趙 創(chuàng)，李曉燕，陳春蘭，李 淼，梁 薇，劉志丹△

(1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 201999;2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院寶山分院，上海 201999;3.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200437)

艾灸對CIA模型小鼠關節(jié)炎及miRNA-155、miRNA-146a、miRNA-21表達的影響*

趙 創(chuàng)1,2，李曉燕1,2，陳春蘭1,2，李 淼3，梁 薇1,2，劉志丹1,2△

(1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 201999;2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院寶山分院，上海 201999;3.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200437)

目的：探討艾灸對膠原誘導的關節(jié)炎(CIA)模型小鼠關節(jié)炎及miRNA-155、miRNA-146a、miRNA-21表達的影響。方法：24只雄性DBA/1J小鼠隨機分為正常組、模型組、對照組和艾灸組。正常組之外的小鼠，用Ⅱ型膠原加佐劑尾部皮下注射建立類風濕關節(jié)炎模型。艾灸組小鼠在足三里穴、腎俞予以1 mg/壯的艾灸治療，每只小鼠每穴灸6壯，連續(xù)治療6天為1個療程，共治療2個療程，療程間休息2天。運用CIA小鼠模型多發(fā)性關節(jié)炎指數(shù)評分標準觀察艾灸對關節(jié)腫脹的影響，病變關節(jié)矢狀面切片HE染色觀察關節(jié)炎癥病理表現(xiàn)，Real-time PCR檢測miRNA-155、miRNA-146a、miRNA-21的表達。結果：Ⅱ型膠原及佐劑注射后成功復制膠原誘導的關節(jié)炎小鼠模型。艾灸組在足三里穴(后三里)、腎俞穴給予12次艾灸治療。治療后，艾灸組及對照組小鼠關節(jié)腫脹均有所好轉，關節(jié)評分的重復測量數(shù)據(jù)方差分析顯示：對照組評分明顯高于艾灸組。病理形態(tài)上，與正常小鼠比較，CIA模型小鼠關節(jié)面粗糙、滑膜層變薄，不經治療的對照組小鼠中上述變化有一定程度的自行恢復，而經艾灸治療組小鼠關節(jié)面恢復平整，滑膜層較治療前變厚，與正常組表現(xiàn)較為接近。與正常小鼠比較，CIA模型小鼠miRNA-155、miRNA-146a較正常組表達增多(P<0.05)；艾灸組miRNA-155、miRNA-146a表達下調，與未經治療的對照組比較，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但仍未達到正常水平(與正常組比較P<0.05)。而miRNA-21表達在各組小鼠中，差異無顯著性意義(P>0.05)。結論：艾灸能減輕膠原誘導的關節(jié)炎模型小鼠關節(jié)腫脹，改善滑膜炎癥，其機制可能與下調miRNA-155、miRNA-146a有關。

miRNA;類風濕關節(jié)炎;艾灸;痹證

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以多關節(jié)滑膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)的全身性炎癥性自身免疫性疾病，關節(jié)侵犯呈多發(fā)性、對稱性，主要病理特征為關節(jié)滑膜增厚合并大量炎癥細胞浸潤，血管翳形成及軟骨組織的侵蝕與破壞[1]，屬中醫(yī)“痹癥”范疇，又稱“頑痹”“尪痹”和“白虎歷節(jié)”等。

近年來，大量的臨床報道和實驗動物研究表明：灸法治療類風濕關節(jié)炎有較好的療效[2-3]，能減輕炎癥反應、改善癥狀。其機制可能是改善關節(jié)滑膜細胞細胞器的結構異常[4]，減輕關節(jié)滑膜的充血水腫、炎細胞浸潤、滑膜細胞增生、組織增厚等滲出性變，誘導關節(jié)滑膜細胞的凋亡[5-6]，下調相關炎癥因子的基因和蛋白表達[7-18]。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的、微小的、非編碼的RNA，在轉錄后水平調節(jié)多個靶基因表達。研究表明miRNA在調節(jié)免疫功能中具有重要作用。近年來的研究表明，miRNA在RA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，相關研究發(fā)現(xiàn)在RA患者外周血及關節(jié)滑液中大量miRNA表達異常，如miRNA-155、miRNA-146a、miRNA-21等，并可能影響RA中Th17、Treg細胞的分化及數(shù)量[19]。因此，艾灸是否對RA相關miRNA有積極影響，是需要回答的重要問題。本研究圍繞艾灸對RA動物模型中miRNAs的影響進行了實驗研究，報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與飼養(yǎng)場所

雄性DBA/1J小鼠24只，8～10周齡，南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(蘇)2015-0001。小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組6只。第1組為正常組，后3組混合后進行RA造模，然后再隨機分為模型組、對照組和艾灸組。實驗中，分籠飼養(yǎng)，每籠3只，投放普通小鼠飼料，自然光照，并定期清潔、消毒。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 材料和試劑

牛Ⅱ型膠原： Chondrex公司；福氏完全佐劑(Freunds' Complete adjuvant, FCA)、福氏不完全佐劑(Incomplete Freund's Adjuvant, IFA)： Sigma公司；冰乙酸：上海試劑四廠；石蠟：上海國藥集團；甲醛：上海國藥集團；二甲苯：上海國藥集團;無水乙醇：上海國藥集團；氨水：上海國藥集團；蘇木素：BASO公司；伊紅：BASO；中性樹脂：上海長島生物技術有限公司；哺乳動物淋巴細胞分離液：CEDARLANE公司；Trizol：invitrogen公司；SYBR Green PCR試劑盒：Thermo公司；逆轉錄試劑盒：Fermentas公司。所用化學試劑均為分析純。

1.3 實驗儀器

CX41正置顯微鏡：OLYMPUS公司；石蠟切片機：徠克公司，SQ2125；攤片機：徠克公司，PPTHK-21B；IMS圖象分析系統(tǒng)：基爾頓生物科技(上海)有限公司;D5100數(shù)碼相機：NIKON公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：Thermo Forma公司，3111；Real-time檢測儀：ABI公司，ABI-7300；低溫冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司，TG-16M；水浴鍋：Leica公司，HI1210；成像系統(tǒng)：Tanon Tanon公司，5200。

1.4 膠原誘導的關節(jié)炎模型的建立

18只DBA/1J小鼠建立Ⅱ型膠原誘導的類風濕關節(jié)炎(Collagen induced arthritis,CIA)模型。參照文獻[20]方法：牛Ⅱ型膠原溶解在0.05 mol/L的醋酸中，配制成2 mg/ml的膠原溶液，4℃過夜。冰浴條件下，用樣本均質儀低速混合時滴加等體積的完全弗氏佐劑，配制Ⅱ型膠原乳劑(終濃度為1 mg/ml)。每只200 μl于鼠尾根部皮下注射免疫，21天后按照上述方法100 μl鼠尾基部皮內注射二次免疫。

1.5 艾灸治療

會議邀請了美國Emory大學教授、國家千人計劃特聘教授李曉江博士，以及華中科技大學同濟醫(yī)學院彭挺博士分別作了“轉基因動物在人類疾病中的應用”和“熒光蛋白標記技術在蛋白質定位、相互作用以及動態(tài)追蹤研究中的發(fā)展和應用”大會專題報告。報告精彩紛呈，大家聽的意猶未盡。

艾灸組小鼠均參照文獻[21-23]中大鼠的定位進行取穴,腎俞：第2腰椎棘突下兩旁；足三里穴(后三里)穴：膝關節(jié)后外側，腓骨小頭下方,并用記號筆標記位置。自制小鼠艾灸固定裝置：50 ml離心管，在尾部挖去2 cm2大小的部分,見封三彩圖1；艾灸時將小鼠放入，灸足三里穴時，把后足從挖去的孔中拉出，露出需要艾灸的穴位進行艾灸；灸腎俞穴時，將腰部對準挖去的孔即可。艾灸材料選用南陽艾顏堂艾絨有限責任公司生產的45∶1精制艾絨。將艾絨捏成1 mg/壯的米粒樣大小進行直接灸，每只小鼠每個穴位灸6壯。連續(xù)治療6天為1個療程，共治療2個療程，療程間休息2天。

1.6 關節(jié)腫脹度觀察

自艾灸治療第1日開始，每隔1日對發(fā)病關節(jié)進行關節(jié)炎指數(shù)評分，評分標準參照文獻[24-25]按照CIA小鼠模型多發(fā)性關節(jié)炎指數(shù)評分標準：0分：無紅斑和水腫；1分：兩只足小趾關節(jié)紅斑水腫；2分：全部趾關節(jié)或前腳掌紅斑水腫；3分：踝關節(jié)以下延伸到趾紅斑水腫；4分：踝關節(jié)至全爪紅腫或畸形。每只小鼠四肢評分相加總為關節(jié)炎指數(shù)，最高16分。觀察共進行8次，根據(jù)每次觀察評分結果，繪制曲線圖。

1.7 取材及病理觀察

CIA模型小鼠隨機平均分為模型組、對照組和艾灸組3組，模型組為說明模型小鼠治療前的情況，成模后即處死、取材；對照組不治療，僅進行與艾灸組一樣的抓取，為說明模型小鼠未經治療的15天后的情況，與艾灸組進行對比，成模15天后與艾灸組一同處死、取材。

成模后第15天即艾灸組末次治療后24 h，小鼠頸椎脫臼處死，于75%的酒精中浸泡10～15 min，取新鮮脾臟和踝關節(jié)。脾臟經剪碎、研磨，過200細篩，加入淋巴細胞分離液，3000 rpm離心10 min，離心完畢后吸取中間白膜層即為脾單個核細胞；加入RMPI-1640培養(yǎng)基進行洗滌1次。用紅細胞裂解液去除紅細胞；3000 rpm離心10 min，再次用RMPI-1640培養(yǎng)基進行洗滌1次；洗滌結束后，所得細胞沉淀用RMPI-1640培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù),細胞定量后分管凍存進行后續(xù)實驗。踝關節(jié)經10%福爾馬林固定，石蠟包埋，矢狀面切片，常規(guī)HE染色。

嚴格按照所購總RNA提取試劑盒、Real-Time PCR試劑盒進行操作?？俁NA的提?。杭毎?，Trizol勻漿，先后加入氯仿、異丙醇，離心,棄上清，無水乙醇漂洗沉淀，加入DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。miRNA-155引物：Sense:5′ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATTGTGAT 3′，Antisense:5′CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA CCCCT 3′，反向TRP序列：5′TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；miRNA-146a引物：Sense:5′ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCA 3′,Antisense:5′CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACCCA 3′，反向TRP序列：5′TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；miRNA-21引物：Sense:5′ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA 3′，Antisense:5′CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACA 3′，反向TRP序列：5′TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6引物：F-CTCGCTTCGGCAGCACA, R-AACGCTTCACGAATTTGCGT。反轉錄體系： RNA-Primer Mix：12 μl，5×RT Reaction Buffer：5 μl，25mM dNTPs：1 μl，25 U/μl RNase Inhibitor：1 μl，200 U/μl M-MLV Rtase：1 μl，Oligo(dt)18：1 μl，ddH2O(DNase-free)：4 μl?？傮w積25 μl。反應程序：37℃，60 min；85℃，5 min；4℃，5 min；置于-20℃保存。Real-time PCR擴增體系：SYBRGreen Mix：12.5 μl，上游引物F：0.5 μl，下游引物R：0.5 μl，ddH2O：9.5 μl，cDNA模板：2 μl?？傮w積25 μl。反應程序：95℃，10 min(95℃，15Sec；60℃，45Sec)×40；95℃,15 Sec； 60℃,1 min；95℃,15 Sec；60℃, 15 Sec；數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 關節(jié)形態(tài)變化

圖3 艾灸組與對照組CIA小鼠的關節(jié)評分曲線對比

關節(jié)形態(tài)變化可見封三彩圖2。通過觀察，對照組第1次關節(jié)評分為4.67±1.15(CIA模型的基線)，此時的艾灸組關節(jié)評分為5.17±1.60，二者無顯著性差異；對照組隨后關節(jié)腫脹經歷了加重然后好轉的過程,見圖3，最終未經治療15天后關節(jié)評分為2.0±2.0；而艾灸治療組關節(jié)評分持續(xù)下降，經治療，15天后關節(jié)評分為0.16±0.41。8次關節(jié)評分數(shù)值的重復測量數(shù)據(jù)方差分析顯示，兩組方差不完全相同，由圖3可見，從第6天開始，對照組評分明顯高于艾灸組，這說明艾灸對小鼠關節(jié)腫脹有一定治療作用。

2.2 關節(jié)病理分析

如封三彩圖4所示CIA模型建立后(模型組)，與正常組關節(jié)對比，關節(jié)面粗糙、滑膜層變薄，經艾灸治療的小鼠病變關節(jié)面恢復平整，滑膜層較治療前變厚，與正常組表現(xiàn)較為接近。不經治療的對照組，上述變化有一定程度的自行恢復，但不如艾灸組恢復的好。

2.3 Real-time PCR 檢測miRNA表達

與正常小鼠比較，CIA模型小鼠miRNA-155、miRNA-146a較正常組表達增多(P<0.05)，艾灸治療后，miRNA-155、miRNA-146a表達下調，與未經治療的對照組比較，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但仍未達到正常水平(與正常組比較P<0.05)。而miRNA-21表達在4組小鼠中，差異無顯著性意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 各組小鼠不同時間點血清miRNA表達相對定量 注：與正常組比較，*P<0.05；與艾灸組比較，△P<0.05

3 討論

盡管既往研究報道艾灸治療RA作用顯著，但文獻中少見有艾灸治療后病理改變的圖片，這可能與滑膜及滑膜細胞的改變較難觀察、評估有關，而本研究提供了較為直觀的觀察結果。本研究顯示，艾灸對CIA模型小鼠的關節(jié)腫脹有一定影響，但因為小鼠關節(jié)較小，測量其腫脹度的誤差可能較大，因此，與諸多已發(fā)表的研究一樣，筆者沒有測量、記錄、比較關節(jié)周徑。關節(jié)評分顯示：CIA小鼠關節(jié)功能可一定程度自我恢復，但艾灸能進一步提高效果；這與筆者在臨床上觀察到的現(xiàn)象相對一致。

研究顯示：miRNA-146a在RA發(fā)病過程中起到重要作用。miRNA-146a、miRNA-155在RA患者滑膜組織中的表達水平明顯高于健康正常人[26]。與骨性關節(jié)炎(OA)患者相比，RA患者滑膜中的miRNA-146a呈現(xiàn)高表達[27]。因此，可以認為RA中miRNA-146a可能參與RA發(fā)病。本研究中，CIA模型小鼠中miRNA-146a表達增高，艾灸治療后下降，說明艾灸治療的作用機制可能與下調miRNA-146a表達有關。

miRNA-155在RA患者滑膜組織中的表達水平明顯高于健康正常人，并且其在RA患者滑膜成纖維細胞中的表達水平高于其在外周血中的表達水平[26]。在RA外周血及外周巨噬細胞中測定TNF-α、IL-1β釋放水平和miRNA-155的表達水平發(fā)現(xiàn)miRNA-155能夠靶向抑制SOCS1(Suppressor of cytokine signaling-1)的表達，且miRNA-155高表達與TNF-α、IL-1β表達增強之間存在相關性[28]。這說明miRNA-146a也在RA發(fā)病過程中起到重要作用。本研究中，CIA模型小鼠中miRNA-155表達增高，艾灸治療后下降，說明艾灸治療的作用機制可能與下調miRNA-155表達有關。

miRNA-21則可能參與RA中Th17/Treg細胞失衡的調節(jié)：Dong等[29]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，miRNA-21在RA外周血中呈現(xiàn)低表達，伴有STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription，信號傳導與轉錄激活因子)的表達、活化增加，并降低STAT5/pSTAT5蛋白和Foxp3 mRNA表達水平，進而促進T細胞向Th17細胞方向分化，破壞體內Th17/Treg細胞的平衡，加快疾病發(fā)展進程。本研究中，miRNA-21表達在4組小鼠中無顯著性差異，是一個意外的發(fā)現(xiàn)，是否與該品系的小鼠自身特性有關，還是人、鼠之間的差異，有待進一步研究。

miRNAs參與的生命活動和機體的調節(jié)作用十分復雜，究竟哪些miRNA與艾灸治療的作用靶點有關，還有待進一步明確，miRNA網絡分析方法[30]為未來的研究提供了有力的技術平臺，值得深入研究。

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收稿日期：2016-12-29

Moxibustion for CIA Mice and the Expressions of miRNA-155, miRNA-146a, and miRNA-21

ZHAO Chuang1,2, LI Xiao-yan1,2, CHEN Chun-lan1,2, LI Miao3，LIANG Wei1,2，LIU Zhi-dan1,2△

(1.ShanghaiBaoshanHospitalofIntegratedTraditionalChineseMedicineandWesternMedicine,Shanghai201999,China; 2.BaoshanBranchofShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201999,China; 3.YueyangHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China)

Objective：To observe the effect of moxibustion on arthritis and the expressions of miRNA-155, miRNA-146a, and miRNA-21 in the model mice with collagen induced arthritis(CIA).Methods：24 male mice of DBA/1J were randomly divided into the normal group, the model group, the control group and the moxibustion group. Mice model of rheumatoid arthritis(RA) was induced by injection of typeⅡ collagen. Moxibustion was applied to point ST36 and BL23 in the RA mice in the moxibustion group for 12 days, the ankle swelling was evaluated by RA scale; the pathological changes of articular cavity and synovial membrane were observed by HE analysis; the expressions of miRNA-155, miRNA-146a, and miRNA-21 were detected by Real-time PCR.Results：CIA model was successfully established by injection of typeⅡ collagen. The swelling joint of CIA mice partly recovered in the moxibustion group and in the control group. Difference was shown between the two groups by variability analysis of repeated eight-time measurement data of joint scale score. The joint synovial layer in the CIA mice were roughen and thinner than the normal mice, certain degree of self-repairing was observed in the control group; however, the synovial layers were much smoother and thicker in the moxibustion group compared to the control group, which were close to those in the normal group. The expressions of miRNA-155 and miRNA-146a increased in the model group compared to the normal group(P<0.05); whereas they decreased in the moxibustion group with a significant difference compared to the control group(P<0.05), but they didn’t reach the level of the normal group(P<0.05). No differences were observed among all groups in terms of miRNA-21 expression(P>0.05). Conclusion：Moxibustion can improve the joint swelling and pathological synovial changes in RA mice, and the mechanism may be related to the down-regulation of miRNA-155 and miRNA-146a expressions.

miRNA; Rheumatoid arthritis; Moxibustion; Bi syndrome

2016-11-14

國家自然科學基金青年科學基金項目,編號：81403465;上海市“杏林新星”計劃項目，編號：ZY3-RCPY-2-2041;上海市寶山區(qū)衛(wèi)生青年醫(yī)學人才培養(yǎng)項目，編號：bswsyq-2014-A05。

趙創(chuàng)(1987-)，女，住院醫(yī)師，主要從事針灸臨床工作。

△通訊作者：劉志丹(1981-)，男，主治醫(yī)師，主要從事針灸臨床研究工作。

R245.81

A

1005-0779(2017)06-0060-05