崔坤鵬，譚海生，楊勁松*，郗恩光，張萬昌，鞠雪莉，李曉雷，張桂和，鄭元平，蔡錦紅

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228；2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南?？?70228）

香蕉殘次果及香蕉花上乳酸菌的篩選鑒定

崔坤鵬1，譚海生2，楊勁松1*，郗恩光1，張萬昌1，鞠雪莉1，李曉雷1，張桂和1，鄭元平1，蔡錦紅1

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228；2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南?？?70228）

從海南省五指山地區(qū)采集的香蕉殘次果及香蕉花上分離得到12株疑似乳酸菌菌株，通過生理生化特性及分子生物學(xué)鑒定得到4株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），其中從香蕉殘次果上分離得到三株編號為CG1、CG5、CG7，從香蕉花上分離得到一株編號為CH2。對比四株菌的產(chǎn)酸速率曲線和生長曲線，發(fā)現(xiàn)菌株CG1的產(chǎn)酸速率和生長速率均明顯高于其他3株菌（P＜0.05）。

香蕉殘次果；香蕉花；植物乳桿菌；篩選；鑒定

乳酸菌是一類可以發(fā)酵糖類，以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的革蘭氏陽性細菌的統(tǒng)稱，它不是一個分類學(xué)名詞[1]。其具有調(diào)節(jié)胃腸道微生物菌群平衡、抑制病原菌的生長、增強動物的免疫力等生理功效[2]。乳酸菌還能利用青貯飼料中的糖類進行發(fā)酵，主要產(chǎn)物為乳酸和少量乙酸，能提高飼料的營養(yǎng)價值，降低飼料毒性，改善飼料的適口性，延長飼料貯存期等[3]。

海南地區(qū)可利用的土地資源有限，臺風(fēng)等惡劣氣候頻繁，加之近幾年香蕉枯萎病等病蟲害污染加劇，致使香蕉殘次果的數(shù)量持續(xù)增加，香蕉產(chǎn)業(yè)逐漸失去了優(yōu)勢地位[4]。香蕉殘次果具有單寧含量高、果實細小萎縮、含糖量低、難自然成熟等特點，即使經(jīng)催熟處理，商用價值也極低。一直以來，此類殘次果被棄于野外自然腐爛變質(zhì)，既浪費資源又污染環(huán)境[5-6]。近幾年，許多學(xué)者對香蕉莖葉資源的綜合利用進行了深入研究，而對于香蕉殘次果及香蕉花等副產(chǎn)物的研究相對較少。徐紹成[7]從香蕉莖葉中篩選得到一株產(chǎn)酸能力強的植物乳桿菌進行香蕉莖葉的青貯調(diào)制，明顯改善了青貯飼料的品質(zhì)。李志春等[8]從酸菜中分離得到具有耐溫和耐酸特性的乳酸菌并將其添加到香蕉莖葉中，明顯降低了莖葉飼料的單寧含量。馮煥德等[9]結(jié)合國內(nèi)外研究進展闡述了香蕉副產(chǎn)物的營養(yǎng)價值及綜合利用情況。廣東海洋大學(xué)的薛曉寧等[10]以香蕉莖葉為原料，配合不同添加劑發(fā)明出一種發(fā)酵飼料的加工方法。針對以上現(xiàn)狀，本研究從香蕉殘次果及其香蕉花上篩選出優(yōu)良特性的乳酸菌，并對篩選菌株進行生理生化特性及分子生物學(xué)鑒定，將之運用到殘次果青貯飼料的調(diào)制加工中，既可以提高香蕉及其副產(chǎn)物的附加值，又可以避免浪費自然資源，具有十分重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉殘次果與香蕉花：采集于海南省五指山地區(qū)。

營養(yǎng)瓊脂（nutrition agar，NA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：東京日水制藥株式會社；MRS肉湯、MRS固體培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Marker DL2000：北京六合華大基因科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MDF-382E（N）超低溫冰箱：日本三洋電機株式會社；SKP-01電熱恒溫培養(yǎng)箱：湖北省黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司；YM50FGN全自動高壓蒸汽滅菌鍋：上海滬譽貿(mào)易有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺：蘇州佳寶凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-1100紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；PHS-3E型pH計：上海雷磁儀器廠；WD-9403C紫外可見分析儀、DYY-8C型電泳儀：北京市六一儀器廠；A300基因擴增儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品附著微生物的菌群分析

樣品切碎，利用四分法均勻稱取10 g樣品置于90 mL滅菌的生理鹽水中進行10倍梯度稀釋至10-7。選取10-3、10-5、10-7三個不同梯度的樣品稀釋液，分別吸取0.1 mL依次涂布于NA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基上進行好氧細菌、霉菌、酵母菌、乳酸菌菌群的菌落計數(shù)[11]。再選取10-1、10-2兩個梯度稀釋液置于水浴鍋中，水浴條件為：75℃，15 min，水浴后吸取0.1mL涂布于NA培養(yǎng)基進行芽孢桿菌的菌落計數(shù)。

1.3.2 乳酸菌的篩選及形態(tài)學(xué)觀察

從1.3.1制備的稀釋液中選取三個合適的梯度（10-4、10-5、10-6），各吸取0.1 mL涂布于已添加1.5%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫條件下厭氧培養(yǎng)48 h，待菌落長出后，挑選出明顯具有碳酸鈣溶解圈的單個菌落進行分離純化[12]。純化3代后，觀察菌落形態(tài)特征，并對菌株進行革蘭氏染色、油鏡下觀察菌體細胞形態(tài)、接觸酶試驗。將純化好的菌株進行超低溫（-80℃）保藏處理。

1.3.3 乳酸菌生理生化試驗

從純化的菌株中選取具有明顯碳酸鈣溶解圈、革蘭氏染色陽性、接觸酶試驗陰性特征的疑似乳酸菌[13]，進行明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗、葡萄糖產(chǎn)氣試驗、吲哚試驗、產(chǎn)硫化氫試驗、耐溫生長試驗、耐鹽生長試驗以及耐酸生長試驗等來確定乳酸菌屬的分類[14-15]。

1.3.4 乳酸菌碳源發(fā)酵試驗

根據(jù)生理生化試驗鑒定結(jié)果，從中挑選符合乳酸菌生理生化特性的菌株進行單糖、二糖、多糖以及糖苷和糖醇類碳水化合物發(fā)酵試驗來確定乳酸菌種的劃分[16-17]。

1.3.5 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

菌株DNA的提取以及聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增產(chǎn)物的測序委托北京六合華大基因科技有限公司進行鑒定。菌株DNA的提取方法采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法，再利用16S序列通用引物27f和1492R作為上下游引物對菌株的16S rDNA進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增。PCR擴增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)35次，72℃延伸10 min[18]。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在凝膠成像儀中進行觀察。之后對PCR擴增產(chǎn)物進行3730測序。將測序結(jié)果通過美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站的BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性最高的已知菌株進行序列比對分析，通過MEGA 5.1軟件，使用非加權(quán)配對算數(shù)平均法（unweight pair-group methodusing the averageapproach，UPGMA）來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.3.6 優(yōu)質(zhì)特性乳酸菌的篩選

將已鑒定菌株的新鮮菌液按2%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接于MRS肉湯中，進行37℃恒溫培養(yǎng)，每間隔2h取一次發(fā)酵液，測定不同菌株發(fā)酵液的pH值以及在波長620 nm條件下的吸光度值，來分別繪制產(chǎn)酸速率曲線和生長曲線[20]。并從中篩選出產(chǎn)酸量高、產(chǎn)酸速率快、生長能力強的菌株作為青貯飼料調(diào)制加工的優(yōu)良微生物發(fā)酵劑。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

利用EXCEL、DPS15.0、Origin9、MEGA5.1軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品附著微生物菌群分析

對樣品附著的微生物進行菌落計數(shù)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，微生物菌群中好氧細菌數(shù)量最多，乳酸菌和酵母菌次之，霉菌和芽孢桿菌極少。其中乳酸菌的數(shù)量達到103～104CFU/g，并且乳酸菌菌落附近的碳酸鈣溶解圈面積較大，說明菌株的產(chǎn)酸能力較強，有利于后續(xù)乳酸菌的分離篩選。

表1 不同微生物的菌落計數(shù)Table 1 Colony counting of different microorganisms

2.2 乳酸菌篩選結(jié)果及形態(tài)學(xué)觀察

從樣品中分離得到明顯具有碳酸鈣溶解圈、革蘭氏染色顯陽性、接觸酶試驗顯陰性的疑似乳酸菌菌株共12株。其中從香蕉殘次果上篩選出7株，編號為CG1、CG2、CG3、CG4、CG5、CG6、CG7。從香蕉花上篩選出4株，編號為CH1、CH2、CH3、CH4。由表2可知，所分離的菌落特征均為生長狀態(tài)良好、邊緣光滑整齊、中央凸起、乳白或淺乳白色、中小型球形菌落，符合乳酸菌菌落的特征。通過顯微鏡油鏡觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)均為桿狀，并以單桿或聯(lián)對的方式排列，初步判定這12株菌為疑似乳酸菌。

表2 菌株菌落形態(tài)及細胞形態(tài)Table 2 Colony morphology and cell morphology of strains

2.3 生理生化特征

將12株疑似乳酸菌進行生理生化鑒定，結(jié)果見表3。由表3可知，菌株CG1、CG5、CG7、CH2在接觸酶試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、葡萄糖產(chǎn)氣試驗均呈現(xiàn)陰性，并且在10℃、45℃耐溫生長試驗、3.0%NaCl、6.5%NaCl耐鹽生長試驗、pH值為4.0耐酸生長試驗中均呈現(xiàn)陽性[14-15]。初步判斷這4株菌屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），需要進一步通過碳源發(fā)酵試驗來判斷乳酸菌種的劃分。

表3 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains

2.4 碳源發(fā)酵分析

將菌株CG1、CG5、CG7、CH2進行碳源發(fā)酵分析，結(jié)果見表4。由表4可知，香蕉殘次果上篩選的3株菌CG1、CG5、CG7與香蕉花上篩選的菌株CH2在發(fā)酵碳源方面無顯著差異。這4株菌均能完全發(fā)酵大部分碳源，能完全發(fā)酵或微弱發(fā)酵阿拉伯糖、松三糖，微弱發(fā)酵木糖，但均不能發(fā)酵鼠李糖。結(jié)合乳酸菌分類鑒定的相關(guān)文獻[13-14]，將CG1、CG5、CG7、CH2 4株菌初步鑒定為植物乳桿菌，但還需要進一步通過分子生物學(xué)鑒定來確定最終的種類劃分。

表4 菌株碳源發(fā)酵試驗結(jié)果Table4 Results of carbon sources fermentation experiments of strains

2.5 分子生物學(xué)鑒定

2.5.1 菌株16S rDNA PCR擴增結(jié)果

圖1 菌株16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification products of strains

將四株菌的16S rDNA序列通過PCR擴增后進行電泳檢測，電泳條件：3 μL樣品+1%瓊脂糖凝膠[21]。圖中Marker條帶由下而上的大小依次為：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp。檢測結(jié)果如圖1所示，4株菌PCR擴增片段長度均約為1 500 bp，說明PCR擴增成功，可以進行3730測序。

2.5.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將4株菌16S rDNA序列的測序結(jié)果利用NCBI網(wǎng)站的BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫的標準菌株進行同源性比對，從中選擇幾株與測試菌株同源性比對最高的菌株，通過MEGA5.1軟件，以UPGMA方法，將bootstraps值設(shè)定為1 000進行統(tǒng)計學(xué)重復(fù)檢驗來制作系統(tǒng)發(fā)育樹[22]，結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains

由圖2可知，4株菌中菌株CG1的BLAST結(jié)果顯示，其與Lactobacillus plantarumSCP 49和Lactobacillus plantarum SCP 53兩個標準菌株的同源性比對均為99%，結(jié)合其生理生化特性鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。CG5、CG7、CH2三株菌均與其對應(yīng)的標準菌株的同源性達到99%及以上，均鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum），進一步確認了分離出的乳酸菌的分類地位及其系統(tǒng)發(fā)育地位。

2.6 優(yōu)質(zhì)特性乳酸菌的篩選

對4株乳酸菌的產(chǎn)酸速率曲線和生長曲線進行測定，結(jié)果分別見圖3及圖4。由圖3可知，4株乳酸菌從第4小時開始產(chǎn)酸量迅速增加，pH值下降明顯，18 h左右逐步趨于穩(wěn)定，平均pH值降至3.5～3.7，其中菌株CG1的pH值下降最明顯，發(fā)酵后期的最終pH值也是最低，說明其產(chǎn)酸能力優(yōu)于另外三株菌。結(jié)合圖4的生長曲線可以看出，4株菌在4h后開始進入指數(shù)生長期，其中菌株CG1在4 h后的生長速度就明顯高于另外三株菌，說明它的適應(yīng)期相對較短，而且在整個指數(shù)生長期都呈現(xiàn)出快速生長的趨勢。綜合產(chǎn)酸速率曲線和生長曲線的對比結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌株CG1具有產(chǎn)酸能力強、產(chǎn)酸量高、生長速度快的優(yōu)質(zhì)特性，非常適合作為青貯飼料調(diào)制加工所使用的微生物發(fā)酵劑。

圖3 菌株產(chǎn)酸曲線Fig.3 Acid production curve of strains

圖4 菌株生長曲線Fig.4 Growth curves of strains

3 結(jié)論

以海南省五指山地區(qū)采集的香蕉殘次果和香蕉花為原料，以傳統(tǒng)分離方法得到12株桿狀的革蘭氏陽性菌。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性以及16S rDNA序列分析最終得到4株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。其中3株菌來源于香蕉殘次果，其編號分別為CG1、CG5、CG7，另外1株菌來源于香蕉花，編號為CH2。

通過對4株乳酸菌產(chǎn)酸速率和生長速率的測定，發(fā)現(xiàn)菌株CG1具有產(chǎn)酸量高、產(chǎn)酸速度快、生長能力強、適應(yīng)期短、可發(fā)酵多種碳源等優(yōu)勢，同時也具備耐高溫、耐干旱等海南熱帶特征。綜上所述，植物乳桿菌CG1非常適合用作香蕉殘次果青貯飼料調(diào)制加工的優(yōu)良微生物發(fā)酵劑。

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Screening and identification of lactic acid bacteria from defective banana fruit and banana flower

CUI Kunpeng1,TAN Haisheng2,YANG Jinsong1*,XI Enguang1,ZHANG Wanchang1,JU Xueli1,LI Xiaolei1,ZHANG Guihe1, ZHENG Yuanping1,CAI Jinhong1
(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China; 2.College of Materials and Chemical Engineering,Hainan University,Haikou 570228,China)

The 12 strains of suspected lactic acid bacteria were isolated from defective banana fruit and banana flower collected in Wuzhishan region of Hainan province.According to the physiological and biochemical characteristics and molecular biological identification,four strains were identified asLactobacillus plantarum,in which three strains CG1,CG5 and CG7 were isolated from the defective banana fruit and the strain CH2 was isolated from banana flower.Comparing the acid-production rate curve and the growth curve of four strains,results showed that the acid-production rate and growth rate of strain CG1 were obviously higher than other three strains(P＜0.05).

defective banana fruit;banana flower;Lactobacillus plantarum;screening;identification

TS201.3

0254-5071（2017）07-0053-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.012

2017-04-28

國家自然科學(xué)基金資助項目（31460621）

崔坤鵬（1992-），男，碩士研究生，研究方向為食品生物工程。

*通訊作者：楊勁松（1966-），女，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)及食品微生物，農(nóng)產(chǎn)品貯藏及加工。