曾承露，李鋒*，黃德娜

（黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州都勻558000）

鹽酸菜中降膽固醇、亞硝酸鹽乳酸菌篩選及功能特性研究

曾承露，李鋒*，黃德娜

（黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州都勻558000）

以獨(dú)山傳統(tǒng)工藝制作鹽酸菜液為研究對象，運(yùn)用涂布法分離純化乳酸菌。采用生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)法，鑒定菌株Y-12為棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）。運(yùn)用比色法測定其對膽固醇和亞硝酸鹽清除能力，該菌株對膽固醇和亞硝酸鹽的降解率分別為78.15%和75.17%。對菌株Y-12進(jìn)行耐酸、耐鹽和耐膽鹽試驗(yàn)研究，結(jié)果表明，菌株Y-12在pH值為≥2.5的酸性環(huán)境中能正常生長，能夠耐受5%NaCl和0.3%膽鹽。

棉籽糖乳球菌；膽固醇；亞硝酸鹽；乳酸菌

獨(dú)山鹽酸菜是布依族以獨(dú)特傳統(tǒng)制作工藝?yán)蠅匀话l(fā)酵而成的蔬菜食品。因其香氣撲鼻，色澤鮮艷，口感酸中有辣，辣中有甜，甜中有咸，風(fēng)味獨(dú)特而深受喜愛。但傳統(tǒng)腌制工藝存在品質(zhì)難以控制、發(fā)酵周期長等缺點(diǎn)，不利于規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。目前，國外發(fā)酵蔬菜行業(yè)利用人工接種發(fā)酵控制產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，取得較好進(jìn)展[1]。傳統(tǒng)鹽酸菜發(fā)酵過程中起主要作用的功能菌是乳酸菌，因此本研究計(jì)劃從鹽酸菜中篩選優(yōu)良功能乳酸菌進(jìn)行純培養(yǎng)，解決傳統(tǒng)制作工藝發(fā)酵周期長等弊端。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌除了可以提高食品營養(yǎng)價(jià)值和改善風(fēng)味，其還具有特殊生理活性和營養(yǎng)功能，如調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)平衡[2-3]，清除人體自由基，還可以降低食物和人體血清膽固醇含量，從而降低心腦血管發(fā)病幾率[4-7]。此外，發(fā)酵蔬菜在腌制過程中會產(chǎn)生亞硝酸鹽，長期食用高含量亞硝酸鹽食品會給人們的健康帶來眾多問題。但有相關(guān)研究表明，乳酸菌在生長代謝過程中可以降解亞硝酸鹽，從而來保證食品質(zhì)量與安全[8-10]。由此可見，篩選優(yōu)良功能乳酸菌并研究其代謝特性是一項(xiàng)非常有應(yīng)用價(jià)值的研究工作。

本研究旨在從獨(dú)山鹽酸菜中篩選出具有降膽固醇和亞硝酸鹽的優(yōu)良功能特性的乳酸菌，利用分子生物學(xué)對其進(jìn)行鑒定，并研究其降膽固醇及亞硝酸鹽的能力等，以期將其作為接種劑進(jìn)行鹽酸菜發(fā)酵研究及潛在的直投式發(fā)酵劑工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸菜：獨(dú)山農(nóng)戶采用傳統(tǒng)工藝方法制作的3份自然發(fā)酵不同口味（酸辣、爽辣和酸甜）鹽酸菜。

MRS培養(yǎng)基和CaCO3-MRS培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[11]配制；牛膽鹽（生化試劑）、膽固醇、鄰苯二甲醛、鹽酸萘乙二胺（均為分析純）、亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑、Ezup柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA）試劑盒、瓊脂糖、通用引物：上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750高溫蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；5804R小型臺式離心機(jī)：德國Eppendoff公司；730R回轉(zhuǎn)式振蕩恒溫培養(yǎng)箱：美國APlus公司；FE-20KpH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-20型超凈工作臺：蘇州華科凈化設(shè)備有限公司；MyCycler PCR儀：美國Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；DYY-6D電泳儀：北京六一生物科技有限公司；WGD-30S凝膠成像儀：韓國Wisd公司；UV-1200紫外分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；DM2500徠卡生物熒光顯微鏡：德國徠卡公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離及篩選

鹽酸菜汁液經(jīng)無菌生理鹽水稀釋10-1～10-4后吸取100 μL涂布于CaCO3-MRS培養(yǎng)皿中，30℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察培養(yǎng)基中菌落形狀、顏色、表面光滑度等，挑取產(chǎn)生溶鈣圈較大的單菌落繼續(xù)分離純化。單菌落經(jīng)3次分離純化后進(jìn)行革蘭氏染色，對革蘭氏陽性菌和觸酶陰性菌進(jìn)一步研究[12-13]，并用20%甘油保藏于-80℃冰箱。

1.3.2 生理生化特征鑒定

根據(jù)菌株的表型特征和革蘭氏染色結(jié)果，并通過淀粉水解實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)等，參照《乳酸細(xì)菌分離鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[14]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[15]中描述的反應(yīng)特征，鑒定菌株分類學(xué)地位。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌DNA提取采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA試劑盒，按照說明書操作進(jìn)行提取，并以此基因組為模板，對其進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增。正向引物27F：5-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3，反向引物1492R：5-GGTTACCTT GTTACGACTT-3。

PCR反應(yīng)體系（50μL）：模板1μL，10×PCR緩沖液5μL，Mg2+3μL，dNTP（25mmol/L）1μL，引物（10mmol/L）1μL，Taq酶0.5μL，超純水37.5μL。PCR反應(yīng)程序：94.0℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)29次；72℃延伸7 min；4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL左右的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳及凝膠成像檢測。

細(xì)菌PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定菌株的菌屬，再經(jīng)MEGA5.05軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定其分類學(xué)地位。

1.3.4 乳酸菌降解膽固醇性能測定

降膽固醇能力測定參照文獻(xiàn)[16]報(bào)道的鄰苯二甲醛法，以膽固醇質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.004 657x+0.001 86，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。以接種量2%（V/V）將菌株接種于含有100 μg/mL膽固醇的MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)時(shí)間為12h、24h、36h、42h、48h時(shí)取樣，在波長550nm處測定殘余膽固醇吸光度值，代入膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算剩余膽固醇含量和降解率。降解率計(jì)算公式如下：

式中：A0為培養(yǎng)基膽固醇初始質(zhì)量濃度，μg/mL；A1為發(fā)酵后殘余膽固醇質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.3.5 乳酸菌降解亞硝酸鹽性能測定

降亞硝酸鹽能力測定參照國標(biāo)GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽》中規(guī)定的鹽酸萘乙二胺法[17]，以亞硝酸鹽質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.805x+0.044 602，相關(guān)系數(shù)R2=0.995，以接種量為2%（V/V）接種于含有10 mg/L亞硝酸鈉的MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)時(shí)間為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h時(shí)取樣，在波長538 nm處測殘余亞硝酸鹽吸光度值，代入亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算剩余亞硝酸鹽含量和降解率。降解率計(jì)算公式如下：

式中：B0為培養(yǎng)基亞硝酸鹽初始質(zhì)量濃度，mg/L；B1為發(fā)酵后殘余亞硝酸鹽質(zhì)量濃度，mg/L。

1.3.6 乳酸菌耐酸性能測定

將2%（V/V）菌種接種于pH值為1.5、2.5、3.5、4.5的MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h，每隔3 h取樣在波長600 nm處測定吸光度值，吸光度值越大，表明菌體生物量越大。考察菌株在不同pH值培養(yǎng)基中的生長情況。

1.3.7 乳酸菌耐鹽性能測定

將菌種以2%（V/V）接種量接種于添加2%、4%、5%、6%、8%NaCl的MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h，每隔3 h取樣在波長600 nm處測定吸光度值，考察菌株在不同鹽濃度培養(yǎng)基的生長情況。

1.3.8 乳酸菌耐膽鹽性能測定

將菌種以2%（V/V）接種量分別接種于添加含0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h，每隔3 h取樣在波長600 nm處測定吸光度值，考察菌株在不同膽鹽含量培養(yǎng)基的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及菌體特征

圖1 菌株Y-12菌落形態(tài)（左）及顯微形態(tài)（右）Fig.1 Colonial morphology(left)and microscopic observation(right) of strain Y-12

通過劃線純化培養(yǎng)，從鹽酸菜汁液中分離得到27株菌，選取在CaCO3-MRS培養(yǎng)基上溶鈣圈較大的菌株Y-12，觀察菌株生長顏色、大小及菌落形態(tài)并進(jìn)行顯微鏡觀察，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株呈現(xiàn)乳白色、圓形、表面光滑圓潤，不透明，邊緣整齊。革蘭氏染色為陽性，顯微鏡下觀察菌體呈球狀。

2.2 生理生化特征

菌株Y-12生理生化試驗(yàn)檢測結(jié)果見表1。由表1可知，菌株Y-12接觸酶反應(yīng)、淀粉水解、吲哚產(chǎn)生、H2S產(chǎn)生和明膠液化試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，石蕊牛奶和V-P試驗(yàn)結(jié)果呈陽性，可以利用葡萄糖、纖維二糖和棉籽糖等碳水化合物，查閱《乳酸菌分類鑒定手冊》初步判斷菌株Y-12為乳球菌屬（Lactococcussp.）。

表1 菌株Y-12的生理生化特性檢測結(jié)果Table 1 Detection results of physiological and biochemical characteristics of stain Y-12

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 菌株Y-12的16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification products of 16S rRNA gene sequence of strain Y-12

將細(xì)菌基因組進(jìn)行16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，PCR擴(kuò)增后目的片段在1 500 bp處有特異性條帶并且無拖尾現(xiàn)象，陰性對照（2泳道）無條帶，說明PCR擴(kuò)增效果好，可滿足測序要求。

2.3.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

將PCR擴(kuò)增序列提交到NCBI，通過Blast工具的Nucleotide collection（nr/nt）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，選取同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，菌株Y-12與棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）系統(tǒng)位置最為接近，同源性達(dá)到99%。結(jié)合菌株的菌落形態(tài)、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析，菌株Y-12被鑒定為棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）。

圖3 菌株Y-12 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain Y-12

2.4 菌株Y-12功能特性

2.4.1 降膽固醇特性

圖4 菌株Y-12降解膽固醇能力Fig.4 The cholesterol-degrading ability of strain Y-12

考察菌株Y-12的降膽固醇能力，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，膽固醇降解率逐漸增高；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為36 h時(shí)，膽固醇降解率達(dá)到75.98%，繼續(xù)培養(yǎng)，膽固醇降解率趨于平穩(wěn)，這可能是因?yàn)槿榍蚓L處于穩(wěn)定期，菌體代謝活力較強(qiáng)，因此降解率較高，最高達(dá)到78.15%。與已報(bào)道高達(dá)92.28%的乳球菌[6]相比，降解率偏低，但與大部分乳酸菌[11]（降解膽固醇能力最高的菌株SR10降解率為33.64%）相比，該菌株的降解膽固醇能力較高，表明菌株Y-12具有優(yōu)良的膽固醇降解特性。

2.4.2 降亞硝酸鹽特性

亞硝酸鹽會在蔬菜發(fā)酵過程中產(chǎn)生，食量超標(biāo)會對身體健康帶來危害[19]。因此，清除或者降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸含量是較為有效的控制手段。考察菌株Y-12的降亞硝酸鹽能力，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，菌株Y-12的亞硝酸鹽降解率隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸增大。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)，亞硝酸鹽降解率達(dá)到74.25%，繼續(xù)延長培養(yǎng)時(shí)間，降解率增長趨于平緩，72 h時(shí)達(dá)到75.17%；與已報(bào)道的乳酸菌[6]的亞硝酸鹽降解率（20%～90%）相比，表明菌株Y-12具有較高的亞硝酸鹽降解能力。

圖5 菌株Y-12降解亞硝酸鹽能力Fig.5 Nitrite degrading ability of strain Y-12

2.4.3 耐酸特性

圖6 不同pH條件下菌株Y-12的生長情況Fig.6 Growth situation of strain Y-12 in the condition of different pH

通常情況下，人體胃中的pH值一般在0.9～1.5范圍內(nèi)波動，進(jìn)食后一般會上升到3.0～4.0左右[20]?？疾炀闥-12在不同pH值培養(yǎng)基中的生長情況，結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著pH值的增加，菌液吸光度值呈上升趨勢，說明菌體生物量也逐漸增加。培養(yǎng)基pH為2.5時(shí)，前6 h菌體生物量變化不大，6 h之后，菌體量開始增長，說明乳球菌的酸耐受反應(yīng)系統(tǒng)在酸性環(huán)境被誘導(dǎo)激發(fā)，菌體得到存活能力。當(dāng)pH為1.5時(shí)，菌體生物量始終處于最低水平，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長基本沒有發(fā)生變化，乳球菌生長明顯受到抑制。綜上所述，菌株Y-12具有一定的耐酸能力。

2.4.4 耐鹽特性

考察不同鹽含量對菌株Y-12生長情況的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著培養(yǎng)基中NaCl含量不斷升高，菌液吸光度值在逐漸減小。在NaCl含量為2%～5%時(shí)，菌株Y-12的生長代謝影響不大，菌液吸光度值為0.537～0.982，鹽含量越低，生長趨勢越好。當(dāng)NaCl含量上升到6%和8%時(shí)，培養(yǎng)12 h后，菌液吸光度值基本沒有發(fā)生變化，表明菌株Y-12的生長受到抑制。由此可見，菌株Y-12在NaCl含量為5%以下時(shí)，具有一定耐受力。

圖7 不同鹽含量下菌株Y-12生長情況Fig.7 Growth situation of strain Y-12 in the condition of different salt concentration

2.4.5 耐膽鹽特性

圖8 不同膽鹽濃度下菌株Y-12生長情況Fig.8 Growth situation of strain Y-12 in the condition of different bile salt concentration

人體小腸中膽鹽含量正常值在0.03%～0.30%之間，乳酸菌必須具備較強(qiáng)膽鹽耐受性，才能在此環(huán)境下正常生長繁殖，發(fā)揮其功能作用[21]?？疾炀闥-12在不同含量膽鹽含量培養(yǎng)基中的生長情況，結(jié)果見圖8。由圖8可知，隨著膽鹽濃度升高，菌液吸光度值呈下降趨勢。當(dāng)膽鹽含量為0.3%時(shí)，培養(yǎng)6 h后，OD600nm值才開始發(fā)生變化，可能是菌株逐漸產(chǎn)生了耐受性而繼續(xù)生長?？紤]到正常人體小腸膽鹽含量最高為0.3%，故不繼續(xù)考察高濃度膽鹽耐受性。關(guān)于乳酸菌耐膽鹽相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)大部分乳酸菌能夠耐受0.2%～0.4%的膽鹽濃度[22]。在小腸正常膽汁濃度下，菌株Y-12具有良好抗膽汁能力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以獨(dú)山自然發(fā)酵鹽酸菜為原料，篩選到一株降解膽固醇和亞硝酸鹽乳酸菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，菌株Y-12為棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）。通過比色法測定菌株Y-12的膽固醇降解能力和亞硝酸鹽清除能力分別為78.15%和75.17%。對菌株Y-12的耐受性進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)菌株Y-12在pH值為2.5的酸性環(huán)境和0.3%膽鹽環(huán)境中能夠正常生長；在NaCl含量為5%以下，其生長不受抑制。本實(shí)驗(yàn)的乳球菌篩自蔬菜發(fā)酵食品，食用安全性得到保障，且此菌具有較好耐鹽、耐酸和耐膽鹽特性，為進(jìn)一步研究其潛在益生特性奠定基礎(chǔ)。

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Screening and functional property of cholesterol-and nitrite-degrading lactic acid bacteria from pickled vegetable

ZENG Chenglu,LI Feng*,HUANG Dena
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Qiannan Normal College for Nationalities,Duyun 558000,China)

Lactic acid bacteria were separated and purified from pickled vegetable produced by Dushan traditional fermentation process by spread plate method.Strain Y-12 was identified asLactococcus raffinolactisby physiological biochemical tests and molecular biology method.The scavenging activity of the strain Y-12 on cholesterol and nitrite was determined by colorimetric method.The degradation rate of strain Y-12 on cholesterol and nitrite were 78.15%and 75.17%,respectively.The results of acid resistance,salt resistance and bile salt resistance tests showed that strain Y-12 was able to grow in acidic environment(pH≥2.5),and could tolerate 5%NaCl and 0.3%bile salts.

Lactococcus raffinolactis;cholesterol;nitrite;lactic acid bacteria

TS201.3

0254-5071（2017）07-0037-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.009

2017-02-27

貴州省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（黔教合KY[2014]286）；貴州省科學(xué)技術(shù)聯(lián)合基金項(xiàng)目（黔科合LH字[2014]7418）

曾承露（1986-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

*通訊作者：李鋒（1982-），男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)樯锘み^程。