王磊，張潔，趙國忠*

（1.天津市食品安全檢測技術(shù)研究院，天津300308；2.天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津300457；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

東北酸菜優(yōu)良乳酸菌篩選及其抑菌特性研究

王磊1，張潔1，趙國忠2，3*

（1.天津市食品安全檢測技術(shù)研究院，天津300308；2.天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津300457；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

該實驗從東北酸菜中分離純化并鑒定出40種乳酸菌，主要為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）。通過測定乳酸菌乳酸產(chǎn)量及其抑制大腸桿菌（Escherichia coli）的能力，探究乳酸菌的產(chǎn)酸量與其抑菌作用之間相互關(guān)系。結(jié)果表明，菌株C1、E8、A5產(chǎn)酸能力較強，發(fā)酵12 h后發(fā)酵上清液中乳酸質(zhì)量濃度＞12 g/L，抑菌圈直徑＞12 mm，對大腸桿菌抑制能力強。表明東北酸菜中乳酸菌的產(chǎn)酸量與抑菌作用存在緊密的聯(lián)系。

東北酸菜；乳酸菌；篩選；產(chǎn)酸量；抑菌特性

酸菜是一種歷史悠久且味道鮮美的發(fā)酵蔬菜食品。東北酸菜作為發(fā)酵蔬菜中最具特色的一種，對東北乃至全國都具有重要影響。東北酸菜采用東北當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的大白菜腌制而成，極具東北地方特色，色澤靚麗，柔軟上口，吃起來酸爽可口，讓人不忍釋懷[1]。東北酸菜因其具有酸爽可口、鮮咸開胃、脆嫩解膩并能助消化等特點而深受東北人民喜愛，其不僅口味絕佳，而且具有驅(qū)寒、開胃、消食等功能。東北酸菜在我國已發(fā)展傳承千年之久，但真正的發(fā)展還是在建國之后，特別是在最近十幾年以來。酸菜的發(fā)展歷程主要有三個階段，分別為傳統(tǒng)家庭壇裝自釀發(fā)酵蔬菜、作坊式自然發(fā)酵酸菜、引進(jìn)高新技術(shù)的新型冷鏈型酸菜[2]。酸菜的研究主要集中在發(fā)酵機理、菌種選育、化學(xué)成分、風(fēng)味物質(zhì)等方面。

目前，東北酸菜的發(fā)展仍然存在著各種各樣的問題。其中，機械化程度高的企業(yè)對于酸菜品質(zhì)的控制最為擔(dān)憂。研究酸菜發(fā)酵微生物對于酸菜品質(zhì)的提升具有一定的現(xiàn)實意義。乳酸菌在酸菜中發(fā)揮著極其重要的作用，是酸菜營養(yǎng)和風(fēng)味的主要來源，乳酸菌的發(fā)酵性能直接影響酸菜的品質(zhì)，對于提高酸菜的營養(yǎng)價值極為重要[3-4]。酸菜中的特殊風(fēng)味大部分來自于乳酸菌，乳酸菌對于酸菜的作用不言而喻[5]?？梢哉f，只有研究明白了乳酸菌，才能對酸菜有更為深入地了解，也才能更好地傳承這項傳統(tǒng)工藝。本研究主要篩選東北酸菜的優(yōu)良發(fā)酵微生物，并探究了優(yōu)良乳酸菌對大腸桿菌的抑菌能力，為后期工業(yè)化生產(chǎn)奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北酸菜：采自東北，為家庭自制。乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%）：德國DRE公司；實驗所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922：由河南科技大學(xué)陳俊亮副教授所贈。

MRS培養(yǎng)基[6-7]：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，瓊脂18 g/L，pH 6.2～6.6。115℃滅菌30 min。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.2～7.6。115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S12恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；DM 2000熒光顯微鏡：萊卡儀器（德國）有限公司；FE-20精密pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀：美國伯樂BIO-RAD公司；1525型高效液相色譜儀：美國沃特斯公司；SP-250生化培養(yǎng)箱：南京實驗儀器廠；MLS-3750立式壓力蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；ZHJH-C1115B超凈工作臺：上海智誠分析儀器制造有限公司；UV1800紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株分離純化

用生理鹽水將東北酸菜汁液進(jìn)行梯度稀釋，并取100μL稀釋液涂布于MRS平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，觀察長出的單菌落，挑取形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行平板劃線分離，以達(dá)到分離純化的目的。劃線培養(yǎng)進(jìn)行2～3次，以確保菌株的純度。三次分離純化之后，對菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并確定菌株形態(tài)，將鏡檢后的菌株接種于MRS液體管中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后于MRS斜面培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，于4℃冰箱保存，備用。

1.3.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

將菌株活化后，進(jìn)行乳酸菌基因組的提取[8]。提取步驟：①取菌體，培養(yǎng)12 h以上，1 mL至1.5 mL EP管，10 000 r/min離心2min，棄上清得菌體。②加入1mL無菌水吹洗菌體后，10 000 r/min離心2 min，棄上清。③加入200 μL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）裂解液80℃水浴30 min。④加入酚-氯仿200μL于菌體裂解液中。⑤加入400μL冰乙醇于200 μL上清液中，-20℃靜置超過30 min，12 000 r/min離心5～10 min，棄上清。⑥加入500 μL體積分?jǐn)?shù)為70%冰乙醇重懸沉淀，12 000 r/min離心1～3 min，棄上清。⑦60℃烘箱烘干少于1 min，不能過干。⑧50 μL超純水重溶沉淀以備聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。

PCR擴增16S rDNA片段[9]，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10× buffer 5 μL；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）5 μL；上游引物（25 μmol/L）0.5 μL；下游引物（25μmol/L）0.5μL；TaqDNA聚合酶（250U）0.5μL；DNA模板1.5μL；超純水37μL。PCR擴增條件：95℃、1min；95℃、10s；55℃、30s；72℃、30s；72℃、5min；2-4步進(jìn)行35個循環(huán)。上游引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′，下游引物序列：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴增后送生工生物工程（上海）有限公司測序，將測序結(jié)果使用BLAST在GeneBank中進(jìn)行搜索和相似性比對，對菌株進(jìn)行種屬鑒定。目前建議的16SrDNA序列分析標(biāo)準(zhǔn)是97%～99%相似者，定為同一個屬，99%～100%全序列相似性的細(xì)菌，則判定為同一個種。

1.3.3 乳酸產(chǎn)量測定

采用高效液相色譜法測定乳酸含量[10-11]。具體步驟：①樣品處理。用移液管準(zhǔn)確吸取5.00 mL試樣于10 mL容量瓶中，加入1 mol/L磷酸0.2 mL，用重蒸水定容，混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。②配制溶液。流動相：0.01 mol/L磷酸氫二銨，用1 mol/L磷酸滴定調(diào)至pH=2.7，真空過濾、超聲脫氣備用。10%的甲醇：10 mL超純水和90 mL甲醇混合，過濾，超聲脫氣。③配制乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取1.014 2 g乳酸標(biāo)品置于100 mL容量瓶中，用三蒸水定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為10.142g/L的乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，并過0.45μm微孔纖維素濾膜。④開機并設(shè)置高效液相色譜儀。a.設(shè)定B泵流量0.4 mL/min，變化率設(shè)1～2 min。b.待泵流量穩(wěn)定之后，用甲醇或10%甲醇沖洗平衡1 h以上，再用流動相磷酸氫二銨平衡。c.待流動相基線平穩(wěn)后，點擊手動進(jìn)樣，然后依次進(jìn)樣獲得曲線。d.樣品洗脫完后，用流動相清洗XSelect HSS T3色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）30 min，再用甲醇洗1 h以上，最后關(guān)閉儀器。⑤繪制乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL、7.00 mL、8.00 mL、9.00 mL、10.00 mL，加入0.2 mL 1 mol/L磷酸，用超濾水稀釋至10 mL混勻后進(jìn)樣。進(jìn)樣在20 μL左右，于波長210 nm處測量峰面積。以乳酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）的均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=106x+2×106，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 37。⑥結(jié)果計算。按照回歸方程計算樣品中乳酸含量。

1.3.4 抑菌能力測定

將篩選的乳酸菌用于對大腸桿菌抑菌能力測定：將已滅菌的素瓊脂約10mL倒入平皿內(nèi)，凝固后后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱至完全融化，待培養(yǎng)基溫度降至不燙手后，加入大腸桿菌，搖勻，倒在培養(yǎng)皿（每皿20 mL）內(nèi)，待其凝固。在無菌環(huán)境下，在培養(yǎng)基表面垂直放上牛津杯（高10 mm、內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm的圓形小管），輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。在杯中加入200 μL待檢樣品（發(fā)酵液），注意勿使其外溢。加滿后置37℃條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果，抑菌圈的大小使用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及形態(tài)特征

將酸菜汁樣品進(jìn)行梯度稀釋和平板涂布后，獲得不同形態(tài)的單菌落，挑取形態(tài)差別較大的菌落共進(jìn)行劃線分離。選擇8個平板上形態(tài)差異較大的菌株。每個平板用A、B、C、D、E、F、G、H字母表示，共挑選了74株進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。將分離純化后的菌株接種到MRS固體培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，再挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色后用油鏡觀察菌體形態(tài)。其中，大多數(shù)菌株的菌體呈現(xiàn)桿狀，但仍有一些菌體呈球狀，以單個或者短鏈狀排列代表菌株的菌落和菌體細(xì)胞形態(tài)。由圖1A可知，菌株C9菌落在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出凸透鏡的形狀，菌落直徑在1.0～2.0 mm左右，圓形、邊緣光滑、乳白色。由圖1B可知，菌株C9的菌體細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色結(jié)果為陽性。

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

挑選革蘭氏染色結(jié)果呈紫色的40株菌進(jìn)行生理生化鑒定。結(jié)果表明，所有菌株過氧化氫反應(yīng)為陰性。除了菌株D2、E8、H10發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)CO2，其他菌株發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣。糖發(fā)酵實驗：菌株D6、G2不發(fā)酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉子糖和木糖；菌株D2、E8、H10不發(fā)酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉子糖，但可發(fā)酵木糖；其他菌株可發(fā)酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉子糖和木糖。

圖1 菌株C9菌落形態(tài)(A)及革蘭氏染色結(jié)果(B)Fig.1 Colonial morphology(A)and gram straining results(B)of strain C9

2.3 分子生物學(xué)鑒定

將革蘭氏染色呈陽性的40株菌，提取出菌株基因組之后，將得到的樣品送測序分析，序列結(jié)果使用BLAST在GeneBank中進(jìn)行搜索和相似性比對，得到的菌株鑒定結(jié)果見表1。

表140 株乳酸菌鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of 40 stains of lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌產(chǎn)乳酸能力測定

酸菜在發(fā)酵的過程中，乳酸菌經(jīng)過三羧酸循環(huán)和無氧呼吸等生理過程會發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸等各種有機酸，其中乳酸為其中主要的酸性物質(zhì)，因此其產(chǎn)酸能力也以產(chǎn)乳酸能力為主。酸的產(chǎn)生不僅可以給酸菜帶來更好的風(fēng)味，而且能有效抑制腐敗菌的生長。根據(jù)發(fā)酵總酸含量的比較，挑選產(chǎn)酸量較高的20株乳酸菌。并采用高效液相色譜法測量這20株乳酸菌發(fā)酵上清液中的乳酸含量，乳酸標(biāo)準(zhǔn)品及代表菌株D2發(fā)酵上清液的高效液相色譜圖見圖2，檢測結(jié)果表2。

圖2 乳酸標(biāo)準(zhǔn)液(A)和菌株D2發(fā)酵上清液(B)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of lactic acid standard solution(A)and fermented supernatant fluid of strain D2(B)

表220 株乳酸菌產(chǎn)酸情況Table 2 Acid production of 20 strains of lactic acid bacteria

2.5 乳酸菌抑菌能力測定

采用牛津杯法，測定20株乳酸菌對大腸桿菌ATCC25922的抑菌能力，其中抑菌效果最好的為菌株D6、E5、C1，結(jié)果見圖3。牛津杯周圍存在一條明顯的透明圈，表明乳酸菌發(fā)酵上清液中存在抑制大腸桿菌生長的物質(zhì)。而菌株E5、C1抑菌圈較大，表明這兩株菌抑制大腸桿菌的能力較強，相比而言菌株D6則較弱。20株乳酸菌對大腸桿菌抑菌情況結(jié)果見表3。

圖33 株乳酸菌抑制大腸桿菌效果Fig.3 Antibacterial effect of three strains of lactic acid bacteria onE.coli

表320 株乳酸菌的抑菌圈直徑比較Table 3 Comparison of antibacterial circle diameter of 20 strains of lactic acid bacteria

產(chǎn)乳酸能力與抑菌能力比較分析后可知，隨著乳酸菌產(chǎn)酸能力的減弱，抑菌圈直徑逐漸變小。分析原因主要是由于加入牛津杯中的不同菌株的發(fā)酵上清液中包括乳酸，乙酸等物質(zhì)的含量不同，從而對致病菌的抑制作用產(chǎn)生差異，如果所含有的抑菌物質(zhì)較高，則抑菌圈越大。不同的乳酸菌對不同致病菌敏感程度也不同[13]。本研究中，產(chǎn)酸能力最強的菌株C1抑菌圈直徑接近15 mm，產(chǎn)酸能力較弱的菌株F11抑菌圈直徑不到8 mm，抑菌圈隨著產(chǎn)酸能力的削減而呈現(xiàn)下降的趨勢。但同時應(yīng)該看到有部分菌株并不符合這個趨勢，這可能是由于這些菌株產(chǎn)乳酸菌素等物質(zhì)造成[14]。吳海波等[15]對不同地域發(fā)酵蔬菜分離的乳酸菌抑菌效果做的研究也表明乳酸菌在生長代謝過程中可以產(chǎn)生包括乳酸在內(nèi)的過氧化氫、雙乙酰、細(xì)菌素等多種天然抑菌物質(zhì)同樣可以對腐敗菌產(chǎn)生抑制作用。

3 結(jié)論

本研究以東北酸菜為研究對象，分離篩選不同東北農(nóng)家自制酸菜的有益微生物。從自然發(fā)酵酸菜中分離出40株乳酸菌。比較并分析了其產(chǎn)乳酸及抑菌能力的關(guān)系。結(jié)果表明，菌株C1（Lactobacillusplantarum）、E8（Weissellacibaria）、A5（Lactobacillus plantarum）菌株的產(chǎn)酸能力較強，抑菌大腸桿菌能力較強。同時也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)乳酸能力差的菌株，如菌株C5（Lactobacillus plantarum）、F11（Lactobacillus plantarum）抑菌能力也較差。另外，還有一些菌由于產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物的原因，其產(chǎn)酸量不高，但是抑菌能力相對較強，存在一定差異。由此可見，東北酸菜中的益生菌主要是植物乳桿菌，其在東北酸菜的發(fā)酵過程中起重要的作用，可以抑制雜菌污染，保證酸菜品質(zhì)。

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Screening and antibacterial property of superior lactic acid bacteria from pickled Chinese cabbage in Northeast of China

WANG Lei1,ZHANG Jie1,ZHAO Guozhong2,3*
(1.Tianjin Institute of Food Safety Inspection Technology,Tianjin 300308;2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457;3.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

40 strains of lactic acid bacteria were isolated,purified and identified,includingLactobacillus plantarum,Weissella confuse,Lactobacillus paracasei,Lactobacillus caseiandWeissella cibaria.By determination of lactic acid production and the ability to inhibitEscherichia coli,the relationship between acid production and antimicrobial activity of lactic acid bacteria was investigated.The results showed that the acid-producing ability of strains C1,E8 and A5 was stronger than other strains.After fermentation for 12 h,the lactic acid content in fermented supernatant fluid was more than 12 g/L,the diameter of inhibition zone was more than 12 mm and it had stronger ability to inhibitE.coli.The results indicated that the acid production of lactic acid bacteria in pickled Chinese cabbage in Northeast of China had a close relationship with antimicrobial activity.

pickled Chinese cabbage in Northeast of China;lactic acid bacteria;screening;acid production;antibacterial property

TS255.54

0254-5071（2017）07-0048-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.011

2017-04-11

國家自然科學(xué)基金青年項目（31401682）；江蘇省科技計劃項目青年基金（BK20140146）

王磊（1984-），男，助理工程師，本科，研究方向為食品微生物檢測。

*通訊作者：趙國忠（1983-），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物學(xué)。