王 犇，張 春，李向龍，張中保，鄒華文，吳忠義

(1.長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434023；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京市農(nóng)業(yè)基因資源和生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因玉米抗除草劑標(biāo)記基因EPSP拷貝數(shù)

王 犇1，2，張 春2，李向龍2，張中保2，鄒華文1，吳忠義2

(1.長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434023；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京市農(nóng)業(yè)基因資源和生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

基于微滴式數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)平臺(tái)，以轉(zhuǎn)基因玉米為例，建立了轉(zhuǎn)基因作物(Genetically modified crops，GM crops)外源基因拷貝數(shù)分析方法，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行了快速鑒定，并從T0轉(zhuǎn)基因玉米株系中鑒定出多個(gè)單拷貝單株。對(duì)該方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)方法在分析結(jié)果的準(zhǔn)確性方面進(jìn)行了比較，從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，2種檢測(cè)方法的結(jié)果比較一致，單拷貝檢測(cè)結(jié)果高度一致；但是ddPCR試驗(yàn)操作更加簡便，試驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性強(qiáng)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確可靠。研究表明，ddPCR方法是一種更加便捷、快速和準(zhǔn)確的外源基因拷貝數(shù)分析新方法，基于其在準(zhǔn)確性和靈敏度方面的顯著優(yōu)勢(shì)，將會(huì)在轉(zhuǎn)基因作物的外源基因拷貝數(shù)分析中得到廣泛的應(yīng)用。

微滴式數(shù)字PCR；轉(zhuǎn)基因玉米；外源基因；拷貝數(shù)；絕對(duì)定量

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)研究的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)在于精準(zhǔn)地鑒定轉(zhuǎn)基因植物外源基因拷貝數(shù)[1]。外源基因的表達(dá)情況與其整合到受體基因組中的拷貝數(shù)有密切關(guān)系，一般以低拷貝(1～2個(gè))整合時(shí)可高效表達(dá)，而多拷貝數(shù)的整合往往會(huì)造成外源基因不穩(wěn)定表達(dá)甚至基因沉默[2]。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)、Southern 印跡雜交(Southern Blot)等經(jīng)典方法已經(jīng)成熟的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)的分析中。

qRT-PCR技術(shù)是一種經(jīng)典的DNA定量方法，最常用的方法主要有非特異性SYBR Green I染料法和特異性TaqMan探針法2種，其中TaqMan探針法是在定性PCR的基礎(chǔ)上添加一條特異性的寡核苷酸熒光探針，其5′端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光集團(tuán)，3′端標(biāo)記一個(gè)淬滅熒光集團(tuán)，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。在探針完整時(shí)，報(bào)告集團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅集團(tuán)吸收，檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)不到熒光信號(hào)。PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′-3′外切酶活性將與底物結(jié)合的探針酶切降解，使熒光集團(tuán)和淬滅集團(tuán)分離，熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以檢測(cè)到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，從而實(shí)現(xiàn)了定量。TaqMan探針法的成功在于以下2個(gè)方面：一是Taq聚合酶所具有的雙鏈特異性的5′-3′外切酶活性；二是利用熒光能量傳遞技術(shù)構(gòu)建的雙標(biāo)記寡核苷酸探針(TaqMan探針)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR一般使用Ct值(每個(gè)反應(yīng)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)數(shù))定量，Ct值與模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可代入方程計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)[3]。qRT-PCR方法在分析中需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量本身就是一種并不十分精確的相對(duì)定量方法，而且建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程中需要在體系的摸索和優(yōu)化上投入大量的時(shí)間和精力，致使試驗(yàn)周期比較長[4]，所以qRT-PCR不是理想的外源基因拷貝數(shù)分析方法[5]。傳統(tǒng)的Southern Blot方法在分析時(shí)存在操作步驟繁瑣、樣本量大、工作量大、周期長和準(zhǔn)確性較差等缺點(diǎn)，并且使用放射性同位素標(biāo)記會(huì)對(duì)人體和環(huán)境造成較大安全隱患；特別是玉米的基因組較大，雜交信號(hào)弱，因此該方法在鑒定T0轉(zhuǎn)基因玉米拷貝數(shù)方面難度非常大。

近年來，在核酸定量分析技術(shù)領(lǐng)域中，數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)是一種發(fā)展迅速的突破性技術(shù)。1992年Sykes等[6]嘗試在復(fù)雜背景下檢測(cè)低豐度的IgH重鏈突變基因時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行有限稀釋，使每個(gè)反應(yīng)孔中只存在單個(gè)模板分子，通過收集PCR擴(kuò)增后的信號(hào)確定起始分子數(shù)，并且確定了以“終點(diǎn)信號(hào)的有或無”作為定量標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)字PCR檢測(cè)的原則，這也正是數(shù)字PCR的雛形。1999年Vogelstein等[7]提出了數(shù)字PCR的概念， 將反應(yīng)體系均勻分配到大量反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元中不包含或包含1個(gè)到少數(shù)幾個(gè)目的核酸分子，在每個(gè)反應(yīng)單元中獨(dú)立地進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后逐一檢測(cè)其熒光信號(hào)，再根據(jù)泊松分布和熒光信號(hào)呈陽性的反應(yīng)單元數(shù)占所有反應(yīng)單元數(shù)的比例來計(jì)算目的核酸序列的拷貝數(shù)。數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度、特異性和精確性，因此被迅速應(yīng)用于生命科學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域，如拷貝數(shù)變異分析[8-10]、基因表達(dá)分析[11-13]、轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)[14-16]、基因突變檢測(cè)[17-20]、微生物檢測(cè)[21-24]、測(cè)序文庫質(zhì)控[25-26]、測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證[27-31]、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷[32-34]等。

微滴式數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是一種基于泊松分布原理的對(duì)待檢核酸靶分子實(shí)現(xiàn)其濃度或拷貝數(shù)鑒定的絕對(duì)定量技術(shù)，目前在檢測(cè)核酸分子的絕對(duì)計(jì)數(shù)或定量方面發(fā)揮著越來越重要的作用。2015年，中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院朱水芳老師實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合國內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)室完成了ddPCR用于轉(zhuǎn)基因生物(Genetically modified organisms，GMOs)檢測(cè)的研究[35]。根據(jù)形成反應(yīng)單元的方式不同，數(shù)字PCR主要分為微反應(yīng)室(孔板)、微流控芯片和微滴等3個(gè)系統(tǒng)[36]。ddPCR作為數(shù)字PCR技術(shù)的一種，包含兩部分核心內(nèi)容：微滴化和微滴分析。微滴化是將配好的包含模板、引物或探針、Mix等成分的20 μL ddPCR預(yù)混液制備成20 000個(gè)均一的微滴，每個(gè)微滴約為1 nL，微滴中或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子，或者不含有靶分子，而且每個(gè)微滴均被微滴生成油所包裹并作為一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)器。區(qū)別于qRT-PCR的實(shí)時(shí)檢測(cè)，ddPCR是在擴(kuò)增結(jié)束后，在微滴分析儀中逐一對(duì)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)進(jìn)行采集，有熒光信號(hào)的說明含有目標(biāo)靶分子記為陽性微滴(判讀為1)，沒有熒光信號(hào)的說明沒有目標(biāo)靶分子則記為陰性微滴(判讀為0)，最終分析軟件統(tǒng)計(jì)陽性微滴數(shù)占總微滴數(shù)的比例，結(jié)合泊松分布原理計(jì)算出目標(biāo)靶分子的絕對(duì)濃度或拷貝數(shù)(拷貝/μL)。由此看出ddPCR的優(yōu)點(diǎn)是：不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值，以分子計(jì)數(shù)的方式直接獲得樣本的拷貝數(shù)濃度，這樣的絕對(duì)定量結(jié)果便于直接進(jìn)行橫向或縱向比較；更高的精確度，對(duì)同一個(gè)樣本的技術(shù)重復(fù)的檢測(cè)能獲得一致的結(jié)果，變異系數(shù)小；更好的重復(fù)性，即在不同的實(shí)驗(yàn)室之間，或同一實(shí)驗(yàn)室不同的檢測(cè)批次間，能對(duì)同一個(gè)樣本獲得一致的定量結(jié)果；更高的靈敏度，能更靈敏地檢測(cè)出其他技術(shù)無法檢出的或超低豐度的靶標(biāo)序列；更高的準(zhǔn)確度，更準(zhǔn)確測(cè)定樣本中靶標(biāo)序列的真實(shí)含量，真正實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析。

ddPCR作為一種全新的核酸分子定量技術(shù)，相較于傳統(tǒng)PCR和qRT-PCR，其結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性、精確度和靈敏度，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域，如絕對(duì)定量、稀有突變檢測(cè)和拷貝數(shù)變異分析等[36]。本研究采用ddPCR技術(shù)開展T0轉(zhuǎn)基因玉米株系中抗除草劑篩選基因EPSP的拷貝數(shù)分析。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

冬季在海南三亞崖城轉(zhuǎn)基因玉米試驗(yàn)基地通過花粉管通道法轉(zhuǎn)化獲得玉米種子[37-40]，玉米種子播種出苗后長到三葉期噴灑200 mg/L的草甘膦除草劑，經(jīng)篩選獲得的具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因株系視為T0，以后對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行自交擴(kuò)繁并依次獲得T1、T2、T3、T4轉(zhuǎn)基因株系。在實(shí)際用于測(cè)定的T2和T4樣品由不同T0純化而來。

1.2 ddPCR引物設(shè)計(jì)

試驗(yàn)內(nèi)參基因選用玉米醇溶蛋白Zein，經(jīng)過引物篩選和比較，采用以下具有高度專一性和特異性的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增(表1)。

表1 ddPCR引物對(duì)序列

1.3 葉片DNA提取

轉(zhuǎn)基因株系葉片基因組DNA的提取采用CTAB法[40-41]，濃度測(cè)定采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)。為了保證相鄰近的2個(gè)外源基因插入位點(diǎn)能夠被監(jiān)測(cè)到，需要對(duì)葉片基因組DNA進(jìn)行核酸酶的前處理，試驗(yàn)中采用TaKaRa的Hind Ⅲ進(jìn)行基因組的酶切反應(yīng)，每微克DNA加入1個(gè)單位Hind Ⅲ，在37 ℃條件下水浴處理4 h，65 ℃條件下處理30 min，使酶失活。

1.4 PCR擴(kuò)增

將模板DNA稀釋為20 ng/μL，使用北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心Bio-Rad公司產(chǎn)品QX200ddPCR系統(tǒng)進(jìn)行ddPCR試驗(yàn)。PCR采用以DNA為模板的EvaGreen染料法，采用20 μL反應(yīng)體系：2×ddPCR EvaGreen SuperMix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.2 μL，DNA 模板 3 μL(20 ng/μL)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；4 ℃ 5 min，90 ℃固化5 min(Ramp rate=2.0 ℃/s)，立即用于檢測(cè)(4 ℃保存，不超過2 h)。試驗(yàn)重復(fù)1次。

1.5 ddPCR試驗(yàn)操作流程

第1步：微滴生成。將配置好的20 μL樣品反應(yīng)體系加到微滴發(fā)生卡(DG8 cartridge)中間一排的8個(gè)孔內(nèi)，注意需緩慢打出液體以避免引入氣泡；在微滴發(fā)生卡最底下一排8個(gè)孔中各加入70 μL微滴生成油(DG oil)；蓋上膠墊(Gasket)，注意兩邊的小孔都要鉤牢；放入微滴生成儀中，一般需2 min即可完成微滴生成；微滴生成于微滴發(fā)生卡最上面一排孔內(nèi)，體積為40 μL，轉(zhuǎn)移至96孔板相應(yīng)位置孔內(nèi)，用預(yù)熱好的PX1熱封儀進(jìn)行封膜。第2步：微滴PCR。在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，注意升降溫速度需低于2.5 ℃/s。第3步：微滴分析。將96孔板放入微滴分析儀中，逐個(gè)分析讀取微滴熒光信號(hào)，判斷微滴陽性或陰性。第4步：結(jié)果分析。分析軟件計(jì)算出每個(gè)樣品中目的序列的拷貝數(shù)(拷貝/μL)，然后根據(jù)內(nèi)參基因的拷貝數(shù)計(jì)算得出待檢測(cè)目的基因的拷貝數(shù)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系外源基因拷貝數(shù)

該內(nèi)容委托大北農(nóng)生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)定，均采用TaqMan探針法。試驗(yàn)重復(fù)1次。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)中ddPCR反應(yīng)進(jìn)展順利，所檢測(cè)每個(gè)樣品的微滴數(shù)均在12 000個(gè)以上，而且所有微滴能夠分成明顯的上下兩簇，閾值線以上的點(diǎn)表示能夠擴(kuò)增出目的基因的陽性微滴，閾值線以下的點(diǎn)則代表陰性微滴(圖1)。試驗(yàn)利用ddPCR檢測(cè)T2轉(zhuǎn)基因玉米EPSP基因的絕對(duì)拷貝數(shù)，先后進(jìn)行2次獨(dú)立試驗(yàn)，結(jié)果表明，重復(fù)性較好，測(cè)得數(shù)值試驗(yàn)誤差為0.43%～4.39%，但不同樣品之間內(nèi)參基因的拷貝數(shù)相差較大，如樣品108-5測(cè)得內(nèi)參基因?yàn)?84拷貝，而在108-4樣品中測(cè)得內(nèi)參基因絕對(duì)拷貝數(shù)為1 353(表2)。

由表3可知，ddPCR與TaqMan方法檢測(cè)T4轉(zhuǎn)基因玉米外源基因拷貝數(shù)的結(jié)果達(dá)到高度一致，表明這2種方法在檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)方面的可行性和結(jié)果一致性。一般方法對(duì)T0轉(zhuǎn)基因植株外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)難度較大，而ddPCR技術(shù)通過檢測(cè)到的抗除草劑篩選基因EPSP拷貝數(shù)與玉米內(nèi)參基因Zein拷貝數(shù)的比值，可以得出轉(zhuǎn)基因玉米中外源EPSP基因的實(shí)際拷貝數(shù)。從表4可以看出，ddPCR測(cè)定的12個(gè)T0轉(zhuǎn)基因玉米植株中有6個(gè)EPSP基因拷貝數(shù)低于1，其他植株均大于1拷貝，最多達(dá)到11拷貝，說明ddPCR方法在對(duì)T0轉(zhuǎn)基因植株外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)方面有一定的優(yōu)勢(shì)。

名稱WellE試驗(yàn)Experiment樣品SampleT試驗(yàn)Assay類型Status濃度ConcentrationA06AABS572-2UZein手動(dòng)96.3H06AABSH2OUZein手動(dòng)0A07AABS572-2UEPSP手動(dòng)111H07AABSH2OUEPSP手動(dòng)0.0792

A06和A07.572-2樣品；H06和H07.水對(duì)照。

3 結(jié)論與討論

生物學(xué)的基礎(chǔ)研究和分子技術(shù)的發(fā)展伴隨著更精確和更靈敏的測(cè)量技術(shù)的發(fā)展。在目前的轉(zhuǎn)基因研究中，能夠準(zhǔn)確、快速地鑒定轉(zhuǎn)基因生物中外源基因的拷貝數(shù)，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的一個(gè)關(guān)鍵內(nèi)容[42]。除了外源基因的整合拷貝數(shù)多少對(duì)其是否正常表達(dá)至關(guān)重要之外，外源基因的整合方式(包括拷貝數(shù)、插入位置和側(cè)翼序列等) 也會(huì)影響目的基因和蛋白的表達(dá)，而且對(duì)外源基因在受體中的遺傳穩(wěn)定性具有很大的影響[43]。經(jīng)典的外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法主要有qRT-PCR和Southern Blot 2種。其中qRT-PCR 分析方法的步驟較為繁瑣，首先需要準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品，然后利用此樣品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，而標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立又涉及體系的摸索與優(yōu)化，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力，所需試驗(yàn)周期比較長；另外，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量本身就是一種相對(duì)定量方法，所以試驗(yàn)結(jié)果并不準(zhǔn)確。而傳統(tǒng)的Southern Blot方法不但對(duì)DNA需求量大、試驗(yàn)操作步驟復(fù)雜，而且對(duì)人員操作的技術(shù)要求比較高：轉(zhuǎn)膜必須要充分以保證DNA轉(zhuǎn)到膜上，雜交條件及漂洗要嚴(yán)格控制以保證陽性結(jié)果與背景反差對(duì)比明顯，洗膜要充分但不能過度等；另外，若要用同位素法，對(duì)人體健康和環(huán)境安全存在嚴(yán)重威脅。此法在分析時(shí)的最大問題在于試驗(yàn)工作量大、周期長、結(jié)果準(zhǔn)確性較差。

表3 ddPCR與TaqMan檢測(cè)T4轉(zhuǎn)基因玉米EPSP基因拷貝數(shù)結(jié)果比較

表4 ddPCR測(cè)定T0轉(zhuǎn)基因玉米EPSP基因拷貝數(shù)

研究通過試驗(yàn)探究了ddPCR方法在分析轉(zhuǎn)基因作物外源基因拷貝數(shù)方面的應(yīng)用。ddPCR作為一種新興的、準(zhǔn)確的絕對(duì)定量技術(shù)，已經(jīng)被越來越多的應(yīng)用于生命科學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域，比如核酸絕對(duì)定量、稀有突變檢測(cè)和拷貝數(shù)變異等。但目前用ddPCR分析轉(zhuǎn)基因生物的外源基因拷貝數(shù)的研究還較少。與傳統(tǒng)方法相比較，ddPCR的優(yōu)勢(shì)非常明顯，主要體現(xiàn)在操作流程更加簡單，不需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且是對(duì)待檢核酸分子直接進(jìn)行絕對(duì)定量，試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。另外，ddPCR在線性范圍、檢測(cè)極限和定量極限等方面都更勝于qRT-PCR[13]。這些優(yōu)點(diǎn)已得到了其他研究人員的認(rèn)可[44]。

本研究建立并優(yōu)化了ddPCR檢測(cè)試驗(yàn)體系，分析了整合到轉(zhuǎn)基因玉米中的外源基因(EPSP)的拷貝數(shù)。結(jié)果表明，采用qRT-PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)，與ddPCR的檢測(cè)結(jié)果相一致，特別是在對(duì)單拷貝轉(zhuǎn)化單株的檢測(cè)結(jié)果上兩者高度一致。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，ddPCR檢測(cè)方法簡便，操作簡單，不需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，節(jié)約時(shí)間。結(jié)果表明，不同樣品之間檢測(cè)到的內(nèi)參基因拷貝數(shù)相差較大，由于上樣DNA總濃度(以NanoDrop光度法計(jì)算)是一樣的，這可能是因?yàn)樵跐舛葴y(cè)定中無法排除其中雜質(zhì)的干擾，由此得知，在測(cè)定每個(gè)試驗(yàn)樣品時(shí)都需設(shè)置內(nèi)參基因以保證不同樣品之間結(jié)果的可比性。ddPCR檢測(cè)T0轉(zhuǎn)基因玉米EPSP基因拷貝數(shù)時(shí)，存在拷貝數(shù)低于0.5的檢測(cè)單株，可能是目的基因在T0轉(zhuǎn)基因玉米植株中以嵌合體形式存在；其中拷貝數(shù)大于1的單株居多，說明通過花粉管通道轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)基因玉米株系中以多拷貝整合的幾率較大；通過該方法能獲得一些以理想的拷貝數(shù)(單拷貝或雙拷貝)整合的轉(zhuǎn)基因玉米株系，以提供試驗(yàn)所需的材料。試驗(yàn)初步建立了T0轉(zhuǎn)基因玉米植株的外源基因拷貝數(shù)鑒定方法，能夠快速、規(guī)模化地鑒定轉(zhuǎn)基因玉米外源基因的拷貝數(shù)。

ddPCR方法在試驗(yàn)中充分體現(xiàn)了它的優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、節(jié)約時(shí)間和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可重復(fù)等，但也存在以下缺點(diǎn)，一是對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的數(shù)值進(jìn)行拷貝數(shù)界定依據(jù)不夠明確，以雙拷貝為例，可以將檢測(cè)數(shù)值為1.80～2.20的單株鑒定為雙拷貝，但是對(duì)于數(shù)值為1.50～1.80或2.20～2.50的單株的鑒定依據(jù)并不明確，試驗(yàn)中，編號(hào)407-11-2和85-8-1單株的ddPCR檢測(cè)結(jié)果分別為2.50和2.55，而熒光定量檢測(cè)結(jié)果也是分別簡單定性為雙拷貝和三拷貝及以上，2個(gè)樣品的ddPCR檢測(cè)結(jié)果很相近，但在熒光定量的檢測(cè)結(jié)果上卻相差很大；二是該試驗(yàn)所需試劑和耗材只能使用該儀器生產(chǎn)商匹配的，并且全部依靠進(jìn)口，因此，存在訂貨周期長、試劑耗材費(fèi)用高等不利因素。三是測(cè)定的絕對(duì)拷貝數(shù)是針對(duì)引物之間的擴(kuò)增片段而言，并不代表全長的外源DNA所有信息，要想知道全長的信息，有必要針對(duì)DNA不同部位開展ddPCR分析。

利用ddPCR進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)時(shí)，待檢測(cè)樣品在反應(yīng)室中隨機(jī)、獨(dú)立分布是單分子成功擴(kuò)增和準(zhǔn)確定量核酸靶分子拷貝數(shù)的關(guān)鍵因素，所以研究在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)選用了內(nèi)切酶Hind Ⅲ對(duì)基因組DNA處理。研究是以轉(zhuǎn)基因玉米單株中的篩選標(biāo)記基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，在一定程度上也可以作為目的基因的拷貝數(shù)參考；另外可嘗試在目的基因的不同位置設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)，以保證目的基因拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于該方法可以對(duì)經(jīng)過除草劑篩選獲得的T0單株進(jìn)行拷貝數(shù)鑒定，這是本試驗(yàn)所提到的其他2種方法無法實(shí)現(xiàn)的，所以能夠最大程度的減少其通過多代自交達(dá)到純合所需的時(shí)間，提高選擇效率。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：ddPCR能夠有效節(jié)省試驗(yàn)試劑和樣品量、對(duì)核酸純度要求不高，試驗(yàn)操作簡便省時(shí)，具有更高的檢測(cè)靈敏度和結(jié)果準(zhǔn)確度，是一種快速、靈敏、精確的轉(zhuǎn)基因作物外源基因拷貝數(shù)鑒定新方法。

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Analysis of the Copy Number of Herbicide Resistant Marker GeneEPSPin Transgenic Maize by Droplet Digital PCR

WANG Ben1，2，ZHANG Chun2，LI Xianglong2，ZHANG Zhongbao2，ZOU Huawen1，WU Zhongyi2

(1.College of Agriculture，Yangtze University，Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Jingzhou 434023，China；2.Beijing Agro-Biotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing Key Laboratory of Agricultural Gene Resources and Biotechnology,Beijing 100097，China)

The droplet digital PCR (ddPCR) method to evaluate the exogenous gene copy number in genetically modified crops (GM crops) as the example from genetically modified maize was developed，and some T0transgenic maize plants with single copy ofEPSPgene were selected from all the samples to be detected.The results were also compared with those from quantitative real-time PCR (qRT- PCR)，as could be seen from the experimental datas，the results from qRT-PCR(TaqMan) and ddPCR forEPSPwere consistent，especially the single copy detection results of both in a high degree of consistency.And the ddPCR method was easy to operate，the result was repeatable and accurate.Therefore，the ddPCR would be well developed as a novel method for estimating transgenic copy number with high accuracy，which might be widely used in the exogenous genes copy number analysis in GM crops in the near future.

Droplet digital PCR； Genetically modified maize； Exogenous gene； Copy number； Absolute quantification

2017-03-10

國家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)重點(diǎn)課題(2014ZX0800303B)；北京市農(nóng)林科學(xué)院科研能力創(chuàng)新項(xiàng)目；北京市科委項(xiàng)目(Z171100001517001)

王 犇(1988-)，男，安徽宿州人，在讀碩士，主要從事玉米抗旱分子生物學(xué)研究。王犇、張春為同等貢獻(xiàn)作者。

鄒華文(1973-)，男，江蘇邳州人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究。 吳忠義(1969-)，男，福建德化人，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究。

S513.03

A

1000-7091(2017)03-0070-07

10.7668/hbnxb.2017.03.011