劉 為，張 琳，田 偉，鄧勝利

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系 貴州省麻醉與器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義市播州區(qū)人民醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563100；3 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科， 貴州 遵義 563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

Urocortin I后處理對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位及活性氧自由基的影響

劉 為1，張 琳1，田 偉2，鄧勝利3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系 貴州省麻醉與器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義市播州區(qū)人民醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563100；3 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科， 貴州 遵義 563099)

目的 觀察Urocortin I后處理對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位及活性氧自由基的影響。方法 利用ALC-HP型離體心臟灌注裝置分離成年大鼠心肌細(xì)胞，將培養(yǎng)1 d后存活狀態(tài)良好的細(xì)胞隨機(jī)分為正常組(N組)、缺氧/復(fù)氧組(HR組)、UrocortinⅠ后處理組(Ucn I組)、5-羥葵酸拮抗Urocortin Ⅰ組(5-HD+UcnⅠ組)。N組：37 ℃培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)150 min；HR組：缺氧40 min后，復(fù)氧110 min；Ucn Ⅰ組：缺氧40 min復(fù)氧10 min，然后Ucn Ⅰ處理30 min再復(fù)氧70min；5-HD+Ucn Ⅰ組：特異性線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)拮抗劑5-HD處理10 min后，在含Ucn Ⅰ的培養(yǎng)基中處理30 min，余處理同Ucn Ⅰ組。各組于復(fù)氧末加入熒光探針并用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)及活性氧自由基(ROS)的變化。結(jié)果 ①M(fèi)MP變化：N組心肌細(xì)胞MMP較其余各組高(P<0.01)；Ucn I組雖低于N組，但高于HR組及5-HD+Ucn I組(P<0.05)；5-HD+Ucn I組與HR組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。②ROS變化：N組心肌細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度低于其余各組(P<0.01)； Ucn I組及5-HD+Ucn I組較HR組低(P<0.01)，但5-HD+Ucn I組高于Ucn I組(P<0.01)。結(jié)論 Urocortin I后處理能抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性氧自由基的生成，并抑制線粒體膜電位的衰減，其機(jī)制與其開放線粒體ATP敏感性鉀通道有關(guān)。

Urocortin I后處理；活性氧自由基；線粒體膜電位；線粒體敏感性鉀通道

心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是各種缺血心臟疾病治療時(shí)共有的病理生理過程，如何減輕或者避免IRI一直被臨床廣為關(guān)注。線粒體活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的爆發(fā)及膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的下降與心肌IRI關(guān)系密切。Urocortin I是一種在心臟中表達(dá)的內(nèi)源性神經(jīng)肽，無論在離體或者在體條件下均被證實(shí)具有心肌保護(hù)作用[1]。但其保護(hù)作用與ROS及MMP的關(guān)系尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過分離成年大鼠心肌細(xì)胞并模擬臨床缺氧/復(fù)氧損傷過程，觀察Ucn I后處理對(duì)心肌細(xì)胞線粒體ROS生成及MMP的影響，探討其心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，周齡為16～20周，體重約200 g左右，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005。

1.2 試劑與儀器 UrocortinⅠ、5-羥葵酸、M199培養(yǎng)基、牛血清白蛋白(BSA)、Ⅱ型膠原酶、乙二醇雙四乙酸(EGTA)、層黏連蛋白(Laminin) 均從美國(guó)Sigma公司購置，活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，中國(guó))、活體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位紅色熒光測(cè)定試劑盒(杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，中國(guó))；ALC-HP型離體心臟灌注裝置(北京吉安得爾科技有限公司，中國(guó))、超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó))、高壓滅菌鍋(TOMY公司，日本)、BS224S電子天平(賽多利思公司，德國(guó))、純水處理器(Millipore，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理 參照文獻(xiàn)[2]分離成年大鼠心肌細(xì)胞。將分離培養(yǎng)1 d后的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常組(N組)、缺氧/復(fù)氧組(HR組)、Urocortin I后處理組(Ucn I組)、5-羥葵酸拮抗Urocortin Ⅰ組(5-HD+Ucn Ⅰ組)。N組：37 ℃ 95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)150 min；HR組：缺氧40 min后，復(fù)氧110 min；UcnⅠ組：缺氧40 min后給予10 min的正常復(fù)氧過程，然后在含Ucn Ⅰ的培養(yǎng)基中處理30 min后復(fù)氧70 min；5-HD+Ucn Ⅰ組：缺氧后先用特異性線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)拮抗劑5-HD處理10 min后行Ucn Ⅰ后處理30 min，余處理同UcnⅠ組。各組細(xì)胞于復(fù)氧末進(jìn)行ROS和MMP檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)ROS變化 ROS檢測(cè)按碧云天活性氧檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作：實(shí)驗(yàn)前，先按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/升。吸除培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，覆蓋細(xì)胞孔表面，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，然后用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。其倒置顯微鏡觀察條件：488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)。若綠色熒光增強(qiáng)，表明ROS生成增多；同時(shí)在相同波長(zhǎng)下使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各組心肌細(xì)胞相對(duì)熒光單位(relative fluorescence units，RFU)：若RFU增高，表明ROS生成增多。

1.5 檢測(cè)MMP變化 于復(fù)氧末按照杰美基因GENMED活體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位紅色熒光(TMRM)測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作：染色液A置入冰槽里融化，稀釋液B放入37 ℃恒溫水槽里預(yù)熱。移出10 μL染色液A到1.5 mL離心管，加入890 μL稀釋液B，混勻后標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里進(jìn)行如下操作。吸出培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液到15 mL錐形離心管(收集懸浮細(xì)胞)，加入1 mL清理液C到細(xì)胞培養(yǎng)孔，作用30 s后移出清理液C到同一個(gè)15 mL錐形離心管(收集洗脫細(xì)胞)，加入0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液500 μL，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育3 min，輕輕抖動(dòng)細(xì)胞板，使細(xì)胞脫落。吸盡胰酶后，加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，移入15 mL離心管，臺(tái)式離心機(jī)離心5 min，速度300 g，吸去上清液，加入50 μL清理液C，混勻細(xì)胞顆粒群，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入450 μL染色工作液，輕度渦旋振蕩2 s，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min后，離心5 min，速度300 g，吸去上清液，加入500 μL清理液C?；靹蚝笠瞥?0 μL至載玻片上，即刻行載玻片壓片并觀察熒光變化；移出100 μL到黑色96孔板里即刻用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定相對(duì)熒光單位(RFU)。四甲基羅丹明甲酯染料(TMRM)，可選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，通過熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體膜電位的變化，即內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。電位高，TMRM聚集于線粒體，顯示為強(qiáng)力紅色或桔紅色；電位破壞，TMRM則彌散在胞漿內(nèi)，導(dǎo)致熒光減弱。其倒置顯微鏡觀察條件：540 nm激發(fā)波長(zhǎng)，580 nm發(fā)射波長(zhǎng)。紅色或桔紅色熒光減弱表明線粒體膜電位受到損害；于相同波長(zhǎng)下使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)得的RFU值降低則表明線粒體膜電位受到破壞。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞MMP變化情況 各組心肌細(xì)胞MMP熒光結(jié)果(見圖1、表1)。其熒光強(qiáng)度變化：N組心肌細(xì)胞MMP熒光強(qiáng)度高于其余各組(P<0.01)；Ucn I組雖較正常組低，但高于 HR組及5-HD+Ucn I組(P<0.05)，而5-HD+Ucn I組與HR組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

A：N組；B：HR組；C：Ucn I組；D：Ucn I+5-HD組圖1 各組心肌細(xì)胞MMP熒光圖(×100)

組別相對(duì)熒光強(qiáng)度N2.314±0.359HR0.283±0.045aUcnI1.043±0.064abUcnI+5-HD0.289±0.064ac

a：與N組相比，P<0.01；b：與HR組相比，P<0.05；c：與Ucn I組相比，P<0.05。

2.2 各組心肌細(xì)胞ROS變化情況 各組心肌細(xì)胞ROS熒光結(jié)果(見圖2、表2)。其熒光強(qiáng)度變化：與其余各組相比，N組心肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度相對(duì)較低(P<0.01)；Ucn I組及5-HD+Ucn I組雖高于N組，但低于HR組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Ucn I組低于5-HD+Ucn I組，兩者之間仍表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表2。)

A：N組；B：HR組；C：Ucn I組；D：Ucn I+5-HD組。圖2 各組心肌細(xì)胞ROS熒光圖(×100)

組別相對(duì)熒光強(qiáng)度N0.835±0.058HR1.341±0.077aUcnI1.157±0.054abUcnI+5-HD1.249±0.091abc

a：與N組相比，P<0.01；b：與HR組相比，P<0.01；c：與Ucn I組相比，P<0.01。

3 討論

如何減輕或者避免IRI一直是臨床與科研工作的重點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)：在缺血后再給予幾次短暫、反復(fù)的“缺血-再灌注”處理可以顯著減少缺血心肌梗死面積且能有效地防止內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂，從而對(duì)缺血心肌產(chǎn)生保護(hù)作用[3]；這種策略被稱為“缺血后處理”(ischemic postconditioning，IPC)。隨著研究的深入，學(xué)者又發(fā)現(xiàn)給予某些作用于特異靶點(diǎn)的藥物進(jìn)行藥物后處理同樣具有抗IRI作用[4]。因此近來研究逐漸圍繞著藥物后處理進(jìn)行，并逐漸成為研究的新熱點(diǎn)與新方向[5]。

線粒體作為細(xì)胞活動(dòng)的“能量工廠” ，細(xì)胞的多種需能過程及生長(zhǎng)與凋亡均受到線粒體的調(diào)控。其膜上線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)在生理狀態(tài)下的周期性開放與維持線粒體內(nèi)外電化學(xué)的平衡狀態(tài)及線粒體膜電位的形成等方面具有重要的意義[6]。線粒體氧化磷酸化生成ATP、運(yùn)輸線粒體蛋白、維持鈣離子穩(wěn)態(tài)、回收質(zhì)子等功能的實(shí)現(xiàn)有賴于正常線粒體膜電位的維持。此外，線粒體也是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所。生理狀態(tài)下，ROS是線粒體呼吸鏈的必然產(chǎn)物，在體內(nèi)抗氧化酶和抗氧化劑的作用下保持著動(dòng)態(tài)平衡。而在缺血再灌注過程中，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)在大量ROS產(chǎn)生的不利因素下開放，造成線粒體膜電位降低，最終使細(xì)胞在增多的細(xì)胞色素C等促凋亡蛋白的影響下趨于凋亡[7-8]。本實(shí)驗(yàn)前期研究證實(shí)：Urocortin I可通過保持線粒體呼吸功能與呼吸酶的活性[9]及穩(wěn)定線粒體膜電位[10-11]從而發(fā)揮抗IRI效應(yīng)。但其心肌保護(hù)效應(yīng)與ROS及MMP的相關(guān)性尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)：與HR組相比，N組心肌細(xì)胞MMP熒光強(qiáng)度相對(duì)較高，說明缺氧復(fù)氧可導(dǎo)致線粒體膜電位下降，這與王亞東等[12-13]研究結(jié)果一致。而Ucn I組較HR組及5-HD+Ucn I組高，但5-HD+Ucn I組與HR組相比MMP熒光值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明Ucn I后處理能在一定程度上抑制MMP的下降，且抑制作用與mitoKATP通道有關(guān)。其機(jī)制可能是：mitoKATP通道的活性在Ucn I的作用下增強(qiáng)，K+順電化學(xué)梯度進(jìn)入線粒體，線粒體基質(zhì)由于基質(zhì)內(nèi)滲透壓的增高而發(fā)生腫脹，維持了膜間隙結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定，阻止腺嘌呤核苷酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而維持了缺氧復(fù)氧過程中的能量供給；同時(shí)，腫脹的線粒體基質(zhì)使肌酸激酶和腺嘌呤核苷酸移位酶的功能性耦聯(lián)增強(qiáng)，更多的肌酸將被線粒體磷酸化，這有利于能量向細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)移，從而減少了線粒體ATP的耗竭，兩者均能抑制mPTP開放[14]，從而維持線粒體膜電位的穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：與其余各組相比，N組心肌細(xì)胞ROS濃度相對(duì)較低，HR組較其余各組高，表明缺氧復(fù)氧可導(dǎo)致ROS生成增多。而Ucn I組ROS濃度低于HR組，提示Ucn I后處理能在一定程度上抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞 ROS的生成。同時(shí)，5-HD+Ucn I組心肌細(xì)胞ROS濃度較Ucn I組高，但低于HR組，表明Ucn I后處理抑制ROS的生成與其開放mitoKATP通道有關(guān)。因mitoKATP的開放可促進(jìn)鉀離子內(nèi)流，增加線粒體基質(zhì)容積，使鈣離子內(nèi)流受到抑制，從而減輕鈣超載，提高氧代謝率和促進(jìn)線粒體呼吸，呼吸功能的增強(qiáng)則能顯著減少ROS的產(chǎn)生[15]；另mitoKATP通道的開放，可改善線粒體電子傳遞鏈，減少ROS等過氧化物生成，同時(shí)可激活SOD2等抗氧化酶的活性，起到抗氧化應(yīng)激的作用[16]。而既往通過基因芯片已經(jīng)證實(shí)Ucn I可使mitoKATP通道的Kir6.2亞基表達(dá)增強(qiáng)[17]，這為Ucn I能開放mitoKATP通道打下了分子基礎(chǔ)。此外，表2結(jié)果顯示：5-HD并沒有完全消除Ucn I后處理抑制ROS生成的作用，這是否與細(xì)胞膜ATP敏感性鉀通道(sarcKATP)相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Urocortin I后處理能抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性氧自由基的大量生成，并抑制線粒體膜電位的衰減，其機(jī)制與其開放線粒體ATP敏感性鉀通道有關(guān)。

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[收稿2017-04-20;修回2017-05-10]

(編輯：王靜)

The effect of urocortin I postconditioning on mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in rat heart during hypoxia/reoxygenation

LiuWei1，ZhangLin1，TianWei2，DengShengli3

(1 Department of Anesthesiology of Zunyi Medical University，Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection ，Zunyi Guizhou 563099，China;2 Department of Anesthesiology of People’s Hospital of Bozhou District, Zunyi Guizhou 563100，China ;3.Department of Anesthesiology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099，China)

Objective To explore the effect of urocortin I postconditioning on mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in rat heart during hypoxia/reoxygenation.Methods Isolated rat myocytes by using ALC-HP type isolation heart perfusion device. Myocytes after being continuously cultivated 24 h were randomly divided into four groups: Nor group,HR group,UcnI postconditioning group and mitochondrial ATP-sensitive potassium channel blocker 5-HD+Ucn I group. Nor group: cultivated in a 37 ℃ incubator continuously for 150 min; HR group: suffered from hypoxia for 40 min, then reoxggenation for 110 min;Ucn I group: reoxygenation for 10 min after being hypoxia for 40 min, then cultivated in a nutrient medium containing Ucn I for 30 min, and then reoxygenation for 70 min. 5-HD+Ucn I group: cultivated in the nutrient medium containing 5-HD for 10 min before reoxygenation, the rest managements were the same as Ucn I group. Observing the change of MMP and ROS by using inverted phase contrast microscope at the end of reoxygenation.Results 1)Fluorescence intensity change of MMP：Nor group was higher than other three groups(P<0.01)；Ucn I group was lower than Nor group，but higher than groups HR and 5-HD+Ucn I(P<0.05)；but there was no significant difference between groups HR and 5-HD+Ucn I(P>0.05. 2)Fluorescence intensity change of ROS: Nor group was lower than other three groups(P<0.01); HR group was higher than groups Ucn I and 5-HD+UcnI(P<0.01); while 5-HD+Ucn I group was higher than Ucn I group(P<0.01).Conclusion Urocortin I postconditioning can restrain the excessive generation of ROS and attenuation of MMP，these effects relate to the opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channel.

Urocortin I postconditioning；reactive oxygen species；nitochondrial membrane potential；mitochondrial ATP-sensitive potassium channel

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目( NO:黔科合SY 字[2013]3024) 。

鄧勝利，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心肌保護(hù)，E-mail:zydsl2004@163.com。

R614

A

1000-2715(2017)03-0268-05