崔國禎，余漢濠，黃天養(yǎng)，王文棟，徐義祥，程自剛，吳彩燕，李銘源

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 生物工程系暨珠海市中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究重點實驗室，廣東 珠海 519041；2.澳門大學(xué) 中華醫(yī)藥研究院暨中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室，澳門 999078;3.澳門鏡湖醫(yī)院 消化內(nèi)科，澳門 999078)

?

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

膽堿和蛋氨酸缺乏飼料誘導(dǎo)大、小鼠非酒精脂肪性肝炎動物模型的比較研究

崔國禎1,2，余漢濠3，黃天養(yǎng)1，王文棟3，徐義祥3，程自剛3，吳彩燕2，李銘源2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 生物工程系暨珠海市中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究重點實驗室，廣東 珠海 519041；2.澳門大學(xué) 中華醫(yī)藥研究院暨中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室，澳門 999078;3.澳門鏡湖醫(yī)院 消化內(nèi)科，澳門 999078)

目的 為防治非酒精脂肪性肝炎(NASH)的研究提供理想的動物模型。方法 將C57BL/6雄性小鼠和SD大鼠分別隨機(jī)分成2組，分別喂養(yǎng)蛋氨酸-膽堿充足(MCS)飼料(正常組)和蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飼料(模型組)。分別在各組中飼養(yǎng)3、5、8周后，取動物血清和肝臟。測定血清的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)的含量；肝臟切片后經(jīng)HE染色，觀察肝臟的病理形態(tài)學(xué)變化并對其病變程度進(jìn)行評分。結(jié)果 飼喂MCD飼料5周后，SD大鼠血清AST含量無顯著變化(P>0.05)，但是C57BL/6小鼠AST水平顯著升高(P<0.05)。同時，SD大鼠和C57BL/6小鼠模型的血清ALT水平均顯著升高(P<0.05)，此外，SD大鼠和C57BL/6小鼠血清中TG和TC的水平均顯著下降(P<0.05)，肝組織的病理評分均出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)。但是C57BL/6小鼠血清AST、ALT的變化幅度及肝組織病理評分明顯高于SD大鼠。結(jié)論 C57BL/6小鼠NASH模型優(yōu)于SD大鼠NASH模型。C57BL/6小鼠NASH模型相對SD大鼠，更適合NASH的分子機(jī)制和防治藥物的評價。

非酒精脂肪性肝炎；膽堿蛋氨酸缺乏飲食；非酒精性脂肪肝病；C57BL/6小鼠；SD大鼠

非酒精脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatosisheptitis,NASH)是一種無過量飲酒，以肝臟細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、彌散性肝小葉炎癥為主要臨床病理特征的綜合征。它是非酒精脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)發(fā)展為肝硬化和肝癌的一個重要階段，據(jù)報道NAFLD在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率表現(xiàn)為成人30%，兒童13%，其中大約有10%的NAFLD患者發(fā)展成為NASH，而這些NASH患者中的10%會發(fā)展成為肝硬化，甚至肝癌。目前非酒精脂肪性肝炎已經(jīng)成為研究的焦點[1-3]，然而NASH的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)其與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、瘦素、Kupffer細(xì)胞等多種因素相關(guān)[4-6]。目前臨床上的藥物普遍存在毒副作用較大、價格昂貴等問題，而被證實的有效且無副作用治療方法僅有適當(dāng)?shù)臐u進(jìn)性減肥運(yùn)動這一項。因此探索新型無毒副作用藥物對其NASH臨床治療具有重要意義，而可靠的動物模型對探索NASH的發(fā)病機(jī)制及防治發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

目前國內(nèi)外的NASH模型主要包括3類[7]：①營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型，它包括了高脂飲食脂肪肝動物模型、高糖飲食脂肪肝動物模型和蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)脂肪肝動物模型。②復(fù)合因素誘導(dǎo)的NASH模型，主要是以高脂肪飲食加化學(xué)藥物來進(jìn)行造模，包括四氯化碳脂肪肝動物模型、四環(huán)素脂肪肝動物模型、乙硫氨酸脂肪肝動物模型。③特殊品系脂肪肝動物模型，主要有瘦素缺乏和抵抗小鼠模型、PTEN基因敲除小鼠模型。其中，MCD飼料飲食誘導(dǎo)的NASH模型是目前國際上被廣泛認(rèn)可的模型。該模型最早由Shinozuka等[8]提出，最初是用于探討飲食因素對肝臟腫瘤形成的影響，后來發(fā)現(xiàn)在短期內(nèi)可以引起脂肪性肝炎。該模型的脂肪性肝炎發(fā)展速度快，其病理病變與人類的NASH類似，因此成為近年來國內(nèi)外學(xué)者研究NASH的熱點模型。但未見關(guān)于在大小鼠體內(nèi)用MCD飲食誘導(dǎo)NASH模型差異比較的報道。本研究旨在大、小鼠體內(nèi)，通過MCD飲食分別建立NASH模型，通過比較其生化和病理指標(biāo)，探討兩種動物模型的差異，以選擇理想的動物模型，為NASH的基礎(chǔ)研究和防治藥物的開發(fā)提供可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6雄性小鼠18只，8～9周齡，體重為22～25 g；SPF級SD雄性大鼠18只，8～9周齡，體重為300～350 g。均購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號[SCXK(粵)2013-0002]，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院實驗動物中心[SCXK(黔)2011-003]，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，屏障環(huán)境動物房[室溫(22±1)℃，相對濕度30%～60%，12 h光照/12 h黑暗]，動物自由采食和飲水。

1.1.2 實驗試劑 檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)含量的試劑盒，批號分別為0764757、0764949、0767107和0767263，均購自德國羅氏診斷公司，按說明書和文獻(xiàn)[9]報道的方法進(jìn)行檢測。

1.1.3 實驗儀器 COBAS6000型全自動生化儀(德國羅氏診斷公司)；TB-718E型生物組織自動包埋機(jī)(泰維科技有限公司)；TK-218型恒溫攤片烤片機(jī)(泰維科技有限公司)；RM2255生物組織自動切片機(jī)(上海徐卡顯微系統(tǒng)有限公司)；5415R臺式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.1.4 動物飼料 蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飼料(貨號：TP3006R)和蛋氨酸-膽堿充足(MCS)飼料(貨號：TP3006S2)購于南通特洛菲飼料科技有限公司；兩種飼料均按照南通特洛菲飼料科技有限公司技術(shù)部的飼養(yǎng)操作說明進(jìn)行喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 將18只C57BL/6雄性小鼠和18只SD大鼠分別隨機(jī)分成正常組(飼喂MCS飼料)和模型組(飼喂MCD飼料)。模型組需要1周過渡性飼料的喂養(yǎng)，第1～3天將MCS和MCD飼料按2∶1混合后喂養(yǎng)，第4～5天按1∶1混合喂養(yǎng)，第6～7天按1∶2混合喂養(yǎng)，1周后完全喂MCD飼料。過渡性飼養(yǎng)后的第3、5、8周在各組中分別隨機(jī)選取6只動物樣本，進(jìn)行肝功能生化指標(biāo)和肝臟病理的檢測。從過渡飼喂開始且每周稱量動物體質(zhì)量(g)，并記錄。

1.2.2 血清樣本的采集與生化檢測 實驗動物禁食12 h后，用水合氯醛腹腔注射麻醉動物，采血液，4 ℃冰箱靜置過夜后，于4 ℃離心機(jī)1 000g離心10 min，收集上清，用電化學(xué)發(fā)光法(德國羅氏診斷公司COBAS6000型全自動生化儀，德國羅氏診斷公司)測定ALT、AST、TG和TC的含量。

1.2.3 肝組織樣本的采集與病理學(xué)檢測 取相同部位的肝組織50 mg置于4%多聚甲醛(PFA)中，固定24 h，然后脫水12 h，包埋，切片，HE染色后進(jìn)行肝組織光鏡病理學(xué)檢測和等級評分。NASH的病理評分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)NASH病理診斷標(biāo)準(zhǔn)采用“亞太地區(qū)非酒精脂肪性肝病診斷與治療共識”推薦的美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)絡(luò)病理委員會2005年制定的NAFLD活動度積分指南進(jìn)行評價[10]。

對脂肪變性、肝小葉炎癥和細(xì)胞氣球樣變進(jìn)行評分。①對于肝脂肪變性，小于5%的肝脂肪變性，為0分；5%～33%，1分；33%～66%，2分；超過66%，3分。②對于肝小葉炎癥(隨機(jī)計數(shù)20個視野)，無炎癥，0分；<2個，1分；2～4個，2分；>4個，3分。③肝細(xì)胞氣球樣變：無，0分；少見，1分；2分，多見。計算肝脂肪變性、肝小葉炎癥和肝細(xì)胞氣球樣變的平均分，得到綜合得分。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量變化 正常對照組實驗動物的體質(zhì)量持續(xù)增長，模型組實驗動物體質(zhì)量逐漸減輕；從第3周開始，相比于正常組，模型組的實驗動物體質(zhì)量都顯著降低(P<0.05，見表1)。

組別動物0周(n=18)3周(n=18)5周(n=12)8周(n=6)正常SD大鼠330.83±12.23426.15±9.33483.06±10.43513.90±14.32模型SD大鼠333.22±11.45293.05±15.74*281.14±13.45*254.54±12.89*正常C57BL/6小鼠22.45±1.0323.06±1.5524.10±1.2226.17±1.45模型C57BL/6小鼠22.48±1.2320.07±1.45*18.14±1.36*16.71±0.89*

與同一時相點正常組相比，*P<0.05。

2.2 動物血清中ALT、AST、TC和TG的含量 從第3周開始，模型組小鼠肝酶AST和ALT水平與正常組相比，均已顯著升高(P<0.05)。相比之下，大鼠模型組在檢測的3個時間點，肝酶AST水平無顯著變化，而ALT水平從第3周開始顯著升高(P<0.05)。在檢測的造模后第3周、5周、8周，大、小鼠血清中TG和TC含量均顯著降低(P<0.05，見表2)。

時間組別動物天冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST(U/L)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT(U/L)甘油三酯TG(mmol/L)總膽固醇TC(mmol/L)3周正常SD大鼠149.15±26.8439.03±3.350.79±0.321.65±0.21模型SD大鼠158.85±21.7563.67±4.16*0.30±0.06*0.89±0.71* 正常C57BL/6小鼠90.95±2.8018.55±5.870.95±0.072.5±0.69模型C57BL/6小鼠135.20±5.80*43.50±14.42*0.64±0.01*1.46±0.07*5周正常SD大鼠89.55±7.2827.47±3.091.39±0.161.54±0.99模型SD大鼠124.37±18.56153.37±26.18*0.37±0.08*0.92±0.24*正常C57BL/6小鼠232.20±8.4975.70±15.801.13±0.072.69±0.16模型C57BL/6小鼠289.33±10.55*205.60±18.92*0.62±0.16*1.07±0.21*8周正常SD大鼠95.77±6.7248.93±5.621.44±0.112.22±0.12模型SD大鼠132.43±8.59108.37±14.17*0.25±0.03*0.76±0.11*正常C57BL/6小鼠104.75±14.6416.97±0.930.74±0.042.49±0.16模型C57BL/6小鼠399.09±25.80*309.86±14.96*0.47±0.04*0.71±0.13*

與同一時相點正常組相比，*P<0.05。

2.3 肝組織HE染色 正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，無肝細(xì)胞氣球樣變或炎癥細(xì)胞浸潤(見圖1A、1C)。MCD飼料飼喂8周后，模型組的大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)已被破壞，大泡性氣球樣變細(xì)胞占了總細(xì)胞的2/3以上，以肝小葉周邊脂肪變性最為嚴(yán)重，局部可見大泡性氣球樣變和以單個核細(xì)胞浸潤為主炎癥反應(yīng)(見圖1B)。8周時模型組小鼠肝組織光鏡下見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性，中央靜脈周圍出現(xiàn)嚴(yán)重、以浸潤為主的局灶壞死性炎癥(見圖1D)。具體NAFLD活動度積分見表3，SD大鼠和C57BL/6小鼠綜合評分均表現(xiàn)為模型組與正常組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A：SD大鼠8周正常飲食組；B：SD大鼠8周MCD飲食組；C：C57BL/6小鼠8周正常飲食組；D：C57BL/6小鼠8周MCD飲食組。 圖1 MCD飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠和SD大鼠NASH模型肝組織病理形態(tài)變化(HE，×400)

組別動物肝脂肪變性肝小葉內(nèi)炎癥肝細(xì)胞氣球樣變綜合得分正常SD大鼠0.67±0.330.67±0.3300.45±0.22模型SD大鼠2.00±0.00*2.33±0.67*1.67±0.67*2.00±0.44*正常C57BL/6小鼠0.67±0.331.00±0.0000.56±0.23模型C57BL/6小鼠3.00±0.002.67±0.67*1.33±0.33*2.33±0.44*

與同一時相點正常組相比，*P<0.05。

3 討論

MCD飼料誘導(dǎo)的NASH模型的主要發(fā)病機(jī)制是由于飼料缺乏膽堿而引起機(jī)體卵磷脂合成不足。蛋氨酸為合成載脂蛋白所必需的氨基酸，缺乏蛋氨酸會導(dǎo)致低密度脂蛋白膽固醇合成減少，因此無法將三酰甘油運(yùn)出肝外而累積形成脂肪肝[11]。另一方面，缺乏膽堿還會引起肝臟線粒體內(nèi)部活性氧增加，最終導(dǎo)致氧應(yīng)激增加而肝臟發(fā)生損傷[12-13]。氧應(yīng)激不但導(dǎo)致細(xì)胞多種功能和結(jié)構(gòu)損傷，而且活化TNFα及其他促炎癥細(xì)胞因子[14-15]。該模型自1978年Shinozuka等[8]提出以來，被國內(nèi)外的學(xué)者廣泛應(yīng)用于藥物篩選，但是缺少文獻(xiàn)對該模型在C57BL/6小鼠和SD大鼠的系統(tǒng)性報道。于是本實驗飼喂MCD飼料建立大、小鼠NASH模型，對其血液的生化指標(biāo)和肝臟的病理指標(biāo)進(jìn)行了比較，旨在探討兩種動物模型的生化和病理差異，以選擇理想的動物模型，為NASH的基礎(chǔ)研究和防治藥物的開發(fā)提供可靠的動物模型。

本研究的結(jié)果顯示，在肝損傷指數(shù)方面，飼喂MCD飼料的第3周開始，模型組小鼠的肝酶AST、ALT水平與正常組相比已經(jīng)顯著升高，但模型大鼠AST水平從實驗開始至結(jié)束仍無顯著差異，而AST和ALT的水平在臨床研究中通常作為肝臟功能評價重要指標(biāo)，反映脂肪肝的早期損害[16]，因此表明C57BL/6小鼠對MCD飼料的反應(yīng)在早期比SD大鼠更敏感，更容易引起肝損傷；且在肝組織病理結(jié)果顯示，飼喂MCD飼料8周模型組C57BL/6小鼠小鼠肝組織比SD大鼠出現(xiàn)的脂肪變性更嚴(yán)重，小區(qū)域出現(xiàn)小泡為主的細(xì)胞氣球樣變及輕微的炎癥反應(yīng)；同時通過肝組織病例評分結(jié)果表明8周后模型組C57BL/6小鼠肝組織炎癥反應(yīng)及脂肪變性等病理特征的得分明顯大于SD大鼠。另外，小鼠具有采食量少、成本低及操作方便等優(yōu)點。因此，綜合生化指標(biāo)及病理特征等因素，MCD飼料誘導(dǎo)的NASH的小鼠模型比SD大鼠模型更適用于進(jìn)一步研究NASH。

理想的動物模型對NASH發(fā)病機(jī)制及防治的研究起著至關(guān)重要的作用，因此其應(yīng)該具有與人類病理特征相似，動物死亡率低，模型重復(fù)率好，造模時間短，造模成本低等優(yōu)點。高脂飲食模型雖然穩(wěn)定性好，但是其造模的動物易厭食或腹瀉且至少12周才會逐漸出現(xiàn)NASH的病理學(xué)表現(xiàn)，而本次實驗完全建立模型的時間為8周，相比之更簡單、高效；此外，本實驗為無毒、不涉及化學(xué)試劑的過程，相比藥物中毒性脂肪肝動物模型和特殊品系脂肪肝動物模型而言，此模型具有動物死亡率低、肝細(xì)胞壞死少、重復(fù)性好，而且造模成本相對低廉等優(yōu)點。然而值得我們注意的是MCD模型組小鼠的體質(zhì)量和肝臟濕重均低于正常組的現(xiàn)象，這與相關(guān)文獻(xiàn)所述的人類NASH患者存在中心性肥胖的情況不同[17]。但同時也有相關(guān)研究指出，并非所有的NASH患者都并發(fā)有肥胖情況，仍有10%～20%的NASH患者體質(zhì)量是下降，且無胰島素抵抗的癥狀[18]。因此，MCD飲食誘導(dǎo)的模型還將有可能為非肥胖性脂肪性肝炎的研究提供新思路。

本實驗利用膽堿和蛋氨酸缺乏飲食誘導(dǎo)大、小鼠非酒精脂肪性肝炎動物模型，并對其進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)MCD飲食8周可以完全建立NASH模型，且以小鼠的NASH模型更符合研究人類臨床非酒精脂肪性肝病的發(fā)病過程。希望這一研究將有利于廣大學(xué)者進(jìn)一步充實和完善對MCD模型發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識，為NASH防治提供新的思路和實驗依據(jù)。

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[收稿2017-03-12;修回2017-05-12]

(編輯：王靜)

Comparison of NASH models-induced by methionine and choline deficient diets between rat and mouse

CuiGuozhen1,2,YuHanhao3,HuangTianyang1,WangWendong3,XuYixiang3,ChengZigang3,WuCaiyan2,LiMingyuan2

(1.Department of Bioengineering,Zhuhai Key Laboratory of Fundamental and Applied Research in Traditional Chinese Medicine,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519041,China;2.State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau,Macao 999078,China;3.Department of Gastroenterology,Kiang Wu Hospital,Macau 999078,China)

Objective To establish an ideal animal model for preventing and treating nonalcoholic steatohepatitis (NASH).Methods Rats and mice were randomly divided into 2 groups:control group fed with methionine-choline-sufficient (MCS) diet while model group fed with methionine-choline-deficient (MCD) diet.Blood was collected after 3,5,and 8 weeks of treatment,respectively.Serum levels of AST,ALT,TG and TC were measured.In addition,livers were removed to make hematoxylin-eosin (HE) staining.Liver pathology was semi-quantified according to nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score.Results After 5 weeks of treatment,there is no significant difference in serum AST levels of rats between control group and model group(P>0.05),in contrast,the AST levels in mice were significantly increased(P<0.05).However,the serum ALT levels in both animal models were increased significantly compared with control group(P<0.05).Additionally,the concentration of serum TC and TG decreased significantly in both rat model groups and mouse model group(P<0.05).NAFLD activity scores in both animal models were obviously increased compared with control group,which indicated that the animals have gradually developed into NASH(P<0.05).More importantly,the changes of serum AST,ALT,TG,and TC levels and histological score of NASH in mice were more severe than those in rats.Conclusion C57BL/6 mouse NASH model is superior to that of SD rat model,and is more suitable for studying molecular mechanism and drug screening in the prevention and therapy of NASH.

nonalcoholic steatohepatitis;methionine-choline-deficient diet;nonalcoholic fatty liver disease;C57BL/6 mice;SD rats

遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動基金資助項目(NO：F-693)；珠海市優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項目(NO:306015)。

李銘源，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:藥理學(xué)，E-mail:simonlee@umac.mo。

R575.5

A

1000-2715(2017)03-0229-05