林 茂，王 敏，張 木，王春梅

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 珠海校區(qū)生理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041；2.遵義醫(yī)學(xué)院 珠海校區(qū)藥學(xué)教研室，廣東 珠海 519041)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

雷帕霉素對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬Aβ1-42表達(dá)的影響

林 茂1,2，王 敏2，張 木1，王春梅1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 珠海校區(qū)生理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041；2.遵義醫(yī)學(xué)院 珠海校區(qū)藥學(xué)教研室，廣東 珠海 519041)

目的 初探雷帕霉素(RAPA)對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)表達(dá)的影響。方法 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠雌雄各半，隨機(jī)分為模型組、RAPA低劑量組、RAPA中劑量組和RAPA高劑量組，野生型C57BL/6小鼠作為對照組，每組10只。RAPA各組小鼠每天分別灌胃1.12、2.24和4.48 mg/kg的RAPA，連續(xù)4周。跳臺和Morris水迷宮實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，Western Blot檢測海馬神經(jīng)元Aβ1-42、磷酸化蛋白激酶B(p-PKB)和磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的表達(dá)。結(jié)果 模型組較對照組小鼠跳臺學(xué)習(xí)成績下降、潛伏期縮短、錯誤次數(shù)增加；Morris水迷宮逃避潛伏期延長、目標(biāo)象限停留時間縮短、穿環(huán)次數(shù)減少；海馬Aβ1-42和p-mTOR表達(dá)增多、p-PKB表達(dá)減少(P<0.05)。與模型組比較，RAPA各組小鼠跳臺學(xué)習(xí)成績提高、潛伏期延長、錯誤次數(shù)減少；Morris水迷宮逃避潛伏期縮短、目的象限停留時間延長、穿環(huán)次數(shù)增多；海馬Aβ1-42和p-mTOR表達(dá)減少、p-PKB表達(dá)增多(P﹤0.05)。RAPA各組組間比較，各指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 RAPA可降低海馬Aβ1-42的表達(dá)，對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶具有改善作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PKB/mTOR信號通路活性有關(guān)。

雷帕霉素；APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；學(xué)習(xí)記憶；β淀粉樣蛋白；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以漸進(jìn)性記憶和認(rèn)知功能減退為特征的彌漫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知障礙和癡呆[1-2]。隨著世界人口老齡化，AD患者人數(shù)逐年上升，在嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量的同時，也給社會醫(yī)療帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。腦內(nèi)β淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein，Aβ)異常沉積、寡聚形成AD重要的病理變化老年斑，Aβ亦是造成神經(jīng)損傷的主要毒性物質(zhì)[4-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target Of Rapamycin，mTOR)調(diào)控異常與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制mTOR相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠降低Aβ的沉積，改善AD模型認(rèn)知功能[8-10]。雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)作為一種mTOR的特異性抑制劑，早期其主要作為移植免疫抑制藥物應(yīng)用于臨床。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，RAPA可通過提高自噬水平，改善AD特征性病理[11-12]。但是，RAPA是否還可以通過其他途徑改善AD尚有待進(jìn)一步研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[13]，RAPA能提高Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞凋亡率，對Aβ25-35所致PC12細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其負(fù)反饋調(diào)節(jié)胰島素/磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，但尚未在動物模型上證明。故本實驗采用APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)一步探討RAPA防治AD的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠40只，C57BL/6小鼠10只，SPF級，雌雄各半，體重(20±2)g，均由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(粵)2013-0002]。RAPA購自Sigma，Aβ1-42抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH )抗體購自Millipore，磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated rapamycin target protein,p-mTOR)和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-PKB)抗體購自Epitomics，羊抗小鼠IgG購自武漢博士德。

STT-2小鼠跳臺儀購自北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，Morris水迷宮購自成都泰盟，蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置和全自動凝膠分析系統(tǒng)購自BIO-RAD，TS-200B恒溫?fù)u床購自上海喬躍電子有限公司，電子分析天平購自Mettler Toledo，-80 ℃度超低溫冰箱購自三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組、RAPA低劑量組、RAPA中劑量組和RAPA高劑量組，野生型C57BL/6小鼠作為對照組，每組10只。RAPA低、中、高劑量組分別每天灌胃1.12、2.24和4.48 mg/kg的RAPA，對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)4周。

1.2.2 跳臺實驗 末次給藥2 h后進(jìn)行跳臺實驗。讓小鼠在實驗箱內(nèi)適應(yīng)5 min，隨后底部銅柵通電36 V，小鼠遭受電擊后，正常反應(yīng)是返回絕緣臺，如此監(jiān)測5 min，記錄小鼠遭受電擊次數(shù)即學(xué)習(xí)成績。24 h后將小鼠置實驗箱絕緣臺上，記錄其在臺上停留的時間即潛伏期。同時，記錄5 min內(nèi)小鼠雙足同時接觸銅柵觸電的次數(shù)即錯誤次數(shù)。

1.2.3 Morris水迷宮實驗 給藥結(jié)束前5 d，進(jìn)行Morris水迷宮實驗。實驗包含2個部分，首先進(jìn)行定位航行實驗：隨機(jī)將小鼠從不同象限置入水池內(nèi)，記錄其游到水池中平臺上的時間即逃避潛伏期，若小鼠120 s內(nèi)仍未到達(dá)平臺，則將其引導(dǎo)到平臺上停留5 s，并將潛伏期記為120 s。每次測試4個象限，每象限間隔10 min，連續(xù)測試4 d。第5天撤走平臺，進(jìn)行空間探索實驗：固定一入水點，記錄120 s內(nèi)小鼠在原平臺象限即目的象限內(nèi)停留時間和小鼠游經(jīng)原平臺位置的次數(shù)即穿環(huán)次數(shù)。

1.2.4 Western Blot檢測Aβ1-42、p-PKB、p-mTOR蛋白表達(dá) 小鼠斷頭取腦，分離海馬，組織勻漿，BCA法測定樣品的蛋白濃度。上樣、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗4 ℃過夜。TBS洗3次，加二抗(羊抗小鼠IgG)，37 ℃孵育2 h。PBS漂洗3次，曝光。以GAPDH作為內(nèi)參。Quantity-One軟件分析，以相對光密度值(目的條帶光密度值與GAPDH光密度值的比值)作為蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶的變化 跳臺實驗結(jié)果如圖1A和表1所示，與對照組比較，模型組小鼠學(xué)習(xí)成績下降，潛伏期縮短，記憶錯誤次數(shù)增多(P<0.05)。與模型組比較，RAPA各組小鼠學(xué)習(xí)成績提高，潛伏期延長，記憶錯誤次數(shù)減少(P<0.05)。Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果如圖1B所示，與對照組比較，第1～4天模型組小鼠逃避潛伏期延長(P<0.05)。與模型組比較，第1天RAPA各組小鼠逃避潛伏期縮短，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；第2天RAPA中劑量和高劑量組小鼠逃避潛伏期、第3和第4天RAPA各組小鼠逃避潛伏期均明顯縮短(P<0.05)。Morris水迷宮空間探索實驗結(jié)果如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠目的象限停留時間縮短，穿環(huán)次數(shù)減少(P<0.05)。與模型組比較，RAPA各組小鼠目的象限停留時間延長，穿環(huán)次數(shù)增多(P<0.05)。RAPA各組間比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，。圖1 各組小鼠跳臺學(xué)習(xí)成績(A)和Morris水迷宮逃避潛伏期(B)的變化

組別跳臺記憶成績潛伏期(s)錯誤次數(shù)(次)Morris水迷宮記憶成績目的象限停留時間(s)穿環(huán)次數(shù)(次)對照267.40±10.311.40±0.5227.80±1.834.30±0.48模型77.50±9.32*2.20±0.42*16.54±1.41*1.80±0.42*RAPA低劑量182.90±10.09#1.60±0.52#23.27±2.54#3.20±0.78#RAPA中劑量175.50±9.85#1.50±0.53#23.41±2.55#3.30±0.82#RAPA高劑量177.20±9.05#1.70±0.48#21.67±4.19#3.10±0.87#

與對照組比較，*P<0.05；與模型比較，#P<0.05。

2.2 各組小鼠海馬Aβ1-42、p-PKB和p-mTOR蛋白表達(dá)變化 如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬Aβ1-42和p-mTOR表達(dá)增多、p-PKB表達(dá)減少(P﹤0.05)。與模型組比較，RAPA各組小鼠海馬Aβ1-42和p-mTOR表達(dá)減少、p-PKB表達(dá)增多(P﹤0.05)。RAPA各組間比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，。圖2 各組小鼠海馬Aβ1-42、p-PKB和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量

3 討論

AD動物模型是在實驗動物身上模擬AD患者腦組織的病理變化和行為異常，這是研究AD發(fā)病機(jī)制和篩選防治AD藥物與方法的基礎(chǔ)。因AD的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，完全理想的模擬，重現(xiàn)AD的動物模型尚不存在。但是，隨著研究的深入和技術(shù)的發(fā)展，具有一定代表性的AD動物模型，尤其是針對AD特征性病理[1,4]腦內(nèi)Aβ沉積形成的老年斑(senile plaques,SP)和tau蛋白異常聚集形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)的模型相繼被制作，并在研究中得到廣泛應(yīng)用[14]。本實驗選用的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型是將APPswe和PSEN1de9兩個基因整合在一起，來最大程度的模擬AD特征性病理改變，如Aβ沉積、神經(jīng)元缺失和中樞炎癥損傷等[14]。因此，本實驗采用該模型判斷RAPA防治AD的作用。結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠學(xué)習(xí)和記憶評估成績下降，海馬Aβ1-42表達(dá)增多。說明模型可靠，成功模擬了部分AD病理變化。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，AD患者中樞胰島素信號傳導(dǎo)通路存在異常[15-17]。AD患者腦組織分析顯示，即使沒有罹患糖尿病，大部分患者腦內(nèi)胰島素受體(insulin receptor,IR)表達(dá)減少，胰島素信號通路敏感性減低[16]。而胰島素樣生長因子受體(insulin like growth factor receptor,IGF-1R)和IR在海馬中表達(dá)降低時，會引起神經(jīng)元的凋亡增多。PI3K/PKB/mTOR信號通路在此發(fā)揮了重要作用。經(jīng)由該通路激活PI3K，可使mTOR處于持續(xù)的激活狀態(tài)，后者可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)使胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)異常磷酸化，從而抑制胰島素的信號傳導(dǎo)，發(fā)生胰島素抵抗，而Aβ過度沉積產(chǎn)生的神經(jīng)毒性恰恰與之正相關(guān)[15,17]。mTOR作為該信號通路下游的關(guān)鍵蛋白，在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。靶向調(diào)控mTOR的表達(dá)對防治AD具有重要意義。

目前已知的mTOR特異性抑制劑RAPA，作為一種從真菌中分離出來的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，早期被廣泛應(yīng)用于臨床移植免疫。隨著其抗衰老、抗腫瘤、心血管保護(hù)，尤其是其可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，繼而改善AD病程的作用的發(fā)現(xiàn)，引起了學(xué)者的重視[11-12]。而本課題組前期研究顯示[13]，RAPA對Aβ25-35所致PC12細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抑制mTOR活性，增強(qiáng)IGF-1R表達(dá)，實現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)胰島素/PI3K/PKB信號通路有關(guān)。故為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，本實驗通過給予APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠低、中、高三個劑量的RAPA，以在體評估RAPA的藥理作用并探討其作用機(jī)制。結(jié)果顯示，RAPA干預(yù)的模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力增高，海馬Aβ1-42和p-mTOR表達(dá)減少、p-PKB表達(dá)增多。說明RAPA可降低海馬Aβ1-42的表達(dá)，對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶具有改善作用，結(jié)合前期細(xì)胞實驗結(jié)果[13]，可以推測這一作用機(jī)制可能與RAPA負(fù)反饋調(diào)節(jié)胰島素信號通路活性有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充了RAPA防治AD的藥理機(jī)制。此外，本研究也對不同劑量RAPA組之間的作用效果進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)中劑量組效果較好，但是與其他兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。提示對于RAPA防治AD的藥物劑量研究還有待于做進(jìn)一步的補(bǔ)充實驗。

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[收稿2017-03-29;修回2017-04-20]

(編輯：王靜)

Effect of Rapamycin on the learning and memory and the expression of Aβ1-42in hippocampus of APP/PS1 transgenic mice

LinMao1,2,WangMin2,ZhangMu1,WangChunmei1

(1.Department of Physiology,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519041,China;2.Department of Pharmacy,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519041,China)

Objective Explore the effects of Rapamycin(RAPA)on the learning and memory and the expression of Aβ1-42in hippocampus of APP /PS1 transgenic mice.Methods APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into the model group and RAPA groups(low dose RAPA,middle dose RAPA,and high dose RAPA),wild-type C57BL/6 mice were used as the control group with ten mice in each group and half male and half female.RAPA groups were given 1.12,2.24,4.48 mg/kg RAPA for four weeks by gavage.Step down test and Morris water maze test were used to investigate the learning and memory ability.The expression of Aβ1-42(beta-amyloid peptides 1-42)of hippocampal neurons,p-PKB(protein kinase B with phosphorylation)and p-mTOR(mammalian target of rapamycin with phosphorylation)were detected by Western blot.Results Compared the model group with the control group,the achievement of step down test was decreased,latent period was shorter,the number of mistakes was increased;the escape latency was longer,the target quadrant time were shorter and the number of quadrant entries were less,the expression of Aβ1-42in hippocampus and p-mTOR were increased while the expression of p-PKB was decreased(P<0.05).Compared RAPA groups with the model group,the result of step down test was increased,latent period was longer,the number of mistakes was decreased;the escape latency was shorter,the target quadrant time were longer and the number of quadrant entries were more,the expression of Aβ1-42in hippocampus and p-mTOR were decreased while the expression of p-PKB was increased(P<0.05).Comparisons among RAPA groups showed that there were no statistical differences in each index(P>0.05).Conclusion RAPA may decrease the expression of Aβ1-42in hippocampus and improve the learning and memory ability of APP/PS1 transgenic mice,which may be related to the regulation of PKB/mTOR signaling pathway.

Rapamycin;APP/PS1 transgenic mice;learning and memory;Beta-amyloid protein;Alzheimer’s disease

貴州省科技廳基金資助項目(NO：黔科合LKZ字[2012]17)；貴州省科技廳基金資助項目(NO：黔科合LKZ字[2011]43)；貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目(NO：黔教科[2009]0108)。

王春梅，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物防治，E-mail:295446806@qq.com。

R741

A

1000-2715(2017)03-0254-05