鄒金財，張維林，夏明輝，邱洋松，王長春，楊 玲，張小明

(1．浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2．浙江省農(nóng)業(yè)科學院 作物與核技術(shù)利用研究所，浙江 杭州 310021)

水稻階段性溫敏白化轉(zhuǎn)綠突變體stgra254的特征和基因定位

鄒金財1，張維林1，夏明輝1，邱洋松1，王長春1，楊 玲1，張小明2

(1．浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2．浙江省農(nóng)業(yè)科學院 作物與核技術(shù)利用研究所，浙江 杭州 310021)

為了挖掘和鑒定更多的水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體用于基因功能的研究。從粳稻品種秀水09的EMS突變體庫中發(fā)現(xiàn)了一個階段性溫敏白化轉(zhuǎn)綠突變體stgra254，該突變體在28 ℃恒溫條件下，第6片完全展開葉出現(xiàn)白斑，至分蘗盛期融合成片，最終葉片枯萎死亡；在32 ℃條件下，第6片葉白斑數(shù)目及白化程度明顯弱于28 ℃，且3 d后逐漸轉(zhuǎn)綠；而24 ℃下的葉片表現(xiàn)正常。組織化學分析結(jié)果表明，白斑的形成和發(fā)展是一個程序性細胞死亡的過程，伴隨著H2O2的積累。熒光儀分析顯示，光系統(tǒng)Ⅱ的最大光能轉(zhuǎn)化效率顯著下降。遺傳分析表明，該突變體葉色性狀受1對隱性核基因控制。利用stgra254與珍汕97雜交得到F2群體，借助集團分離分析法和SSR分子標記連鎖分析，將其定位在4號染色體上的RM17206與RM17277標記之間，遺傳距離分別為0.48，5.22 cM。

水稻；白化轉(zhuǎn)綠基因；溫敏；基因定位

葉片是植物進行光合作用及多種代謝的主要器官[1]。在自然或者人工條件下，高等植物常出現(xiàn)葉色突變現(xiàn)象，其中許多白化突變體不能存活。階段性白化轉(zhuǎn)綠則屬于非致死葉色突變，主要表現(xiàn)為苗期白化，隨后葉色逐漸轉(zhuǎn)綠，直至恢復正常，植株繼續(xù)生長發(fā)育完成整個生育進程[2-3]。階段性白化轉(zhuǎn)綠突變體不僅在研究葉綠素合成代謝、葉綠體發(fā)育、光合作用機制、光形態(tài)建成等諸多方面具有獨特作用[4-5]，而且是可應用于作物遺傳育種的一種理想的形態(tài)標記材料[5-7]。鑒于水稻階段性白化轉(zhuǎn)綠突變體的特殊表型及實際應用價值，其已受到了越來越多的關(guān)注[7]。

目前報道的40多個水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體絕大多數(shù)由單隱性核基因控制，其中的17個已被定位，除第7，12染色體外的10條均有分布[8]。水稻白化轉(zhuǎn)綠可能與直接或間接影響光合色素的生物合成及代謝[4，9]、葉綠體的形成和發(fā)育[1，7]、葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運[10]、光系統(tǒng)異常[11]、核-質(zhì)信號傳導途徑[12]等有關(guān)，其機制非常復雜[8]。目前，只有7個水稻白化轉(zhuǎn)綠基因被克隆[1，3-4，7，9，12-14]。顯然，有必要挖掘和鑒定更多的水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體用于基因功能研究，以進一步揭示其中的復雜機理。

筆者在粳稻品種秀水09的EMS突變體庫中發(fā)現(xiàn)了1個階段性溫敏白化轉(zhuǎn)綠突變體stgra254，本研究在分析該突變體表型、生理、白葉枯病抗性等特征的基礎(chǔ)上，將基因stgra254定位在4號染色體上。本研究結(jié)果將為stgra254的克隆和分子機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體stgra254來源于晚粳稻秀水09種子經(jīng)EMS(甲基磺酸乙酯)處理，經(jīng)過8代自交繁殖和選擇，突變體的白化轉(zhuǎn)綠表型已經(jīng)穩(wěn)定。定位所用的2個分離群體的父本分別為秈稻珍汕97和9311。

1.2 白化轉(zhuǎn)綠突變體苗期葉色特征鑒定

將突變體stgra254及其野生型秀水09的種子在28 ℃下浸種催芽，長到一葉一心后，分別置于3種不同溫度(24，28，32 ℃)的PQX-450A-12H智能人工氣候箱中(寧波萊?？萍加邢薰?，12 h光照/12 h黑暗，用水稻營養(yǎng)液(國際水稻所)培養(yǎng)，觀察葉色的變化。

1.3 葉綠素熒光動力學參數(shù)的測定

采用雙通道Dual-PAM-100熒光儀(WALZ，德國)分別測定3種不同溫度下第6葉的葉綠素熒光相關(guān)參數(shù)。首先對水稻進行約30 min的黑暗處理后照射檢測光，熒光水平穩(wěn)定后得到熒光參數(shù)Fo(初始熒光)，然后給一個飽和脈沖光，一個脈沖后關(guān)閉，測得最大熒光Fm，從而得到熒光參數(shù)Fv/Fm(Fv=Fm-Fo)。

1.4 白斑形成機制的組織化學分析

1.4.1 細胞程序性死亡檢測 分別將生長在28，32 ℃的突變體stgra254和秀水09的第6葉浸泡在0.4%臺盼藍染液中，于沸水浴中染色約10 min，室溫放置12 h，然后用2.5 mg/mL水合三氯乙醛脫色3 d，觀察細胞死亡情況。

1.4.2 細胞產(chǎn)生H2O2沉積反應檢測 分別將生長在28，32 ℃的水稻第6葉浸泡在1 mg/mL二氨基聯(lián)苯胺(pH值3.8)中，25 ℃光照8 h后，于95%乙醇中煮沸脫色約10 min，再將葉片置于25 ℃乙醇中浸泡4 h，觀察葉片出現(xiàn)紅褐色沉淀情況并拍照。

1.5 遺傳分析和定位群體的構(gòu)建

2009年夏季在浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)場試驗田用突變體stgra254作母本，分別與珍汕97、9311和野生型秀水09配制雜交組合，冬季到海南繁殖F1，苗期觀察F1表型，成熟后單株收獲種子。于2010年夏季在浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)場試驗田種植親本和F2群體，對秀水09/stgra254 F2群體中的正常單株和白化轉(zhuǎn)綠單株株數(shù)進行統(tǒng)計，用于遺傳分析。對突變體/珍汕97 F2群體中具有正常綠葉和白化葉表型的植株分別取樣，用于白化轉(zhuǎn)綠基因的定位。

1.6 白化轉(zhuǎn)綠基因stgra254的定位

采用CTAB法提取水稻葉片總DNA。以集團分離分析法構(gòu)建正常綠葉和白化葉基因池。選擇已公布的SSR標記(Simple sequence repeats)(http：//www.gramene.org)，SSR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。10 μL的PCR反應體系包括模板DNA(35 ng/μL)1 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、dNTP、2×TaqMasterMix (TaKaRa公司)3 μL、雙蒸水4 μL。PCR擴增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38個循環(huán)；72 ℃ 5 min。3%瓊脂糖凝膠或者6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[9]。尋找在2個基因池之間擴增片段有差異的分子標記。使用MAPMAKER (EXP3.0b) 軟件進行連鎖分析；利用Kosambi 作圖函數(shù)計算遺傳圖距。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體表型和葉色溫敏特性

水稻大田條件下，階段性白化轉(zhuǎn)綠突變體stgra254第1-5葉呈正常綠色，第6片葉完全展開時，近中部開始出現(xiàn)小的橢圓形白色斑點，在分蘗盛期，橢圓形白色斑點逐漸擴大并融合為一體(圖1-A)，隨后逐漸變綠，至成熟期呈正常葉色。這暗示突變體葉色表型在常規(guī)的生長季節(jié)中受植株的生長發(fā)育調(diào)控。與野生型植株表型比較，白化時期的突變體植株矮小，葉片窄(圖1-B、C)；突變體轉(zhuǎn)綠后株高為(91.1±5.6)cm、分蘗數(shù)為3.5個，比同期野生型的株高((58.8±3.9)cm、14.1個)更高、葉片更寬、分蘗減少(圖1-B)；孕穗期和抽穗期提前20 d左右。

圖1 stgra254與秀水09在大田和不同溫度生長箱的表型

對生長在3種不同恒溫下幼苗的葉色觀察顯示，突變體與野生型相比，24 ℃下葉片顏色無明顯差異(圖1-C)。28 ℃下，突變體的1-5葉表現(xiàn)為正常綠色，第6葉完全伸展后，在其中上部、中脈與葉邊緣的中間部位最先出現(xiàn)白色圓形斑點，隨后中脈附近也陸續(xù)出現(xiàn)，白色斑點逐漸變大變多，沿維管束方向擴展，融合成長條狀白色斑塊(圖1-C)，5 d后整個葉片的中脈附近變成白色，而葉邊緣仍為淡綠色，最終整片葉白化枯萎死亡；少數(shù)突變體的第7葉也會出現(xiàn)類似的情況，后繼抽出的葉片均表現(xiàn)為正常綠色。32 ℃下，突變體的1-5葉同樣為正常綠色，第6葉完全伸展后，白色圓形斑點最先在中上部、中脈與葉邊緣中間區(qū)域出現(xiàn)，少數(shù)白色斑點會沿維管束方向連成長條狀斑塊，但斑點數(shù)目及白化程度明顯弱于28 ℃下的突變體(圖1-C)，而且3 d后白色斑點或斑塊逐漸消失，14 d后葉片最終恢復正常綠色。2013年5月27日將28 ℃恒溫下培養(yǎng)至五葉期的突變體移栽到大田，當?shù)貧鉁匾呀?jīng)比較高，第6葉片并沒有出現(xiàn)白斑，進一步證實突變體的白化表型與溫度密切相關(guān)，屬于非致死溫度敏感型突變體[7]。所以，突變體stgra254階段性白化轉(zhuǎn)綠表型同時受植株的生長發(fā)育和外界的溫度調(diào)控。

2.2 突變體stgra254的PS Ⅱ活性

為了檢測突變體stgra254中的光合機構(gòu)是否受影響，比較了野生型和stgra254第6葉在不同溫度下葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm(其表示PS Ⅱ的最大光量子產(chǎn)量，即光系統(tǒng)Ⅱ的最大光能轉(zhuǎn)化效率)。如表1所示，stgra254與秀水09的葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm在24，32 ℃下并沒有顯著性差異；而28 ℃下stgra254的Fv/Fm極顯著低于野生型秀水09，表明stgra254的PSⅡ反應中心受到損害，光合作用的原初反應受到抑制。

表1 不同溫度下葉片的葉綠素熒光動力參數(shù)Fv/Fm

注：**.差異在0.01水平顯著。

Note：**.Indicated significant difference at 0.01 level.

2.3 白化轉(zhuǎn)綠突變體形成機制的組織化學分析

28 ℃下，突變體stgra254第6葉片白化部分雖然看不到組織壞死斑，但臺盼藍染色后呈現(xiàn)大量深藍色的斑塊，表明著色部位正在發(fā)生細胞程序性死亡，而野生型秀水09只在葉脈處有少量深藍色點(圖2-A)，這是因為葉片在正常生長過程中，葉脈中導管細胞發(fā)生了細胞程序性死亡造成的。32 ℃下突變體stgra254出現(xiàn)白斑的葉片的深藍色著色點面積較28 ℃明顯減小(圖2-A)；繼續(xù)培養(yǎng)14 d后，白斑已轉(zhuǎn)為綠色時，深藍色著色點變得稀疏。表明stgra254白斑的形成和發(fā)展是一個程序性細胞死亡的過程。

H2O2是植物細胞內(nèi)主要的活性氧。經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺染色后，28 ℃突變體stgra254的第6葉片出現(xiàn)明顯的H2O2沉積產(chǎn)生紅褐色沉淀，而秀水09幾乎沒有發(fā)生變化(圖2-B)，表明突變體細胞積累了大量的活性氧。32 ℃stgra254相應葉片只在主脈處有紅褐色沉淀；待白斑轉(zhuǎn)綠后，檢測不出H2O2沉積。表明stgra254表達引起水稻細胞產(chǎn)生過敏性反應的活性氧迸發(fā)，由此推測，stgra254的白斑可能是由H2O2引起的。

圖2 不同溫度培養(yǎng)下秀水09(左)和stgra254(右)臺盼藍(A)或二氨基聯(lián)苯胺(B)染色后的葉片局部

2.4 突變體的遺傳分析

2.5 白化轉(zhuǎn)綠基因stgra254的初步定位

以stgra254突變體與珍汕97雜交組合的F2為定位群體。構(gòu)建白化葉基因池和正常綠葉基因池，利用分布在12條染色體上的278對SSR標記引物對2個基因池進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)標記RM17101、RM17337、RM17468具有多態(tài)性。利用這3對標記引物對檢測F2分離群體中的248個白化轉(zhuǎn)綠單株，結(jié)果將基因stgra254定位于第4染色體的長臂上。為了縮小定位區(qū)間，在網(wǎng)站(www.gramene.org)上查找存在于RM17101和RM17337之間的SSR標記，并合成了20對引物，其中RM17154、RM17171、RM17182、RM17206和RM17277這5個標記在兩親本間有多態(tài)性且與基因stgra254連鎖，進而用這些標記引物對F2定位群體進行連鎖分析，結(jié)果表明，stgra254基因位于第4號染色體RM17206和RM17277之間，遺傳距離分別為0.48，5.22 cM(圖3)。

圖3 stgra254基因在水稻第4號染色體上的初步定位

3 結(jié)論與討論

突變體stgra254階段性白化轉(zhuǎn)綠表型同時受植株的生長發(fā)育和外界的溫度調(diào)控。葉發(fā)育過程中，葉綠體的發(fā)育受質(zhì)體和核基因協(xié)調(diào)表達的嚴格調(diào)控[4]。目前報道的40多個水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體，絕大多數(shù)由單隱性核基因控制，至少有17個被基因定位[8]，其中定位于第4染色體上的只有白化轉(zhuǎn)綠和多分蘗矮稈基因hw-1(t)[9]。hw-1(t)在三葉期之前第1，2片葉完全白化，隨后轉(zhuǎn)綠，其白葉、多蘗及矮稈表型與突變體stgra254少蘗高稈差異很大[2]，并且定位區(qū)間相隔遠，說明兩者不是同一個基因，stgra254為1個新的白化轉(zhuǎn)綠基因。

筆者根據(jù)葉綠素熒光動力學參數(shù)Fv/Fm及組織化學染色結(jié)果推測：突變體stgra254的PSⅡ反應中心受到損害，電子傳遞受阻，PSⅡ能量持續(xù)積累，產(chǎn)生大量活性氧分子，活性氧的大量積累誘導了葉片細胞程序性死亡的發(fā)生[15]，從而進一步破壞葉綠素，造成失綠變白表型[2]。

突變體v3(virescent-3)在自然生長條件下第1，2葉呈正常綠色，從三葉期-分蘗盛期葉片退綠變白，抽穗后恢復正常，并且白化表型對溫度和光周期敏感[4]。突變體gra75的1-3葉呈正常綠色，第4-7葉開始白化，從第8葉又恢復綠色，同時白化葉片葉轉(zhuǎn)為綠色，光溫環(huán)境條件對其影響較小[13]?；騐3編碼核苷酸還原酶RNR的大亞基，RNR參與葉綠體的生物發(fā)生，其第5個外顯子處發(fā)生了單堿基的突變，造成第291位G→S，影響了葉片發(fā)育過程中葉綠體的分化[4]；gra75為V3的等位基因，由于單堿基突變造成279位氨基酸A→V[13]。這2個突變體白化性狀出現(xiàn)的時期及對外界光溫反應的差異，可能是由不同的氨基酸突變位點造成的[13]。V1編碼一個葉綠體蛋白NUS1，在20 ℃低溫下參與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄和葉綠體的分化，此基因單堿基的突變使得257位R→終止子，阻礙了葉綠體早期的發(fā)育，從而產(chǎn)生v1突變體低溫敏感型白化表型[1]。突變體gra(t)的白化轉(zhuǎn)綠表型由葉綠體蛋白合成延伸因子基因編碼區(qū)產(chǎn)生單堿基替換，456位錯義突變(T→I)造成葉綠體發(fā)育異常[3]。YSA基因編碼一個含有16個串聯(lián)基序的三角狀五肽重復蛋白(PPR)，其5個核苷酸的缺失造成提前終止密碼子的出現(xiàn)，妨礙了突變體ysa(Young seedling albino)幼葉和莖稈中葉綠素含量以及葉綠體發(fā)育，后期其他相關(guān)基因會補償其功能的缺失，從而使幼苗表現(xiàn)出階段性白化轉(zhuǎn)綠表型[6]。突變體OsV4則是因編碼4個串聯(lián)基序的、參與葉綠體發(fā)育的PPR蛋白基因4個堿基的缺失引起，四葉期以前在20，24 ℃均表現(xiàn)為白化[16]。編碼質(zhì)體水解酪蛋白酶復合物組分基因的單堿基突變，造成其蛋白產(chǎn)物提前終止而缺失保守的催化域及多肽結(jié)合位點，影響葉綠體的早期發(fā)育，決定了突變體vyl(Virescent yellow leaf)的表型[14]。新型鳥苷酸激酶位于質(zhì)體和線粒體上，調(diào)控葉綠體發(fā)育信號傳輸?shù)郊毎?，單堿基突變(162位V→I)使得質(zhì)體基因喪失時期特異性表達，抑制核基因編碼的質(zhì)體蛋白表達，質(zhì)體蛋白也不能正常翻譯，最終影響了葉綠體分化，導致突變體v2葉片出現(xiàn)溫敏白化表型[12]。IMMUTANTS蛋白參與類胡蘿卜素的合成，該基因257bp處單堿基的突變(G→A) 形成終止密碼子，造成翻譯提前終止，葉片中胡蘿卜素含量減少，葉綠體缺少類胡蘿卜素保護而被單線態(tài)氧破壞，突變體hw-1(t)出現(xiàn)白化表型[2，9]。位于葉綠體被膜及類囊體膜上的J-類似蛋白與葉綠素生物合成中催化光依賴反應的原葉綠素酸酯氧還酶POR互作，起伴侶蛋白功能，當該J-類似蛋白基因發(fā)生單核苷酸突變(G→C)時，阻礙抽葉前和正在抽葉的葉片中POR的積累，降低了葉綠素的含量，使得OsV5A突變體三葉期幼苗的葉片缺綠[17]。RNA轉(zhuǎn)錄終止因子基因5′端一段核苷酸的缺失，妨礙了調(diào)控葉綠體發(fā)育某基因的功能，影響了v14第2，3片葉中的葉綠體發(fā)育，后期該基因家族其他成員被激活，取代了突變基因的功能，第4片葉葉色便恢復正常綠色[18]。stgra254在六葉期表現(xiàn)出特異及溫敏的白化表型的機制尚不清楚。本研究結(jié)果為最終分離出該基因以及研究其作用機制奠定了基礎(chǔ)。由于階段性白化轉(zhuǎn)綠突變體大多在分蘗期前就轉(zhuǎn)綠，對水稻的正常生長發(fā)育影響很小，可用做雜交水稻制種的標記，確保雜種的純度[18-20]。

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Characterization and Gene Mapping of Stage Thermo-sensitive Green-revertible Albino Mutantstgra254 in Rice

ZOU Jincai1，ZHANG Weilin1，XIA Minghui1，QIU Yangsong1，WANG Changchun1，YANG Ling1，ZHANG Xiaoming2

(1.College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China； 2.Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China)

In order to explore and identify more albino mutants for studying gene functions，a stage thermos-sensitive green-revertible albino mutant in rice，designated asstgra254，was isolated by treating the seeds ofjaponicavariety Xiushui 09 using EMS.The phenotype ofgra254 is thermos-sensitive.Under a constant temperature of 28 ℃，the white spots appeared on the fully expanded sixth leaves，and gradually enlarged and merged into one at maximum tillering stage.Then the leaves withered to death.The sixth leaf blades showed milder expression of the mutant phenotype under 32 ℃ condition than that under 28 ℃ condition，and gradually turned green from the third day onward.Under 24 ℃ condition，however，thegra254 plants produced normal green leaves.Histochemical staining analysis indicated that the albino trait ofstgra254 was caused by the programmed cell death，which probably caused by oxidative burst accompanying by the accumulation of H2O2.Analysis by fluorescence analyzer presented that the maximal photochemical efficiency of PS Ⅱ decreased significantly.Genetic analysis indicated that the thermos-sensitive green-revertible albino trait was controlled by a single recessive nucleic gene.Based on the F2population derived from a cross betweenstgra254 and Zhenshan 97，thestgra254 was located between the SSR markers of RM17206 and RM17277 on chromosome 4 by bulked segregant analysis and linkage analysis.The genetic distance was 0.48，5.22 cM， respectively.

Rice； Green-revertible albino； Thermos-sensitive； Gene mapping

2017-02-14

浙江省水稻種業(yè)科技創(chuàng)新團隊項目(2010R50024)

鄒金財(1989-)，男，江西贛州人，在讀碩士，主要從事水稻分子生理研究。

楊 玲(1965-)，女，湖南寧鄉(xiāng)人，教授，博士，主要從事水稻逆境分子生理研究。

張小明(1962-)，男，浙江杭州人，研究員，博士，主要從事水稻遺傳育種研究。

Q78；S511.03；Q945

A

1000-7091(2017)03-0001-06

10.7668/hbnxb.2017.03.001