朱大恒，劉麗，喻銳，趙冉冉，朱利利，程方，劉雨松，吳詩佳，張莉，席宇*

（1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450000；2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

芽孢桿菌LWM1的分離鑒定及其對蠟樣芽孢桿菌的抑制作用

朱大恒1，劉麗1，喻銳1，趙冉冉1，朱利利1，程方1，劉雨松1，吳詩佳1，張莉2，席宇1*

（1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450000；2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

從土壤樣品中分離出10株芽孢桿菌（Bacillusspp.），以蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）為指示菌株，采用牛津杯擴(kuò)散法篩選出一株具有較強抑菌活性的菌株LWM1。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化試驗、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）及16S rDNA基因序列同源性分析，菌株LWM1被初步鑒定為一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），并研究了其在馬鈴薯葡萄糖水（PDW）和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）中發(fā)酵上清液對蠟樣芽孢桿菌的抑制效果。結(jié)果表明，PDW培養(yǎng)基更有利于菌株LWM1生長和抑菌物質(zhì)產(chǎn)生。因此，可利用PDW培養(yǎng)基為主要底物大規(guī)模發(fā)酵制備菌株LWM1的抑菌物質(zhì)。

芽孢桿菌；分離；鑒定；抑菌活性

蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）是環(huán)境中常見的食源性致病菌之一[1]，在食品的生產(chǎn)加工過程中被引入到人體[2-4]，部分菌株可通過產(chǎn)生嘔吐毒素、溶血素和腸毒素等物質(zhì)危害人體健康[5-8]。食品加工過程中蠟樣芽孢桿菌極易通過形成生物膜而提高其粘附能力和抵抗力[9-10]，同時生物膜也可為其他有害微生物提供良好的定殖場所，導(dǎo)致設(shè)備不易清洗，污染的菌體不易清除，進(jìn)而產(chǎn)生潛在食品安全問題[10]。鑒于芽孢具有較強抵抗力，采用理化方法防控蠟樣芽孢桿菌的危害時，操作繁瑣，成本較高[11]，因此研究開發(fā)高效針對蠟樣芽孢桿菌的抑菌劑對保障食品質(zhì)量安全和人類健康具有重要意義[12]。目前，利用植物源抑菌劑植物提取物[13-14]和植物精油[15-17]抑制蠟樣芽孢桿菌的研究較多，而微生物源抗菌劑僅有少量利用乳酸菌抑制蠟樣芽孢桿菌或去除其毒素[18-19]的報道，利用芽孢桿菌的研究開發(fā)甚少[20]。芽孢桿菌能產(chǎn)生多種高效抑菌物質(zhì)，目前芽孢桿菌的多個菌株已被成功開發(fā)為生物殺菌劑[21]。而且，作為一種理想的胞外分泌型微生物，芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)更有利于提取和純化。因此，選育高抑菌性能的芽孢桿菌菌株已成為當(dāng)前生物殺菌劑領(lǐng)域的研發(fā)熱點。

本研究對從土壤中篩選的一株對蠟樣芽孢桿菌抑菌活性較高的菌株，通過形態(tài)學(xué)、生理生化試驗、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）及16SrDNA基因序列同源性分析對分離菌株進(jìn)行了鑒定，并初步研究了分離菌株發(fā)酵上清液對蠟樣芽孢桿菌的抑制作用，旨在為開發(fā)綠色環(huán)?？咕鷦┨峁┘夹g(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）（菌株編號為ATCC11778）：由河南省疾病預(yù)防控制中心提供，菌種保藏于營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）斜面培養(yǎng)基。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrient broth，NB）和芽孢染色試劑盒：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextroseagar，PDA）和馬鈴薯葡萄糖水（potatoglucosewater，PDW）：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 土壤樣品及試劑

土壤樣品：2016年7月6日采集于河南省蘭考縣夏武營綠色蔬菜基地，用于拮抗芽孢桿菌的分離。氯化鈉（分析純）：北京昊迪精細(xì)化工制品有限公司；芽孢染色液（160413）：北京路橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實驗設(shè)備廠；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；Avanti J-25低溫高速離心機：美國Beckmancoulter公司；BS223S電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；EclipseE200生物顯微鏡：尼康儀器（上海）有限公司；UV-1700（E）分光光度計：日本島津公司；SYQ-DSX-280B手提式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Uhrafle Xtreme基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）：德國布魯克公司；牛津杯（內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm）：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌的分離純化

將采集的蔬菜根際土樣5 g無菌操作加入至含95 mL帶玻璃珠的無菌生理鹽水的錐形瓶中，37℃、180 r/min振蕩20 min，75℃水浴20 min，靜置5 min后取土壤菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液涂布于NA平板，設(shè)置3個平行，45℃培養(yǎng)1～3 d，定期觀察，選取優(yōu)勢單菌落劃線純化并斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌拮抗菌株的篩選

將篩選的菌株接種到NB培養(yǎng)基中37℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后，于12 000 r/min、4℃離心10 min，經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾獲得上清液，上清液抑菌活性檢測采用文獻(xiàn)[22]的牛津杯雙層平板擴(kuò)散法進(jìn)行，略有改動：無菌培養(yǎng)皿中加入10 mL瓊脂含量為1.5%的水瓊脂，凝固后放入牛津杯，同時取NB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的蠟樣芽孢桿菌菌液1.5 mL（OD600nm值為1.5）接種至45℃、100 mL的NA培養(yǎng)基中混合均勻后，迅速取20 mL加入至培養(yǎng)皿中，凝固后取出牛津杯，以NB培養(yǎng)基為對照，在牛津杯小孔中分別加入150 μL分離菌株上清液，于4℃冰箱中靜置4h，37℃培養(yǎng)6～8h后，測量抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ），試驗設(shè)置3個平行，結(jié)果取平均值。

1.3.3 拮抗菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將分離菌株分別接種到NA和PDA平板上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征；挑取菌落邊緣菌體用芽孢染色試劑盒進(jìn)行染色，顯微鏡鏡檢并拍照。

生理生化特征：分離菌株生理生化特征的檢測參考文獻(xiàn)[23]方法進(jìn)行。

MALDI-TOF MS鑒定：菌株的MALDI-TOF MS鑒定參考文獻(xiàn)[24]進(jìn)行。

16S rDNA基因序列同源性分析：拮抗菌株16S rDNA序列的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。16SrDNA基因序列進(jìn)行BLAST比對，選取同源性較高的芽孢桿菌16S rDNA序列進(jìn)行多序列匹配排列，利用MEGA 6.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.4 培養(yǎng)基質(zhì)對拮抗菌株發(fā)酵液抗菌活性的影響

將分離菌株分別接種到裝液量100 mL/250 mL的NB和PDW培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)12 h制備種子液，取5 mL的種子液分別接種到裝液量95 mL/250 mL的NB和PDW培養(yǎng)基，37℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔12 h無菌操作取樣進(jìn)行生物量和抑菌效果的檢測。

生物量的檢測：通過測定發(fā)酵液在波長600 nm處的吸光度值（OD600nm）來反映菌體生物量[25]；抑菌效果的檢測參考1.3.2方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

從采集的土樣中共分離出10株細(xì)菌，以蠟樣芽孢桿菌為指示菌株進(jìn)行拮抗菌的篩選，分離菌株在NB培養(yǎng)基中上清液的抑菌效果見表1。由表1可知，10株分離菌株中有8株菌可測定出抑菌圈直徑（DIZ），其中菌株LWM1的DIZ值最大（2.11 cm），表明其具有相對較強的抑菌作用，因此將菌株LWM1作為拮抗菌株進(jìn)行下一步研究。

表1 分離菌株對蠟樣芽孢桿菌的拮抗效果Table 1 Antagonistic effect of isolated strains onB.cereus

2.2 拮抗菌株培養(yǎng)及形態(tài)特征

菌株LWM1在NA和PDA平板上劃線37℃培養(yǎng)24 h，觀察其菌株形態(tài)特征，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在NA平板上，菌株LWM1形成淺黃色不透明菌落，邊緣不規(guī)則，表面粗糙；在PDA平板上，菌株LWM1菌落表面還呈現(xiàn)明顯的褶皺狀凸起，且菌落明顯比在NA平板上的菌落大，表明PDA平板更適合菌株LWM1的生長。經(jīng)芽孢染色后，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，芽孢圓柱狀，多數(shù)為次端生，部分為中生，孢囊無膨大現(xiàn)象。

圖1 菌株LWM1的菌落特征及菌體形態(tài)Fig.1 Colony characteristics and microbial morphology of strain LWM1

2.3 拮抗菌株的生理生化特征

菌株LWM1的生理生化特征檢測結(jié)果如表2所示。由表2可知，菌株LWM1可利用蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇、蜜二糖、阿拉伯糖、七葉苷糖、淀粉、乳糖、木糖和半乳糖苷等碳源。過氧化氫酶和V-P實驗陽性，甲基紅和氧化酶實驗陰性。經(jīng)檢索，菌株LWM1與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的生理生化特征高度相似[26]。

表2 菌株LWM1的生理生化特征檢測結(jié)果Table 2 Detection results of physiological and biochemical characteristics of strain LWM1

2.4 拮抗菌株的MALDI-TOF MS鑒定

MALDI-TOF MS是一種基于檢測細(xì)菌蛋白質(zhì)指紋圖譜的鑒定方法，具有簡單快捷的優(yōu)點，因此在微生物快速鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用越發(fā)廣泛[24]。對菌株LWM1進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，蛋白質(zhì)指紋圖譜如圖2所示。由圖2可知，在2210m/z附近出現(xiàn)一個強度最大的的離子峰，而在3252、3856、4942、6 506、7 712和9 882 m/z附近出現(xiàn)的離子峰強度不大。檢索后發(fā)現(xiàn)菌株LWM1與數(shù)據(jù)庫中解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）的匹配分值為1.778。MALDI-TOF MS分值在1.700～1.999之間的結(jié)果僅可準(zhǔn)確的鑒定到屬[24]。因此，通過MALDI-TOF MS可將菌株LWM1鑒定為一株芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 菌株LWM1的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of strain LWM1 by MALDI-TOF MS analysis

2.5 拮抗菌株16S rDNA基因序列同源性分析

菌株LWM1的16 S rDNA基因序列長度為1 503 bp，以一株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）AB330933為外群，選取BLAST比對結(jié)果中同源性較高的15株菌構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，菌株LWM1與解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）的多個菌株處于一個分支，進(jìn)化距離較近。因此，結(jié)合菌株LWM1的形態(tài)觀察、生理生化特性及MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果，初步鑒定菌株LWM1為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。

圖3 菌株LWM1基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of strain LWM1

2.6 不同發(fā)酵基質(zhì)對抗菌活性的影響

分別選擇PDW和NB培養(yǎng)基對菌株LWM1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測不同時間發(fā)酵液生物量和上清液的抑菌活性，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，菌株LWM1在2種培養(yǎng)基中均能快速生長，發(fā)酵24 h時，NB培養(yǎng)基中菌體生物量達(dá)到最高，OD600nm為1.796；PDW培養(yǎng)基中菌體生物量明顯更高，發(fā)酵24 h時OD600nm為2.260，其后OD600nm逐漸升高，發(fā)酵48 h時生物量達(dá)到最高，OD600nm達(dá)到2.613，在發(fā)酵至72 h時仍保持較高的生物量。

圖4 在PDW和NB培養(yǎng)基中菌株LWM1生物量和發(fā)酵上清液抑菌效果的比較Fig.4 Comparison of biomass and inhibition effect of the fermented supernatant fluid of strain LWM1 in PDW and NB medium

在NB培養(yǎng)基中，發(fā)酵12h時，50μL上清液DIZ為1.19cm，發(fā)酵24h時，DIZ達(dá)到最大值1.94cm，其后隨發(fā)酵時間延長，DIZ逐漸減小；150 μL上清液抑菌活性也具有同樣趨勢，發(fā)酵24 h時具有最高抑菌活性，DIZ為2.19 cm。在PDW培養(yǎng)基中，發(fā)酵12 h時，50 μL上清液DIZ為1.31 cm，其后，DIZ逐漸變大，發(fā)酵60 h時，DIZ達(dá)到最大值2.11 cm；150 μL上清液在發(fā)酵24 h時DIZ從發(fā)酵12 h時的1.93 cm增至2.28 cm，在發(fā)酵24～60 h內(nèi)均保持較高的抑菌活性，DIZ沒有明顯的增大現(xiàn)象。在同一發(fā)酵時間點，50 μL和150 μL的PDW上清液的抑菌活性均高于相對應(yīng)的NB上清液。而且，在PDW培養(yǎng)基中，隨發(fā)酵時間的延長，50 μL與150 μL的上清液抑菌活性的差距逐漸縮小，表明抑菌物質(zhì)產(chǎn)生逐漸變大，結(jié)合菌株LWM1在PDW培養(yǎng)基中的生物量變化規(guī)律，可推測出相對廉價的PDW更有利于促進(jìn)菌株LWM1生長和抑菌物質(zhì)產(chǎn)生。

3 結(jié)論

本研究從土壤樣品中分離出一株對食源性致病菌蠟樣芽孢桿菌具有較強抑菌活性的菌株LWM1，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜及16S rDNA基因序列同源性分析，菌株LWM1被初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。與NB培養(yǎng)基相比，菌株LWM1在PDW培養(yǎng)基中發(fā)酵上清液對蠟樣芽孢桿菌具有更高的抑菌活性。PDW培養(yǎng)基成本相對較低，因此下一步可利用PDW培養(yǎng)基為主要底物進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，獲得最佳的抑菌物質(zhì)產(chǎn)生工藝條件，通過大規(guī)模發(fā)酵制備和提取純化拮抗蠟樣芽孢桿菌的抑菌物質(zhì)，并對抑菌物質(zhì)作用條件、使用劑量及安全性能等方面進(jìn)行探究和評估，從而獲得一種廉價高效的抑菌劑。

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Isolation and identification ofBacillusLWM1 and its inhibition effect onBacillus cereus

ZHU Daheng1,LIU Li1,YU Rui1,ZHAO Ranran1,ZHU Lili1,CHENG Fang1,LIU Yusong1,WU Shijia1,ZHANG Li2,XI Yu1*
(1.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China; 2.College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450002,China)

10 strains ofBacillusspp.were isolated from soil samples.UsingBacillus cereusas the indicator strain,strain LWM1 with strong antibacterial activity was isolated by Oxford cup diffusion method.Combined with morphological,physiological and biochemical tests,matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)and 16S rDNA gene sequence analysis,strain LWM1 was preliminarily identified asBacillus amyloliquefaciens.The inhibition effect of the fermented supernatant fluid of strain LWM1 in PDW and NB medium onBacillus cereuswas researched.The results showed that PDW medium was more favorable for the growth of strain LWM1 and the production of inhibitive substance.Therefore,the inhibitive substance of strain LWM1 could be prepared by large-scale fermentation with PDW medium as the main substrate.

Bacillusspp.;isolation;identification;antibacterial activity

Q815

0254-5071（2017）07-0027-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.007

2017-03-17

國家自然科學(xué)基金項目（31401918）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目（201610459070）

朱大恒（1965-），男，教授，博士，研究方向為微生物發(fā)酵工程。

*通訊作者：席宇（1976-），男，講師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵與優(yōu)化。