馬俊英，葛武鵬，姜 琪，房若愚，梁秀珍，吳小勇，耿 煒

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.吉林大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130062；3.陜西飛天乳業(yè)有限公司，陜西寶雞 721100；4.咸陽市食品藥品檢測檢驗中心，陜西咸陽 712000；5.咸陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，陜西咸陽 712000)

基于PCR-DGGE技術(shù)分析牧區(qū)酸馬奶中乳酸菌多樣性

馬俊英1，葛武鵬1，姜 琪2，房若愚1，梁秀珍3，吳小勇4，耿 煒5

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.吉林大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130062；3.陜西飛天乳業(yè)有限公司，陜西寶雞 721100；4.咸陽市食品藥品檢測檢驗中心，陜西咸陽 712000；5.咸陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，陜西咸陽 712000)

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)，分析采自新疆和內(nèi)蒙古6個牧區(qū)的混合酸馬奶樣品中乳酸菌的總DNA，利用PCR擴增其16S rRNA的V3區(qū)段，建立由標(biāo)準(zhǔn)菌株組成的參考梯度，對其進(jìn)行PCR-DGGE，藉此鑒定菌株，對不能鑒定的菌株切膠回收進(jìn)行測序鑒定，并分析比較優(yōu)勢菌株。結(jié)果表明：共鑒定出10種乳酸菌株，包括植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、馬乳酒乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、詹氏乳桿菌、短乳桿菌、瑞士乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌及干酪乳桿菌；且嗜熱鏈球菌為所有樣品中的共有菌株；馬乳酒乳桿菌、短乳桿菌及瑞士乳桿菌是新疆酸馬奶中的優(yōu)勢菌株，而內(nèi)蒙古樣品中的優(yōu)勢菌株不盡相同。

PCR-DGGE；乳酸菌；酸馬奶；優(yōu)勢菌株

內(nèi)蒙古和新疆位于中國北方邊疆地區(qū)，均屬溫帶大陸性氣候，是中國牧區(qū)的典型代表。該地區(qū)獨特的自然條件蘊藏著豐富的乳酸菌資源。長期的自然選擇使得乳酸菌具有與當(dāng)?shù)丨h(huán)境相適應(yīng)的特性。幾千年來，牧民沿襲傳統(tǒng)的發(fā)酵模式制作各種乳制品使得這種特殊的資源得以保存。酸馬奶是一種由鮮馬奶接種少量已發(fā)酵馬奶制成的低酒精含量的發(fā)酵乳飲料，其生產(chǎn)工藝并非完全模式化，一般通過乳酸菌和酵母菌自然發(fā)酵而成。來源于原料奶和環(huán)境的乳酸菌是發(fā)酵過程的主要菌種，對乳制品風(fēng)味和質(zhì)地的形成起著至關(guān)重要的作用[1]。牧區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶制作工藝開放，乳酸菌資源豐富，酸馬奶已成為近年來乳酸菌開發(fā)利用的重要資源[2]。然而，傳統(tǒng)酸馬奶中的微生物組成和數(shù)量常因地區(qū)、氣候、制作方法、季節(jié)等的不同而略有差異。因此，對不同地區(qū)酸馬奶中乳酸菌多樣性的研究具有重要意義。

自Ampe等[3]首次將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳(Polymerase chain reaction-denatured gradicnt gel electrophoresis,PCR-DGGE)技術(shù)應(yīng)用于食品微生物研究以來[4]，該技術(shù)已廣泛用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物種群結(jié)構(gòu)和種群動力學(xué)研究[5-6]。目前，PCR-DGGE作為研究復(fù)雜微生物體系的一項較為成熟的常規(guī)技術(shù)，可用于分析優(yōu)勢菌種，最大程度地反映樣品中微生物菌群。Ma等[7]采用PCR-DGGE方法對含有乳酸菌的乳制品進(jìn)行菌群組成分析。Porcellato等[8]將高分辨率熔解分析(high-resolution melt analysis)應(yīng)用到PCR-DGGE條帶的鑒定中，快速將乳制品中乳酸菌鑒定到種的水平。因此，本研究采用PCR-DGGE技術(shù)對新疆和內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵的酸馬奶中乳酸菌的組成進(jìn)行分析，并鑒定酸馬奶中的優(yōu)勢乳酸菌菌種，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來源 酸馬奶樣品：在新疆伊犁地區(qū)4個牧區(qū)和內(nèi)蒙古2個牧區(qū)采集30份不同牧民家庭自制傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶，每個牧區(qū)樣品采集數(shù)為5。裝入100 mL無菌樣品瓶中，使用冰盒運輸至實驗室，放入4 ℃冰箱，備用。根據(jù)采樣地區(qū)將30份酸馬奶混合成6份具有代表性的樣品。采樣地點分布如表1所示。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：試驗所用的乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院測試中心提供。

表1 新疆和內(nèi)蒙古地區(qū)奶渣樣品的采樣地分布情況及樣品編號Table 1 Distribution of sample sites and number of samples koumiss from Xinjiang and Inner Mongolia

1.1.2 試劑與儀器 試劑：Takara PremixTaq試劑由寶生物工程(大連)有限公司提供；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；鏈霉蛋白酶(Roche，中國上海)、溶菌酶、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED(四甲基乙二胺)、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉、尿素，試劑均為分析純，購于北京索萊寶科技有限公司。MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行配制。

儀器：包括ZONKIA HC-3018R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、PCR儀(PTC-200型)、變性梯度凝膠電泳裝置(Bio-Rad,USA)、凝膠成像儀E1617-T130 plus(Bio-Rad，USA)、電泳儀DYY-6C(北京六一)、微量移液器(德國 Eppendorf 公司)、生化培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)、立式壓力蒸汽滅菌器 YXQ-LS-50SII-01-00(上海博迅實業(yè)有限公司)、電子分析天平 SE-6001F(美國 Ohaus)、超凈工作臺 SW-CJ-2D 型(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的活化及其基因組DNA的提取 為更好地鑒定樣品的DGGE條帶，用經(jīng)平板培養(yǎng)法從酸馬奶中分離得到的7種主要乳酸菌[2,10-11]標(biāo)準(zhǔn)菌作為參考。這7種乳酸菌分別為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ATCC14917，嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)ATCC43121，發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)ATCC14931，短乳桿菌(Lactobacillusbreris)ATCC367，瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)ATCC15009，嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles)ATCC14485和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)ATCC393。將標(biāo)準(zhǔn)菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)，取1.5～2 mL OD600=1純化后的標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌懸液，離心1 min(4 ℃,12 000 r/min)，棄去上清液，再加入與培養(yǎng)液等量的生理鹽水(w=0.85%) 懸浮菌體，12 000 r/min(4 ℃)下離心1 min(重復(fù)2～3次) 后，加入適量無菌生理鹽水，振蕩混勻即可。將收集的菌體按照Takara Mini BEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0的說明提取菌株基因組DNA，置于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 酸馬奶樣品中乳酸菌總DNA提取 酸馬奶樣品總DNA提取參照EL-baradei等[12]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。5 mL酸馬奶樣品與5 mL質(zhì)量濃度為20 g/L檸檬酸鈉溶液振蕩混勻后，加10 mg鏈霉蛋白酶和20 μL β-巰基乙醇，50 ℃水浴加熱3 h。菌體經(jīng)洗滌后，利用溶菌酶結(jié)合SDS變性劑裂解菌體，采用酚仿和異丙醇分離純化總DNA，經(jīng)8 g/L瓊脂糖電泳檢測后，于-20 ℃保存，備用[13]。

1.2.3 PCR擴增乳酸菌基因組DNA16S rRNA的V3區(qū)段 細(xì)菌16S rRNA的可變區(qū)序列因不同細(xì)菌而異，而恒定區(qū)序列基本保守，所以可以利用恒定區(qū)序列設(shè)計引物將 16S rRNA片段擴增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。16S rRNA 的V3區(qū)段是其中的高保守區(qū)[14]。采用Hao等[15]報道的基因引物進(jìn)行PCR擴增。用于DGGE分析的樣品經(jīng)過2輪PCR 擴增獲得。以第1步擴增的產(chǎn)物為模版進(jìn)行第2次擴增[16]，使得目的片段濃度增大[1]。以W01和W012為引物，以樣品總DNA為模板，對包含16S rRNA的V3區(qū)段的700 bp的片段進(jìn)行PCR擴增。25 μL的反應(yīng)體系中包含Takara PremixTaq12.5 μL、模板2 μL、上下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，添加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)條件：96 ℃預(yù)變性4 min；96 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。接著以第1輪PCR產(chǎn)物做模板，以帶GC夾(GC-Clamp)的引物(表2)GC-HDA1和HDA2對200 bp左右的V3區(qū)進(jìn)行PCR擴增(表2中[AC]和[GT]表示簡并引物)。在50 μL反應(yīng)體系中包含Takara PremixTaq25 μL、模板2 μL、上下游引物(10 μmol /L)各1 μL，添加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，30個循環(huán);68 ℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物用2 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 乳酸菌基因擴增引物Table 2 Primers used for cloning of the lactic acid bacteria gene

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)階梯的建立 以7種標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA為模板，用引物GC-HDA1/HDA2分別對其V3區(qū)進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與樣品的PCR擴增相同，再按照閆苗章等[17]的方法，采用Bio-Rad公司的DcodeTM基因突變檢測系統(tǒng)對這7種標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物及其混合物進(jìn)行DGGE分析，建立標(biāo)準(zhǔn)階梯。其中凝膠的丙烯酰胺凝膠質(zhì)量濃度為8 g/L，變性梯度為40%～60%，上樣量為25 μL，先在60 ℃下以50 V電泳1 h，再于65 V電泳14 h，核酸染料染色30 min，用Bio-Rad DOC 1000凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.2.5 酸馬奶樣品PCR產(chǎn)物的DGGE分析 按照“1.2.4”建立標(biāo)準(zhǔn)階梯的方法，對酸馬奶樣品中乳酸菌第2輪的PCR產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物的混合物進(jìn)行DGGE分析。

1.2.6 凝膠回收測序及種屬歸類 將DGGE圖譜中未能與標(biāo)準(zhǔn)階梯中菌種比對且位置不同的代表條帶切下浸泡于100 μL的ddH2O中4 ℃過夜。吸取2 μL浸泡液作為模板，以不帶GC夾的HDA1和HDA2為引物進(jìn)行PCR 擴增。將擴增產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，挑取陽性克隆(白色)接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌過夜。菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。DGGE優(yōu)勢條帶的測序結(jié)果與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)比對分析[17]，進(jìn)行種屬歸類。

2 結(jié)果與分析

2.1 參考階梯的建立

為確認(rèn)參考階梯中各個條帶所代表的菌種，將7種標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR產(chǎn)物分別加入單獨泳道(1～7) ，其混合物加入另外一個泳道M。本試驗采用的7種標(biāo)準(zhǔn)菌株可分別在DGGE變性膠中得到鑒別。

如圖1所示，7種標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR產(chǎn)物在變性膠中清晰地分開。泳道1～7代表7種不同的標(biāo)準(zhǔn)菌株，通過參考階梯中各個菌種在DGGE圖譜中的位置可以確定參考階梯中各條帶代表的菌種。因此，可以用此參考階梯來確定酸馬奶樣品中乳酸菌的部分菌種。

2.2 酸馬奶樣品中乳酸菌DGGE分析

提取酸馬奶樣品中細(xì)菌總DNA，用特異性引物擴增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)，對不同地區(qū)的酸馬奶樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳(圖2)，圖中不同地區(qū)的酸馬奶中乳酸菌DGGE圖譜有一定的差異。

6個地區(qū)的酸馬奶樣品的DGGE電泳圖中(圖2)有23個特異性條帶，其中7個可以用參考階梯確定。已確定的菌種包括ATCC14917(a)、ATCC43121(b)、ATCC14931(e)、ATCC367(g)、ATCC15009(i)、ATCC14485(p)和ATCC393(r)。其余的條帶(c、d、f、h、j、k、l、m、n、o、q、s、t、u、v、w)切膠回收測序。測序結(jié)果登陸NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對分析。

結(jié)合DGGE圖譜(圖2)、Blast同源性比對結(jié)果(表3)及表4可以看出，嗜熱鏈球菌 ATCC14485的條帶p出現(xiàn)在所有的酸馬奶樣品中，但樣品3和樣品6中條帶亮度較弱。確定為馬乳酒乳桿菌(Lactobacilluskefiranofaciens) 的條帶d，短乳桿菌ATCC367的條帶g，瑞士乳桿菌ATCC15009的條帶i 出現(xiàn)在所有新疆地區(qū)的酸馬奶樣品(1、2、3、4) 中。條帶的亮度反映各個菌種在整個菌群中的相對比例[18]。因此，條帶p出現(xiàn)的強亮度和高頻率表明嗜熱鏈球菌是酸馬奶樣品中的共有菌種，而馬乳酒乳桿菌(條帶d)，短乳桿菌(條帶 g)和瑞士乳桿菌(條帶i)是新疆酸馬奶中的優(yōu)勢菌種。采自同一地區(qū)的樣品1和樣品2中，嗜熱鏈球菌(條帶p)和瑞士乳桿菌(條帶i) 是其共有優(yōu)勢菌種，而樣品2中條帶的數(shù)量又反映其樣品中乳酸菌較為豐富；采自同一地區(qū)的樣品3和樣品4除含共有優(yōu)勢菌種瑞士乳桿菌(條帶i)外，樣品4還有其獨特的優(yōu)勢菌種嗜熱鏈球菌(條帶p) 和發(fā)酵乳桿菌(條帶e)。

M.參考階梯Reference ladder 1. ATCC393; 2. ATCC14485; 3. ATCC15009; 4. ATCC367; 5. ATCC14931; 6. ATCC43121; 7. ATCC14917;A～G表示1～7各標(biāo)準(zhǔn)菌在圖譜中的位置 A-G represent the location of strain1-7 in profile

圖1 建立參考階梯的標(biāo)準(zhǔn)菌株的DGGE圖譜
Fig.1 Denaturing gradient gel electrophoresis profile of strains used in identification ladder for reference

3 討 論

雖然樣品1、2、3、4均來自新疆牧區(qū)，但樣品1和樣品2采自大陸性半干旱氣候區(qū)的新疆伊犁新源縣，而樣品3和樣品4采自寒溫帶亞干旱氣候區(qū)的新疆伊犁昭蘇縣，氣候的差異使優(yōu)勢菌株不同。采自中溫帶半干旱大陸性氣候的樣品5中乳酸乳球菌(條帶j)和嗜熱鏈球菌(條帶p) 是其優(yōu)勢菌種，而采自溫帶季風(fēng)型大陸性氣候區(qū)的樣品6中嗜熱鏈球菌則是其優(yōu)勢菌種。樣品5和樣品6的采樣地區(qū)雖鄰近，但因所處氣候區(qū)的不同，其優(yōu)勢菌株差異也是很明顯的。

這些結(jié)果表明，不同地理條件、生產(chǎn)環(huán)境的酸馬奶有著其特有的菌種。同一地區(qū)不同牧民家庭生產(chǎn)的酸馬奶中的菌種也會因為各自不同的生產(chǎn)方式及作坊環(huán)境而產(chǎn)生差異。此外，酸馬奶還會受到馬匹品種的影響[19]。

M.參考階梯 Reference ladder; A.ATCC14917; B. ATCC43121; C.ATCC14931; D. ATCC367; E. ATCC15009; F. ATCC14485; G. ATCC393;1. 新疆伊犁新源縣那拉提草原樣品 Narat grassland in Xinyuan,Yili,Xinjiang,China；2.新疆伊犁新源縣馬場樣品 Stud-farm in Xinyuan,Yili,Xinjiang,China；3.新疆伊犁昭蘇縣夏特牧場樣品 Xiate pasture in Zhaosu ,Yili,Xinjiang,China；4.新疆伊犁昭蘇縣阿克達(dá)拉鄉(xiāng)樣品 Akedala in Zhaosu,Yili,Xinjiang,China；5.內(nèi)蒙古錫林郭勒盟阿巴噶旗樣品 Abaga Banner in Xilinguole Inner Mongolia,China；6.內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗樣品 Bahrain right Banner in Chifeng,Inner Mongolia,China.

圖2 酸馬奶樣品中乳酸菌多樣性的DGGE圖譜
Fig.2 Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of the lactic acid bacteria community from koumiss

雖然6個樣品中的細(xì)菌菌群分布不盡相同，但是采自相同地區(qū)的樣品的優(yōu)勢菌種卻較為相似。由此推測酸馬奶中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)上的差異除因地區(qū)、氣候、季節(jié)等的不同而存在差異外，也可能與各家庭生產(chǎn)制作工藝和游牧生活方式的不同有關(guān)[15]。孟和畢力格等[20]從內(nèi)蒙古錫林浩特市的酸馬奶樣品中鑒定出干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、棒狀乳桿菌棒狀亞種(Lactobacilluscoryniformissubsp.coryniformis)、彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)、馬乳酒乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌等乳酸菌。Liu等[10]采用 16S rRNA 基因全序列鑒定內(nèi)蒙古酸馬奶中的優(yōu)勢乳酸菌分別為植物乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、瑞士乳桿菌、耐久腸球菌(Enterococcusdurans) ，腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) 及嗜熱鏈球菌；朱丹宇等[21]鑒定新疆酸馬奶中的優(yōu)勢乳酸菌有嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌；本研究中得出酸馬奶中常見的植物乳桿菌，嗜酸乳桿菌，馬乳酒乳桿菌，發(fā)酵乳桿菌，瑞士乳桿菌，乳酸乳球菌，嗜熱鏈球菌及干酪乳桿菌，此外，還鑒定到詹氏乳桿菌，短乳桿菌這些少有的菌株，嗜熱鏈球菌為所有樣品中的共有優(yōu)勢菌株，而馬乳酒乳桿菌，短乳桿菌及瑞士乳桿菌為新疆地區(qū)酸馬奶中的優(yōu)勢菌種。且新疆地區(qū)的優(yōu)勢菌株與Hao等[15]利用DGGE結(jié)合種特異性PCR的方法分析新疆伊犁牧區(qū)酸馬奶中乳酸菌的多樣性時的研究結(jié)果一致。內(nèi)蒙古地區(qū)兩份樣品的優(yōu)勢菌株差異較大，其優(yōu)勢菌株分別為乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌，并且嗜熱鏈球菌的條帶在兩樣品中的亮度也是迥異。新疆兩采樣地及內(nèi)蒙古兩采樣地的優(yōu)勢菌株也因氣候區(qū)的不同呈現(xiàn)出差異。

表4 各樣品中鑒定出的乳酸菌菌種Table 4 Identification results of lactic acid bacteria in koumiss samples

注：“+”表示有，“-”表示無。

Note:“+” positive,“-” negative.

本研究中，利用DGGE分析檢測酸馬奶樣品中的乳酸菌時，檢測到的一些菌株DNA，經(jīng)培養(yǎng)卻不能在選擇培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)可見的菌落，這可能是由于這些DNA來源于一些之前就存活于酸馬奶樣品中但是在低pH環(huán)境下凋亡的細(xì)菌細(xì)胞[15]。也可能是一些乳酸菌因低pH環(huán)境處于活的非可培養(yǎng)態(tài)(Viable but non-culturable，VBNC)的細(xì)胞[22]。采用 PCR-DGGE技術(shù)方法分析不同地區(qū)酸馬奶中乳酸菌多樣性，可較為客觀地反映出傳統(tǒng)工藝制作的酸馬奶中乳酸菌的微生物區(qū)系，對于全面揭示自然發(fā)酵酸馬奶優(yōu)勢菌群組成，具有較高的參考價值。通過不同氣候區(qū)地區(qū)的比較發(fā)現(xiàn)各地優(yōu)勢菌株的差異，若要系統(tǒng)探明氣候區(qū)與菌株的相關(guān)性，還需擴大研究范圍做深入研究。

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(責(zé)任編輯：史亞歌 Responsible editor:SHI Yage)

Diversity of Lactic Acid Bacteria in Koumiss from Xinjiang and Inner Mongolia by PCR - DGGE

MA Junying1,GE Wupeng1,JIANG Qi2,FANG Ruoyu1,LIANG Xiuzhen3,WU Xiaoyong4and GENG Wei5

(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.College of Food Science and Engineering,Jilin University,Changchun 130062,China； 3.Shaanxi Feitian Dairy Co.Ltd.,Baoji Shaanxi 712000,China; 4.Xianyang Food and Drug Inspection Center,Xianyang Shaanxi712000,China;5. Xianyang Product Quality Supervision and Testing Institute,Xianyang Shaanxi 712000,China)

After total DNA was extracted from koumiss samples from Xinjiang and Inner Mongolia,the V3 region of 16S rRNA gene was amplified by PCR,and a reference ladder derived from amplification products of known lactic acid bacteria was constructed at the same time,then the PCR amplified products were subject to identify the strain by using polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE),the bands which could not be identified by reference ladder were excised from the gel and sequenced identification,so as to compare and analyze the dominant species.The results showed that 10 dominant species of lactic acid bacteria were identified from the samples.It includedLactobacillusplantarum,Lactobacillusacidophilus,Lactobacilluskefiranofaciens,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusjensenii,Lactobacillus brevis,Lactobacillushelveticus,Lactococcuslactis,StreptococcusthermophilusandLactobacilluscasei; moreover,Streptococcusthermophilesappeared in all samples,the dominant species of samples in Xinjiang wereLactobacilluskefiranofaciens,LactobacillusbrevisandLactobacillushelveticuswhile the dominant species were much different from the samples of Inner Mongolia.

Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE)；Lactic acid bacteria；Koumiss；Dominant species

2016-05-23 Returned 2016-06-12

The Major Product Projects of Strategic Emerging Industries of Shaanxi Province,China(No.2015KTCQ03-08,No.2016KTCQ03-03).

MA Junying,female,master student.Research area:food science.E-mail：winee100@126.com

GE Wupeng,male,Ph.D,associate professor.Research area: food science.E-mail：josephge@sina.com

日期：2017-06-05

2016-05-23

2016-06-12

陜西省科技廳戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)重大產(chǎn)品(群)項目(2015KTCQ03-08，2016KTCQ03-03)。 第一作者：馬俊英，女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：winee100@126.com 通信作者：葛武鵬，男，博士，副教授，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：josephge@sina.com

S512.1；S330

A

1004-1389(2017)06-0956-07

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