(xiàn)出差異。

4 結(jié)論

以海島棉K222、新海25、新海30為受體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)導(dǎo)入目的基因Bt，通過PCR檢測、Southern雜交、Bt-Cry1Ab/1Ac 試紙條檢測、抗蟲性鑒定等，證明Bt基因已經(jīng)整合到海島棉基因組中并得到表達(dá)。與對照相比，部分轉(zhuǎn)Bt基因海島棉品系上半部平均長度和長度整齊度顯著降低、斷裂比強(qiáng)度極顯著降低、斷裂伸長率極顯著增加、短纖維率顯著增加、成熟度極顯著降低和馬克隆值極顯著增加，但也有個(gè)別品系的纖維品質(zhì)略高于對照。

參考文獻(xiàn)：

[1] Vaeck M，Reynaerts A，Hfte H，et al. Transgenic plants protected from insect attack[J]. Nature，1987，328（6125）：33-37.

[2]姚方印，朱常香，李廣賢，等. Bt水稻的抗蟲性鑒定及轉(zhuǎn)基因的遺傳分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（2）：142-145.

[3]楊 君，張 艷，王偉巧，等. 海島棉GbHyPRP1 克隆及其轉(zhuǎn)基因擬南芥抗黃萎病驗(yàn)證[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2015，16（3）：594-602.

[4]孟靈真，陳全家，楊 婷，等. 抗除草劑bar基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建與抗性功能的檢測[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（4）：265-268.

[5]孫國清，李雪源，秦文斌，等. 新疆轉(zhuǎn)基因棉花育種研究現(xiàn)狀[J]. 分子植物育種，2004，2（1）：129-132.

[6]王根平，杜文明，夏蘭琴. 植物安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究現(xiàn)狀與展望[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（5）：823-843.

[7]Romeis J，Meissle M，Bigler F. Transgenic crops expressing Bacillus thuringiensis toxins and biological control[J]. Nature Biotechnology，2006，24（1）：63-71.

[8]Tabashnik B E，Sisterson M S，Ellsworth P C，et al. Suppressing resistance to Bt cotton with sterile insect releases[J]. Nature Biotechnology，2010，28（12）：1304-1307.

[9]Cattaneo M G，Yafuso C，Schmidt C，et al. Farm-scale evaluation of the impacts of transgenic cotton on biodiversity，pesticide use，and yield[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（20）：7571-7576.

[10] Kruger M J，van Rensburg J B J，van den Berg J. Perspective on the development of stem borer resistance to Bt maize and refuge compliance at the vaalharts irrigation scheme in South Africa[J]. Crop Protection，2009，28（8）：684-689.

[11]Tabashnik B E，van Rensburg J B J，Carrière Y. Field-evolved insect resistance to Bt crops：definition，theory，and data[J]. Journal of Economic Entomology，2010，102（6）：2011 - 2025.

[12]Storer N P，Babcock J M，Schlenz M，et al. Discovery and characterization of field resistance to Bt maize：Spodoptera frugiperda （Lepidoptera：Noctuidae） in Puerto Rico[J]. Journal of Economic Entomology，2010，103（4）：1031-1038.

[13]Bates S L，Zhao J Z，Roush R T，et al. Insect resistance management in GM crops：past，present and future[J]. Nature Biotechnology，2005，53（1）：57 - 62.

[14]翁 琴. 海島棉（G. barbadense L.）莖尖再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗蟲基因（Bt；SATI）轉(zhuǎn)化研究[D]. 烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[15]周麗容. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)Bt基因海島棉技術(shù)體系的建立及抗蟲性鑒定[D]. 烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[16]符家平，汪 波，劉立軍，等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)Bt基因苧麻的獲得及其抗蟲鑒定[J]. 作物學(xué)報(bào)，2009，35（10）：1771-1777.

[17]王景雪，孫 毅. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，1999，1（1）：7-13.

[18]李 瓊，曲延英，楊 婷，等. 海島棉兩種轉(zhuǎn)Bt基因方法的研究[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2012，24（5）：393-398.

[19]聶新輝，尤春源，陳惠瑜，等. 金標(biāo)Bt-CryIAb/Ac試紙條定性檢測轉(zhuǎn)Bt基因棉花的方法研究[J]. 中國棉花，2013，40（1）：15-17.

[20]寧新民，孔慶平，阿里甫，等. 新疆海島棉抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花的篩選及抗蟲鑒定[C]//中國棉花學(xué)會2009年年會論文匯編. 北京，2009.

[21]沈 平，林克劍，張永軍，等. 轉(zhuǎn)Bt基因棉不同品種殺蟲蛋白季節(jié)性表達(dá)及其對棉鈴蟲的控制作用[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2010，22（5）：393-397.

[22]張永軍，吳孔明，郭予元. 轉(zhuǎn)Bt基因棉花殺蟲蛋白含量的時(shí)空表達(dá)及對棉鈴蟲的毒殺效果[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2001，28（1）：1-6.

[23]王冬梅，李海強(qiáng)，丁瑞豐，等. 新疆北部地區(qū)轉(zhuǎn)Bt基因棉外源殺蟲蛋白表達(dá)時(shí)空動態(tài)研究[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2012，24（1）：18-26.

[24]徐 遙，丁瑞豐，李號賓，等. 轉(zhuǎn)Bt基因棉花國抗62對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響及田間抗蟲效果[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2008，51（2）：222-226.

[25]汪 飛，徐 靜，封紅兵，等. 新疆棉區(qū)轉(zhuǎn)Bt基因棉對棉鈴蟲生物學(xué)的影響[J]. 昆蟲知識，2003，40（2）：131-135.

[26]丁瑞豐，李號賓，劉 建，等. 新疆南部棉區(qū)轉(zhuǎn)Bt基因棉花對棉鈴蟲抗性的季節(jié)性變化規(guī)律[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2012，39（3）：193-199.

[27]李瑞奇，馬峙英，王勤英，等. 轉(zhuǎn)Bt/CpTI基因棉花抗蟲性鑒定與篩選[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2005，6（4）：409-413.

[28]王 峰，張秋平，陳金湘，等. Bt-Cry5Aa 基因轉(zhuǎn)化棉花及其抗蟲性鑒定[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2014，15（4）：877-881.

[29]華鶴良，陳 源，張 祥，等. Bt基因?qū)雽γ藁ㄈ~片生長特征的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（7）：53-55.[HJ1.7mm]

[30]安百偉，趙 亮，狄佳春，等. 陸地棉Bt抗蟲基因類型鑒定與染色體定位[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，32（2）：262-266.

[31]劉劍光，肖松華，狄佳春，等. Bt基因?qū)雽γ藁ㄞr(nóng)藝性狀的影響[J]. 中國棉花，2003，30（3）：15-17.

[32]劉 方，王坤波，宋國立，等. 棉花轉(zhuǎn)基因材料的獲得及主要農(nóng)藝性狀變異分析[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2009，21（1）：23-27.

[33]郭金英，郭旺珍，朱協(xié)飛，等. 轉(zhuǎn)Bt+Sck棉花的分子檢測及其農(nóng)藝性狀分析[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（3）：16-20.

[34]呂淑平，郭小平，趙元明. 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt基因?qū)雽κ荏w材料農(nóng)藝性狀的影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004，20（3）：36-37.

[35]張燕紅，王冬梅，周小云，等. 轉(zhuǎn)Susy基因?qū)γ藁ㄞr(nóng)藝性狀的影響[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，45（1）：61-65.

[36]連麗君，呂素蓮，李汝忠，等. 轉(zhuǎn)BetA/als基因棉花材料的農(nóng)藝性狀考察[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2008，20（6）：447-451.

[37]劉慧君，簡桂良，鄒亞飛. GO基因?qū)雽γ藁ㄞr(nóng)藝性狀及抗病性的影響[J]. 分子植物育種，2003，1（5）：669-672.