溫之雨，董福雙，張華寧，楊瑞娟,2，張艷敏

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 遺傳生理研究所，河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，石家莊 050051；2.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024)

紫花苜蓿高頻體胚發(fā)生及萌發(fā)成苗技術(shù)與轉(zhuǎn)基因應(yīng)用

溫之雨1，董福雙1，張華寧1，楊瑞娟1,2，張艷敏1

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 遺傳生理研究所，河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，石家莊 050051；2.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024)

以紫花苜蓿的子葉或葉片為外植體，建立高頻體胚發(fā)生及成苗技術(shù)體系，為苜蓿耐逆性狀的遺傳改良提供技術(shù)支撐。在愈傷誘導(dǎo)、體胚誘導(dǎo)、體胚成熟與萌發(fā)等幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，分析比較培養(yǎng)基組分對(duì)培養(yǎng)效果的影響。建立在SHDK培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷、MB(-/+)+ABA 0.4 mg/L+PEG-6000 50 g/L+蔗糖50 g/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚、Bio2Y培養(yǎng)基上促體胚發(fā)育成熟、1/2 MS(或SH)培養(yǎng)基上體胚萌發(fā)成苗的高頻再生技術(shù)體系。最適條件下，每克胚性愈傷組織可產(chǎn)生77.9個(gè)正常萌發(fā)成苗的健康體胚。再生植株在生長(zhǎng)箱內(nèi)經(jīng)過2周20 ℃、16 h/d的光照培養(yǎng)后移栽溫室，成活率達(dá)90%以上。利用該離體再生技術(shù)成功地將凝集素基因PPA導(dǎo)入苜蓿中，獲得抗蚜轉(zhuǎn)基因苜蓿。

紫花苜蓿；體胚發(fā)生；離體再生；轉(zhuǎn)基因

苜蓿(MedicagosativaL.)是重要的豆科牧草，營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占其干物質(zhì)的17%～20%，被譽(yù)為“牧草之王”。種植苜蓿對(duì)改良土壤、保持水土及保護(hù)環(huán)境亦大有益處。中國人口眾多，保障糧食生產(chǎn)的任務(wù)艱巨；為保證糧食生產(chǎn)的耕地面積，發(fā)展苜蓿必須向鹽堿灘涂要空間。雖然苜蓿表現(xiàn)出一定的耐鹽性，可在輕度鹽堿土壤上生存，但尚缺乏可耐中重度鹽堿的種質(zhì)資源。培育強(qiáng)耐鹽苜蓿新品種對(duì)開發(fā)利用鹽堿灘涂地及增加苜蓿生物產(chǎn)量具有重要作用。

耐鹽苜蓿資源短缺，再加上苜蓿雜交育種困難，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良苜蓿的耐鹽性是加快苜蓿新品種選育的有效途徑。苜蓿轉(zhuǎn)基因植株的獲得主要由農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[1-5]。大多數(shù)的轉(zhuǎn)化技術(shù)依賴于苜蓿的組織培養(yǎng)和離體再生，極少利用莖尖建立的in planta轉(zhuǎn)化方法[6]。盛慧等[7]的報(bào)道雖然沒有經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)過程，但用子葉節(jié)為受體通過叢生芽發(fā)生途徑也沒有擺脫組織培養(yǎng)的束縛。因此，建立高效的苜蓿離體再生技術(shù)體系是苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的重要組成部分。苜蓿的離體再生途徑包括器官發(fā)生和體胚發(fā)生2種途徑[8]。其中，體胚發(fā)生再生途徑因胚狀體起源于單細(xì)胞，具有嵌合體少、遺傳背景一致的優(yōu)點(diǎn)；胚狀體具有的雙極性使其可發(fā)育成同時(shí)具有芽和根的完整植株，避開不定芽發(fā)育中的生根困難問題。遺傳轉(zhuǎn)化體通過體胚發(fā)生途徑直接成苗可降低轉(zhuǎn)化細(xì)胞的無性變異風(fēng)險(xiǎn)及非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的逃逸選擇風(fēng)險(xiǎn)[9]。但體細(xì)胞胚胎再生途徑存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、分化頻率偏低、組織培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格等弊端，這些因素限制紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化效率的提高。王成龍等[10]探索紫花苜蓿的叢生芽再生系統(tǒng)，使其再生頻率比體胚再生系統(tǒng)提高1倍，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，叢生芽再生系統(tǒng)與體胚再生系統(tǒng)的芽分化率相差不大(分別為70.4%和67.1%)，差別主要是單個(gè)外植體分化的芽數(shù)，前者為8.11，后者為2.83。雖然該系統(tǒng)可在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的叢生芽，但其存在的高畸形芽率也不容小覷。

植物細(xì)胞全能性賦予每個(gè)細(xì)胞發(fā)育成完整植株的可能性，但實(shí)際上并非每一個(gè)細(xì)胞都能被有效誘導(dǎo)發(fā)育成小植株，它與細(xì)胞的組織來源及生理狀態(tài)等有關(guān)。在小麥、玉米、大豆、棉花等多種作物上都報(bào)道組織培養(yǎng)的基因型依賴性[11-15]。在苜蓿上也有基因型影響紫花苜蓿愈傷組織和體胚形成的報(bào)道[16-17]?？朔@一困難的方法之一是選擇再生頻率高的基因型，但由此產(chǎn)生的問題是影響轉(zhuǎn)基因作物的實(shí)用性或延遲轉(zhuǎn)基因作物的生產(chǎn)應(yīng)用。本研究以生產(chǎn)用苜蓿品種為材料，從愈傷誘導(dǎo)、體胚誘導(dǎo)、體胚成熟與萌發(fā)等幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，旨在解決苜蓿體胚誘導(dǎo)效率及萌發(fā)效率的雙低問題，從而建立紫花苜蓿高頻體胚發(fā)生的離體再生技術(shù)，為苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化提供良好的受體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為紫花苜蓿品種‘三得利’的無菌苗。

1.2 外植體準(zhǔn)備

先將苜蓿種子用φ=70%的乙醇消毒1～2 min，再用1 g/L的氯化汞消毒10～12 min，無菌水充分沖洗3～4遍。將種子放到鋪有滅菌濾紙的平皿內(nèi)，用鑷子轉(zhuǎn)接到1/2 MS培養(yǎng)基上。在25 ℃、16 h/8 h光暗周期、2 000 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)7～10 d。然后將外植體按子葉、葉柄、莖段和下胚軸等分開，每一外植體約3 mm大小。

1.3 所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

以SH[18]、MS[19]及Bio2Y[20]等為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加不同種類及濃度的激素分別用于愈傷誘導(dǎo)、體胚誘導(dǎo)與成熟及體胚萌發(fā)成苗。各階段所用培養(yǎng)基的組分詳見表1；培養(yǎng)基的pH用KOH調(diào)節(jié)到5.8。 所有培養(yǎng)物都在(25±2) ℃的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，除愈傷誘導(dǎo)階段無光照外，其他各階段維持16 h/d的光照條件。

表1 苜蓿體胚誘導(dǎo)各階段所用的培養(yǎng)基Table 1 Media used in different periods during embryo induction and maturation

1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基

以MB(-/+)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以ABA、AgNO3和PEG-6000為效應(yīng)因子，進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計(jì)。上述3因子的試驗(yàn)水平分別為0、0.2和0.4 mg/L；0、10和20 mg/L；0、25和50 g/L。將SHDK培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的胚性愈傷轉(zhuǎn)移到上述相應(yīng)培養(yǎng)基上，每處理1瓶，5次重復(fù)。用接種后的(瓶+愈傷)質(zhì)量減去接種前的瓶質(zhì)量得到每瓶的愈傷質(zhì)量。20 d后將體胚轉(zhuǎn)移到1/2 SH或1/2 MS培養(yǎng)基上，2周后調(diào)查芽和根發(fā)育健全、可正常萌發(fā)成苗的體胚數(shù)，計(jì)算各處理每克愈傷組織形成可正常萌發(fā)的體胚數(shù)。

1.5 凝集素基因PPA轉(zhuǎn)化苜蓿

1.5.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得 外植體為生產(chǎn)用苜蓿品種‘三得利’的無菌苗子葉，農(nóng)桿菌株為攜帶抗蚜PPA基因的EHA105。抗蚜基因PPA來源于掌葉半夏，構(gòu)建在帶有卡那霉素抗性標(biāo)記的PBI121質(zhì)粒載體上，并由35S啟動(dòng)子控制。遺傳轉(zhuǎn)化采用外植體預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)各為3 d的方式[21]。共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基(SHDK+頭孢噻肟鈉500 mg/L)上暗培養(yǎng)7 d。然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(成分同恢復(fù)培養(yǎng)基，添加卡那霉素30 mg/L)，經(jīng)過2～3次繼代培養(yǎng)獲得抗性愈傷組織。將淺黃綠色、粘稠并帶有顆粒狀結(jié)構(gòu)物的愈傷組織轉(zhuǎn)移到附加有ABA 0.4 mg/L和PEG-6000 50 g/L的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基MB(-/+)上誘導(dǎo)體胚形成；在Bio2Y+50 g/L蔗糖培養(yǎng)基上促體胚發(fā)育成熟；在MS或1/2 MS培養(yǎng)基上促體胚萌發(fā)成苗。再生植株在光照培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)過2周25 ℃、16 h/d的光照培養(yǎng)后移栽溫室。

1.5.2 PCR、RT-PCR和PCR-Southern檢測(cè) 植物基因組DNA的提取采用CTAB法。植物總RNA提取用上海華堯/華舜公司的RNArose。PCR擴(kuò)增PPA基因的上游引物序列為：5′-ATGGCCTCCAAGCTCCTCCTC-3′，下游序列為：5′-CTACGCGGCAATTGGGCGCTT-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)所用TAQ酶、dNTP等試劑購自北京天根生化公司，RT-PCR反應(yīng)所用試劑為TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0。Southern blot采用ROCHI公司生產(chǎn)的Dig High Prime Labeling and Detection Starter Kit I，根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體來源對(duì)愈傷狀態(tài)的影響

子葉、葉柄、莖段、下胚軸等4種外植體在SHDK培養(yǎng)基上的愈傷誘導(dǎo)率差異不大，均可達(dá)到95%以上；但不同外植體對(duì)愈傷誘導(dǎo)表現(xiàn)出不同的時(shí)間響應(yīng)和質(zhì)量效果。下胚軸切段最先愈傷化，其次是葉柄、子葉，莖段反應(yīng)最慢。在愈傷繼代過程中，莖段來源愈傷最易褐化死亡，淘汰率最高，其次是下胚軸來源愈傷，子葉和葉柄來源的愈傷狀態(tài)最好。下胚軸來源愈傷增殖速度較快，顏色較淺，分散性較強(qiáng)，不易分化體胚；子葉來源愈傷較易形成淺黃綠色、粘稠糊狀并嵌有顆粒狀物的胚性愈傷組織，體胚分化率較高，是比較理想的外植體來源。

2.2 培養(yǎng)基對(duì)體胚誘導(dǎo)效果的影響

挑選在SHDK培養(yǎng)基上獲得的淺黃綠色、粘稠并有顆粒狀結(jié)構(gòu)物的愈傷組織轉(zhuǎn)移到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1周后，在MSBN培養(yǎng)基上的愈傷組織表面就陸續(xù)出現(xiàn)綠色的球狀突起，并很快形成較硬的“蓋”覆蓋愈傷，沒有體胚發(fā)生(圖1-a)。在MS0和MB(-)培養(yǎng)基上的愈傷組織，在培養(yǎng)2～3周后，肉眼可觀察到有體胚發(fā)生。MB(-)培養(yǎng)基的體胚誘導(dǎo)效果好于MS0(圖1-b,1-c)。MS0培養(yǎng)基上體胚數(shù)量較少，不僅發(fā)生體胚的愈傷塊數(shù)少，每塊愈傷上面形成的體胚數(shù)也少。MB(-/+)培養(yǎng)基[在MB(-)基礎(chǔ)上KNO3加倍]的體胚誘導(dǎo)效果較好，每一塊愈傷組織都有體胚形成，且愈傷組織內(nèi)部到后期亦有體胚形成；體胚數(shù)量也較其他3個(gè)處理明顯增加(圖1-d)，每克愈傷組織形成的體胚數(shù)平均為39.5±6.2。

A.MSBN培養(yǎng)基 MSDN medium; b.MS0培養(yǎng)基 MS0 medium; c.MB(-)培養(yǎng)基 MB(-) medium; d.MB(-/+)培養(yǎng)基 MB(-/+) medium

圖1 不同培養(yǎng)基上的體胚誘導(dǎo)效果
Fig.1 Somatic embryo induction on different media

2.3 體胚成熟與萌發(fā)

將子葉型胚直接轉(zhuǎn)移到MS0或1/2 MS培養(yǎng)基上后，大部分體胚不能正常萌發(fā)成苗。部分胚狀體子葉異常膨大后停止生長(zhǎng)，或出現(xiàn)連體的子葉，或出現(xiàn)試管苗的玻璃化，或出現(xiàn)大量次級(jí)體胚，不能發(fā)育成完整的植株；有的胚狀體膨大后出現(xiàn)脫分化重新愈傷化現(xiàn)象。據(jù)2個(gè)批次試驗(yàn)的調(diào)查統(tǒng)計(jì)，體胚正常萌發(fā)成苗的比率僅為5.8%(表2)。

為此，借鑒黎茵等[22]的方法，添加一個(gè)體胚成熟的液體培養(yǎng)過程，即將獲得的體胚放入促進(jìn)體胚成熟的液體培養(yǎng)基(SH基本鹽+L-Proline 3.45 g/L+(NH4)2SO41.65 g/L+蔗糖20 g/L)中，100 r/min震蕩培養(yǎng)5～7 d，然后挑選發(fā)育正常的體胚轉(zhuǎn)移到1/2 MS或1/2 SH固體培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，2周后調(diào)查體胚萌發(fā)率。由表3可見，增加這一促體胚成熟的液體培養(yǎng)過程，對(duì)提高體胚的正常萌發(fā)率效果并不明顯。

表2 未經(jīng)體胚成熟培養(yǎng)過程的體胚發(fā)育情況Table 2 Development of somatic embryos without maturity promotion treatment

注： * 數(shù)據(jù)為2批次試驗(yàn)“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。

Note: Data marked with * represents average value and stand division of shoot percentage for Exp.1 and Exp.2.

表3 經(jīng)過液體體胚成熟培養(yǎng)過程的體胚萌發(fā)情況Table 3 Development of somatic embryos after maturity promotion in liquid medium

因此，本研究又以ABA、AgNO3和PEG-6000為效應(yīng)因子進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化體胚誘導(dǎo)條件。結(jié)果表明，在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加AgNO3、PEG、ABA等對(duì)以后體胚萌發(fā)的影響效果不同(表4)。PEG-6000的效應(yīng)值最大，硝酸銀為負(fù)效應(yīng)。最后確定合適的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MB(-/+)+ABA 0.4 mg/L+PEG-6000 50 g/L+蔗糖50 g/L+瓊脂4.5 g/L，pH 5.8。最適條件下，每克胚性愈傷組織可產(chǎn)生77.9個(gè)正常(或健康)體胚。

將誘導(dǎo)的體胚適時(shí)轉(zhuǎn)移到Bio2Y培養(yǎng)基上進(jìn)行10～14 d的促發(fā)育培養(yǎng)，可減少M(fèi)B(-)培養(yǎng)基上時(shí)間太長(zhǎng)引發(fā)的球形胚重愈傷化現(xiàn)象，從而進(jìn)一步提高體胚的正常萌發(fā)率。最終建立體胚高頻發(fā)生、正常萌發(fā)的苜蓿離體再生技術(shù)體系，即：SHDK培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷，MB(-/+)+ABA 0.4 mg/L+PEG-6000 50 g/L+蔗糖50 g/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚，Bio2Y培養(yǎng)基上促體胚發(fā)育成熟，1/2 MS(或SH)培養(yǎng)基上體胚萌發(fā)成苗。再生植株在光照培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)過2周20 ℃、16 h/d的光照培養(yǎng)后移栽溫室，成活率90%以上。體胚萌發(fā)、再生植株移栽前煉苗及溫室移栽情況見圖2。

表4 AgNO3、PEG和ABA對(duì)苜蓿健康體胚誘導(dǎo)的效應(yīng)比較[L9(34)]Table 4 Effect of AgNO3,PEG and ABA on the induction of somatic embryos in alfalfa

A.培養(yǎng)基上體胚萌發(fā)情況 Embryo germination on medium；b.光照培養(yǎng)箱內(nèi)煉苗 Plantlets acclimatization in growth cabinet；c.溫室內(nèi)移栽成活 Plantlets grown in soil

圖2 再生植株的成苗與移栽
Fig.2 Formation and transplanting of plantlets

2.4PPA抗蚜基因轉(zhuǎn)化苜蓿

共侵染經(jīng)預(yù)培養(yǎng)3 d的子葉50枚，在含有30 mg/L卡那霉素的SHDK培養(yǎng)基上獲得抗性愈傷組織23塊，抗性愈傷獲得率為46%?？剐杂鷤诤?5 mg/L卡那霉素的體胚誘導(dǎo)及體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)后獲得16個(gè)再生植株。再生植株經(jīng)練苗后移栽溫室成活9株。經(jīng)PCR(圖3-a)、PCR-Southern(圖3-b)鑒定8株為陽性，表明外源PPA基因已整合進(jìn)苜?；蚪M。RT-PCR結(jié)果表明，外源PPA基因可在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)(圖3-c)。

A.轉(zhuǎn)PPA基因苜蓿的PCR方法檢測(cè) Detection ofPPAgene in transgenic alfalfa by PCR method; b.轉(zhuǎn)PPA基因苜蓿的PCR-Southern鑒定 Identification ofPPAgene in transgenic alfalfa by PCR-Southern method; c.轉(zhuǎn)PPA基因苜蓿在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)檢測(cè) Detection ofPPAgene expression at the transcription level in transgenic alfalfa.

P1～P9.轉(zhuǎn)化再生植株 Plantlets regenerated from transformation; CK-.陰性對(duì)照 Negative control without transformation; CK+.陽性對(duì)照 Positive control plant; CK2.P9植株經(jīng)DNase I 消化后的RNA樣品，以排除樣品未消化干凈的DNA樣品干擾 RNA sample from plant P9 digested with DNase I to verify if the DNA contamination was eliminated.

圖3 轉(zhuǎn)PPA基因苜蓿的分子鑒定
Fig.3 The identification ofPPAtransgenic alfalfa by PCR,PCR-Southern and RT-PCR methods

3 討 論

紫花苜蓿的愈傷誘導(dǎo)多以MS、UM、SH等為基礎(chǔ)培養(yǎng)基附加不同種類和濃度的植物激素[10,23-24]。激素中2,4-D作用最為顯著，其單獨(dú)使用或與其他細(xì)胞分裂素組合，都能成功地誘導(dǎo)出愈傷組織。不同的2,4-D濃度，誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)形態(tài)差異很大，不同外植體來源的愈傷組織生長(zhǎng)所需的激素種類和濃度也不同[25]。本研究采用SH為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，比較容易地誘導(dǎo)出呈粘稠、微黃綠色、具結(jié)構(gòu)性內(nèi)容物的胚性愈傷組織。困難的是體胚，特別是“健康”體胚的誘導(dǎo)和成熟。只有“健康”的體胚才可最終發(fā)育成完整的植株。

4 結(jié) 論

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

High Frequency of Embryogenesis and Germination to Seedling in Alfalfa and Its Application in Transgenic Research

WEN Zhiyu1,DONG Fushuang1,ZHANG Huaning1,YANG Ruijuan1,2and ZHANG Yanmin1

(1.Institute of Genetics and Physiology,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province,Shijiazhuang 050051,China；2.College of Life Science,Hebei Normal University,Shijiazhuang 050024,China)

The objective of this study was to establish the technique for high efficient embryogenesis and seedling development using cotyledons or leaves from aseptic seedlings as explants,which will provide a technical support for genetic improvement of tolerance to abiotic stresses in alfalfa(Medicagosativa).The effects of different medium ingredients on callus induction,embryogenetic induction,maturation,and germination were compared.The technique for high-frequency of embryogenesis included induction of callus on SHDK medium,induction of embyros on MB(-/+) + 0.4 mg/L ABA+50 g/L PEG-6000+50 g/L sucrose,growth of embryos on Bio2Y medium,and development of seedling on 1/2 MS(or SH) medium.Under the optimal conditions,about 77.9 healthy embryos that formed seedlings were produced per gram of callus.The seedlings regenerated were grown in a growth chamber at 20 °C with a photoperiod of 16 h light and 8 h dark for two weeks prior to transplanting to a greenhouse,and the survival rate was over 90%.This technique was successfully used in the transformation ofPPAgene into alfalfa and the transgenic alfalfa with resistance to aphid was obtained.

MedicagosativaL; Somatic embryogenesis; In vitro regeneration; Transgene

2016-03-18 Returned 2016-04-19

The Natural Science Foundation of Hebei Province,China(No.C2013301033).

WEN Zhiyu,male,associate research fellow.Research area: crop resources innovation.E-mail: wzy1800@126.com

ZHANG Yanmin,female,research fellow.Research area: tissue culture and transgenic technology.E-mail: zhym63@163.com

日期：2017-06-05

2016-03-18

2016-04-19

河北省自然科學(xué)基金(C2013301033)。 第一作者：溫之雨，男，副研究員，主要從事農(nóng)作物資源創(chuàng)新研究。E-mail: wzy1800@126.com 通信作者：張艷敏，女，研究員，主要從事組織培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究。E-mail: zhym63@163.com

S512.1+2

A

1004-1389(2017)06-0882-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170605.1728.022.html