王高振，金 朵，吳文君，祁志軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥研究所，陜西楊凌 712100)

東方粘蟲 U6啟動子的克隆及功能驗證

王高振，金 朵，吳文君，祁志軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥研究所，陜西楊凌 712100)

為了持續(xù)獲得大量短片段干擾RNA(short interference RNA, siRNA)，通過染色體步移技術(shù)克隆得到東方粘蟲 U6 snRNA 基因5′-端側(cè)翼啟動子序列1 426 bp。經(jīng)生物信息學(xué)分析，該序列含SPH元件、八聚體序列(OCT)、遠(yuǎn)端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)及TATA box等RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymerase Ⅲ，RNA Pol Ⅲ) U6啟動子的特征元件。通過構(gòu)建RNA干擾(RNA interference, RNAi)載體的方式，對增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因進(jìn)行RNAi，證明克隆得到的東方粘蟲 U6啟動子可成功驅(qū)動shEGFP表達(dá)，具有 U6啟動子功能。為后續(xù)構(gòu)建以東方粘蟲V-ATP酶H亞基為靶基因的沉默載體奠定基礎(chǔ)。

東方粘蟲；RNA干擾； U6啟動子；功能驗證

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是近年來快速發(fā)展起來的一種序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)[1]，在功能基因組研究[2-3]、疾病防治[4-5]及新藥研發(fā)[6-7]等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。其基本原理是短片段干擾RNA(short interference RNA, siRNA)與細(xì)胞內(nèi)同源的mRNA結(jié)合導(dǎo)致其降解，從而使目的基因表達(dá)沉默[8]。獲得siRNA的方法主要有化學(xué)合成法、Dice酶切割法和短片段發(fā)卡RNA(short-hairpin RNA, shRNA)表達(dá)載體法[9]等。其中，構(gòu)建shRNA表達(dá)載體的方法是唯一適合長期研究的方法，而且由于質(zhì)?？梢詮?fù)制擴(kuò)增，相比起化學(xué)合成來說，能夠顯著降低制備siRNA的成本[10]。目前，介導(dǎo)siRNA表達(dá)的啟動子主要是RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymerase Ⅲ, RNA pol Ⅲ)啟動子，常用人源和鼠源的 U6啟動子及人的H1啟動子等[11]。這類啟動子可以促進(jìn)快速合成大量shRNA，可以實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)基因的快速沉默[12]。RNA pol Ⅲ啟動子序列上包含明確的起始和終止序列，轉(zhuǎn)錄出的RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)會在3′-端形成2個突出的尿嘧啶，這類似于天然的siRNA，因而有利于誘發(fā)RNA沉默[13]。目前，通過構(gòu)建基于 U6啟動子的基因沉默載體在不同的細(xì)胞和生物體內(nèi)已經(jīng)取得了良好的基因沉默效果。例如，由家蠶 U6啟動子驅(qū)動的shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞后，顯著降低家蠶核多角體病毒對細(xì)胞的傷害[14]；河豚雙 U6啟動子雙鏈RNA(double-stranded, dsRNA)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染鮭魚胚胎CHSE-214細(xì)胞后，有效抑制敗血癥病毒在該細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散[15]；CMV-U6混合啟動子shRNA表達(dá)載體介導(dǎo)斑馬魚相關(guān)基因的沉默[16]。由此可見，基于 U6啟動子的RNAi技術(shù)已經(jīng)成為基因沉默的主要手段。

目前，人們對 U6啟動子的結(jié)構(gòu)已經(jīng)研究較為清楚，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游包含3個啟動子元件：DSE、PSE和TATA box[17]。Lambeth等[18]研究發(fā)現(xiàn) U6啟動子各個元件的間距、序列和結(jié)構(gòu)之間存在種屬差異；Wise等[19]通過比較同一載體上的鼠源和雞 U6啟動子，發(fā)現(xiàn)不同啟動子的序列和結(jié)構(gòu)對啟動效率有很大影響。也就是說某一物種的 U6啟動子對其他物種體內(nèi)RNA pol Ⅲ的驅(qū)動能力可能降低甚至喪失。因此，要獲得理想的啟動效果，利用物種本源 U6啟動子是最佳選擇。

東方粘蟲 (Mythimnaseparata(Walker)) 是一種鱗翅目害蟲，其幼蟲主要危害玉米和小麥等禾本科作物，具有遠(yuǎn)距離遷飛、暴食和集中危害等特點(diǎn)。嚴(yán)重發(fā)生時，短時間內(nèi)就可將成片的玉米、谷子、水稻吃成根茬，防治不及時會造成嚴(yán)重?fù)p失，甚至絕產(chǎn)[20]。目前，防治東方粘蟲以噴灑殺蟲劑為主，但大面積使用化學(xué)農(nóng)藥，不但造成農(nóng)藥殘留、殺傷害蟲天敵，而且會導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗藥性。近年來，隨著基因沉默技術(shù)的發(fā)展，基于RNAi的害蟲防治策略逐漸受到人們的關(guān)注[21]，已經(jīng)在玉米根葉甲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)[22]和煙粉虱(Bemisiatabaci)[23]等害蟲防治上獲得成功。在前期研究中，本實驗室克隆出東方粘蟲V-ATP酶H亞基，設(shè)計合成dsRNA并微量注射3齡幼蟲，試蟲出現(xiàn)生長發(fā)育受阻和死亡等典型癥狀[24]。為了持續(xù)獲得大量的siRNA，本研究克隆出東方粘蟲的 U6啟動子并對其進(jìn)行功能驗證，為后續(xù)構(gòu)建以東方粘蟲V-ATP酶H亞基為靶基因的沉默載體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

東方粘蟲，在溫度為(22±1) ℃，相對濕度為60%～70%，光周期為L∶D=16 h∶8 h，光強(qiáng)為30 000 lx的條件下室內(nèi)人工飼養(yǎng)，試驗中選取5齡初蛻幼蟲。293 T細(xì)胞系由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥研究所提供，并在含胎牛血清(φ=10%)、0.1 mg/mL硫酸鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中置于37 ℃、φ=5% CO2生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

Genome walker universal試劑盒及pEGFP-N1載體購自Clontech公司，T4DNA連接酶、pGEM-T載體等購自Promega公司，ExTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、10×ExTaqbuffer (20 mmol/L, Mg2+plus)、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、DNA marker、pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ購自NEB公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清等購自Invitrogen公司；凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、昆蟲基因組DNA提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒等購自O(shè)mega公司；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自ThermoFisher scientific公司；引物及測序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 東方粘蟲基因組DNA的提取

基因組DNA的提取按照昆蟲基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 染色體步移引物設(shè)計與合成

將家蠶 U6 snRNA基因全序列(AY649381.1)與果蠅的 U6 snRNA基因全序列(AH004871.1)經(jīng)在線軟件Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)比對，分析它們的同源區(qū)域并設(shè)計兩條下游引物U6R1 和 U6R2。上游兩條引物使用Genome walker universal試劑盒中的AP1和AP2。

引物序列如下：

AP1:5′-GTAATACGACTCACTATAGG-GC-3′；AP2:5′-ACTATAGGGCACGCGTGG- T-3′；U6R1：5′-CGATTTTGCGTGTCATCCTTGCGCAG-3′；U6R2：5′-TGCCTGGCTGTAAGTGCTCAGATTCC-3′。

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1.4 染色體步移文庫的建立

將已測定質(zhì)量濃度的東方粘蟲基因組DNA經(jīng)4種限制性內(nèi)切酶DraⅠ、EcoR Ⅴ、StuⅠ和PvuⅡ過夜酶切，消化基因組DNA，回收純化消化產(chǎn)物。將純化后的DNA與Genome walker 接頭于16 ℃過夜連接，70 ℃下5 min終止反應(yīng)。用TE緩沖液稀釋至一定質(zhì)量濃度作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.5 U6 snRNA基因上游5′-端側(cè)翼序列的克隆

以構(gòu)建好的染色體步移文庫為模板，分別以AP1/U6R1和AP2/U6R2為引物，進(jìn)行兩輪巢式PCR。PCR程序按照染色體步移試劑盒說明書進(jìn)行。將4個不同文庫對應(yīng)的兩輪PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，并將目的條帶用凝膠回收試劑盒回收純化，再將其連接至pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，對陽性克隆測序分析。

1.6 U6啟動子的shEGFP重組載體的構(gòu)建

1.6.1 pMD18-N載體的構(gòu)建 根據(jù)pMD18-T載體圖譜，通過T-A克隆導(dǎo)入一段不包含EcoRⅠ、BamHⅠ及HindⅢ酶切位點(diǎn)的片段N(515 bp)，經(jīng)雙酶切檢測并測序。

1.6.3 pMD18-U6與pMD18-shEGFP載體的構(gòu)建 根據(jù)染色體步移法克隆得到的 U6 snRNA上游5′-端側(cè)翼序列，設(shè)計上游引物F1：GGATCCCTAGTGCACGGTTCCAAATTGGT(斜體為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物R1 ：AAGCTTCATGAAAACTTTACTTGCGCGA(斜體為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))，以東方粘蟲基因組DNA為模板，克隆得到上游序列1 360 bp，即為包含BamHⅠ、Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的 U6啟動子。將得到的pMD18-N載體經(jīng)BamHⅠ、Hind Ⅲ酶切，并用凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物分別與 U6啟動子及獲得的雙鏈shRNA連接，得到pMD18-U6與pMD18-shEGFP載體，并送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.6.4 pMD18-U6-shEGFP載體的構(gòu)建 按照“1.6.3”方法，設(shè)計上游引物F2：5′-GAATTCCTAGTGCACGGTTCCAAATTGGT-3′(斜體為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物R2 ：5′-GGATCCCATGAAAACTTTACTTGCGCGA-3′(斜體為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，克隆得到包含EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)的 U6啟動子。將pMD18-N載體經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ酶切，并用凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與 U6啟動子連接，得到pMD18-U6-N質(zhì)粒；將pMD18-U6-N經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ酶切，凝膠回收后與shRNA連接，得到 pMD18-U6-shEGFP載體，并送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將處于對數(shù)期的293 T細(xì)胞鋪至24孔板內(nèi)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%左右時進(jìn)行下一步試驗。將構(gòu)建好的pMD18-U6-shEGFP、pMD18-U6、pMD18-shEGFP載體分別與pEGFP-N1載體共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。具體方法見表1。

表1 轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染成分 Table 1 Transfected group and compositions

2 結(jié)果與分析

2.1 U6 snRNA基因上游5′-端側(cè)翼基因克隆與序列分析

采用染色體步移法獲得東方粘蟲 U6 snRNA基因上游5′-端側(cè)翼序列并測序，該序列長1 426 bp。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對發(fā)現(xiàn)，該序列下游3′-端與家蠶(Bombyxmori) U6 snRNA基因序列(AY649381)相似度為100%，與黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster) U6 snRNA基因序列(M24605)相似度為96%，與豹紋蝶(Melitaeacinxia) U6 snRNA基因序列(JX878560.1)相似度為96%。由此推斷這些相似序列為東方粘蟲 U6 snRNA基因序列。經(jīng)啟動子在線分析軟件NNPP v. 2. 2 (http://www.fruitfly.org/ seq_tools/ promoter.html) 預(yù)測，東方粘蟲 U6 snRNA 基因上游5′-端側(cè)翼序列有4個可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(圖1)，其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游存在著 TATA box，符合真核生物基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)所具有的特征。

參照Domitrovich等[25]的方法尋找東方粘蟲 U6啟動子元件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列中包含RNA聚合酶Ⅲ啟動子的典型基序，包括遠(yuǎn)端序列元件DSE，近端序列元件PSE及TATA box，DSE由1個能夠與轉(zhuǎn)錄因子Oct-1相結(jié)合的八聚體序列(OCT)，和1個與刺激反式作用因子(stimulated trans-acting factor, STAF)相結(jié)合的SPH元件組成(圖2)。

2.2 東方粘蟲 U6啟動子的克隆

根據(jù)東方粘蟲 U6 snRNA基因上游5′-端側(cè)翼序列，設(shè)計兩對引物F1/R1、F2/R2，以基因組為模板，得到分別含BamHⅠ、Hind Ⅲ與含EcoRⅠ、BamHⅠ的 U6啟動子(圖3)。

加粗字母代表可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) The bold letters mean prediction of transcription start site

OCT, SPH, PSE, TATA-box都用下劃線標(biāo)出，預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)作為+1，并被框出 OCT, SPH, PSE, TATA box were underlined, and start site of the predicted transcription were recorded as +1, and was out of the box.

圖2 東方粘蟲 U6 snRNA基因5′-端側(cè)翼序列分析
Fig.2 Analysis of 5′-flanking region of U6 snRNA gene inM.separata

M. Marker DL 5000; 1. 含BamHⅠ、Hind Ⅲ的 U6啟動子 U6 promoter withBamHⅠ andHind Ⅲ; 2. 含EcoRⅠ、BamHⅠ的 U6啟動子 U6 promoter withEcoRⅠ andBamHⅠ

圖3 具有酶切位點(diǎn)的東方粘蟲 U6啟動子
Fig.3 U6 promoters ofM.separatawith restriction sites

2.3 基因沉默載體的構(gòu)建與雙酶切驗證

為了構(gòu)建基因沉默載體，首先需要對pMD18-T載體進(jìn)行環(huán)化，為此設(shè)計并克隆一段515 bp的片段N，該片段不包含構(gòu)建載體所需要的3個酶切位點(diǎn)：EcoRⅠ、BamHⅠ及Hind Ⅲ。經(jīng)T-A克隆后，雙酶切驗證N片段成功導(dǎo)入pMD18-T載體中(圖4)。隨后分別將 U6、shEGFP及U6-shEGFP片段重組到pMD18-N，構(gòu)建載體pMD18-U6、pMD18-shEGFP及pMD18-U6-shEGFP，雙酶切結(jié)果表明目的片段成功轉(zhuǎn)入載體(圖5)。2.4 RNAi載體轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞的熒光顯微鏡檢測

將載體pMD18-U6、pMD18-shEGFP與pMD18-U6-shEGFP分別與pEGFP-N1共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。將各孔細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下，觀察同一視野下細(xì)胞生長情況及各組熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖6所示：在轉(zhuǎn)染24 h、48 h與72 h后，與pEGFP-N1空白對照、pMD18-U6陰性對照和pMD18-shEGFP陰性對照相比，pMD18-U6-shEGFP的熒光強(qiáng)度均顯著降低，表明shEGFP可以在293 T細(xì)胞中成功表達(dá)并引起熒光蛋白的表達(dá)量降低。

M. Marker DL 5000

M. Marker DL 5000

圖6 轉(zhuǎn)染后不同時間293 T細(xì)胞熒光Fig.6 293 T cell fluorescence after transfected by different vectors with pEGFP-N1

3 討 論

U6啟動子的3′-端序列一般較為保守，但5′-端側(cè)翼序列及其長度往往差異較大，用常規(guī)的RACE等技術(shù)很難克隆到啟動子的全長序列。本研究采用染色體步移技術(shù)，首先分別用4個限制性內(nèi)切酶(DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ)對東方粘蟲基因組DNA進(jìn)行酶切，將其分成4個帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的DNA文庫，添加特異性接頭后設(shè)計上游引物，再參照近源物種家蠶和果蠅 U6 snRNA的3′-端共有序列設(shè)計下游特異性引物，用染色體步移試劑盒獲得5′-端側(cè)翼片段并逐級向前推動，最終克隆出東方粘蟲 U6啟動子序列。

對克隆的 U6啟動子序列分析表明，該序列包含OCT，SPH， DSE， PSE及TATA-box等RNA pol Ⅲ啟動子特有的序列元件，與有關(guān)文獻(xiàn)[25-27]報道的人類、雞及水牛等動物的 U6啟動子特征元件一致。經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，該 U6啟動子3′-端序列與家蠶及果蠅 U6 snRNA基因部分序列均有很高的同源性(分別為100%和96%)。因此，確定此序列為東方粘蟲 U6 snRNA基因，其上游5′-端側(cè)翼序列包含東方粘蟲的 U6啟動子。

U6啟動子能否有效驅(qū)動RNA的表達(dá)是檢驗 U6 snRNA是否包含整個啟動子序列的關(guān)鍵。為了驗證東方粘蟲 U6啟動子序列是否完整，本研究用siDicer軟件對pEGFP-N1基因序列進(jìn)行siRNA預(yù)測分析，隨機(jī)挑選1個siRNA進(jìn)行shRNA合成，并將其構(gòu)建到由東方粘蟲 U6啟動子驅(qū)動的shRNA載體中。細(xì)胞轉(zhuǎn)染證實，在24、48、72 h時，試驗組熒光與空白對照組和陰性對照組均有顯著差異，而空白對照組和各陰性對照組之間熒光則無明顯差異。由此表明，本研究克隆獲得的東方粘蟲 U6 snRNA包含完整的 U6啟動子序列，能成功驅(qū)動shRNA的表達(dá)并可用于后續(xù)基因沉默載體的構(gòu)建。

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ZHANG X X,LIU Q Y,DENG Y F,etal.Cloning and identification of bufalo RNA polymerase Ⅲ promoters [J].JournalofSouthernAgriculture,2014,45(5):858-863(in Chinese with English abstract).

(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Cloning and Functional Verification of U6 Promoter fromMythimnaseparata(Walker)

WANG Gaozhen, JIN Duo, WU Wenjun and QI Zhijun

(Institute of Pesticide Science, College of Plant Protection, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100,China)

In order to obtain constantly short interference RNA(siRNA) , the 1 426 bp 5′- flanking promoter sequence of U6 snRNA gene ofMythimnaseparata(Walker) was cloned by the method of Genome Walking, as well as its function was verified in this study. Based on bioinformatics analysis, the results showed that the promoter fragment contained polymerase Ⅲ core promoter elements SPH, OCT, DSE, PSE and TATA box. The observation of expression level enhanced green fluorescent protein EGFP after being transfected with RNA interference (RNA interference, RNAi) , the vectors by fluorescence microscope showed that the U6 promoter fragment drived the expression of shEGFP successfully. This study had established a foundation for further construction of RNAi vectors which can silence V-ATPase subunit H.

Mythimnaseparate(Walker); RNAi; U6 promoter; Functional verification

2016-05-19 Returned 2016-06-28

The National Natural Science Foundation of China (No. 31371958).

WANG Gaozhen, male, master student. Research area:pesticide toxicology. E-mail:wanggaozhen@nwsuaf.edu.cn

QI Zhijun, male, associate professor. Research area:pesticide molecular toxicology. E-mail:qzhij@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-06-05

2016-05-19

2016-06-28

國家自然科學(xué)基金(31371958)。 第一作者：王高振，男，碩士研究生，從事農(nóng)藥毒理學(xué)研究。E-mail：wanggaozhen@nwsuaf.edu.cn 通信作者：祁志軍，男，副教授，主要從事農(nóng)藥分子毒理學(xué)研究。E-mail：qzhij@nwsuaf.edu.cn

Q789

A

1004-1389(2017)06-0939-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170605.1728.036.html