孟建宇，李 蘅，唐 凱，宋凱凱，馮福應(yīng)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011）

兩株氫噬胞菌的萘降解特性分析

孟建宇，李 蘅，唐 凱，宋凱凱，馮福應(yīng)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011）

對(duì)兩株分離自?xún)?nèi)蒙古烏梁素海的氫噬胞菌X32和X12的培養(yǎng)條件和萘降解特性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：菌株X32和X12的最適生長(zhǎng)pH為7.0，最適生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃，最適鹽度w（NaCl）為1%；當(dāng)初始萘質(zhì)量濃度為3 500 mg/L時(shí)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株X32對(duì)萘的降解活性可達(dá)53.9 nmol/（mg·min），而菌株X12可達(dá)34.8 nmol/（mg·min）；菌株X32在培養(yǎng)48 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，60 h時(shí)萘降解率達(dá)91.43%；菌株X12在培養(yǎng)60 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，90 h時(shí)萘降解率達(dá)93.93%。氫噬胞菌X32和X12是兩株具有較高應(yīng)用價(jià)值的多環(huán)芳烴降解細(xì)菌。

氫噬胞菌；多環(huán)芳烴；萘降解菌；生長(zhǎng)條件；降解特性

多環(huán)芳烴（PAHs）廣泛分布于大氣、水體和土壤中，由其造成的污染給生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康帶來(lái)很大的潛在危害［1-3］。大量的研究證明，在諸多方法中，生物降解法是去除環(huán)境中PAHs 的最主要途徑［4］。微生物是PAHs降解最主要和最重要的生物類(lèi)群，以微生物降解和轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的生物修復(fù)技術(shù)則是解決PAHs污染問(wèn)題的重要手段［5-6］。因此，PAHs污染的微生物修復(fù)技術(shù)一直是國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)［7］。

萘是PAHs中分子量最小且結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的物質(zhì)，是進(jìn)行PAHs降解研究的常用典型化合物［8］。目前，以萘作為唯一碳源分離得到的菌種主要包括產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）、伯克氏菌屬（Burkholderia sp.）、分支桿菌屬（Mycobacterium sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、勞爾氏菌屬（Ralstonia sp.）、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp.）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）和細(xì)桿菌屬（Microbacterium sp.）等［9-12］。新的高效降解菌株的篩選和研究相對(duì)不足［13-15］，因此探尋具有較高降解活性的優(yōu)良菌種在PAHs的環(huán)境治理方面就顯得格外重要［16］。而可降解PAHs的氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga sp.）的菌株發(fā)現(xiàn)極少，僅見(jiàn)1株由宋昊等［5］分離到的萘降解菌H. Palleronii LHJ38。

本工作考察了分離自?xún)?nèi)蒙古烏梁素海的兩株氫噬胞菌（Hydrogenophaga sp.）的生長(zhǎng)特性和萘降解能力，為合理有效利用微生物去除PAHs有害物質(zhì)提供了高效穩(wěn)定的菌種來(lái)源。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和材料

環(huán)己烷（分析純）、Folin-酚試劑：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

萘降解菌實(shí)驗(yàn)菌種：兩株氫噬胞菌Hydrogenophaga sp. X32和Hydrogenophaga sp. X12（簡(jiǎn)稱(chēng)菌株X32和X12），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所分離自?xún)?nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市烏拉特前旗烏梁素海。

微量元素溶液（TES）：FeCl30.05 g，H3BO30.01 g，MnSO4·H2O 0.02 g，CuSO4·5H2O 0.01 g，（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.02 g，ZnSO40.01 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，乙二胺四乙酸（EDTA） 0.5 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0。

菌株活化培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.1 g，酵母粉 2 g，K2HPO40.2 g，NaCl 5 g，TES 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：Na2HPO49.0 g，KH2PO41.5 g，NH4Cl 2.0 g，CoCl2·6H2O 15.3 mg，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 3.0 mg，ZnSO4·7H2O 0.2 mg，蒸餾水1 000 mL， pH 7.0。碳源萘的添加：用少量丙酮完全溶解實(shí)驗(yàn)所需用量的萘，將其滴加至滅菌后的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，加蓋密封。

1.2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)和萘降解曲線(xiàn)的測(cè)定

將菌株X32和X12的單菌落分別接種至多個(gè)含30 mL萘初始質(zhì)量濃度為3 500 mg/L的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30 ℃、pH=7.0、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測(cè)定培養(yǎng)液在650 nm處的吸光度（A650，此值與菌液濃度成正比，可間接表示菌生長(zhǎng)量），計(jì)算萘的質(zhì)量濃度。

1.3 最適生長(zhǎng)條件的確定

分別考察菌株X12和X32的最適生長(zhǎng)pH，最適生長(zhǎng)鹽濃度和最適生長(zhǎng)溫度。每個(gè)梯度3個(gè)平行樣，于搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測(cè)定培養(yǎng)液的A650。

1.4 萘降解活性的測(cè)定

將菌株X32和X12的培養(yǎng)液離心分離，收集菌體，制成每毫升含1 mg濕菌體的菌懸液。取200 μL萘質(zhì)量濃度為3 500 mg/L的萘-丙酮溶液溶于30 mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，接種100 μL菌懸液，立刻用硅膠密封管口，在最適培養(yǎng)條件下振蕩3 h。取4mL培養(yǎng)液，加入0.4 mL濃度為1 mol/L的鹽酸，終止反應(yīng)。用4 mL環(huán)己烷萃取培養(yǎng)液中剩余的萘，測(cè)定萃取液在275 nm處的吸光度（AM）。同時(shí)，用4 mL環(huán)己烷對(duì)4 mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（作為空白）進(jìn)行萃取，測(cè)定萃取液在275 nm處的吸光度（A0）。菌株X32和X12對(duì)萘的降解活性（ξ）定義為單位質(zhì)量的菌體（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）在單位時(shí)間內(nèi)降解萘的物質(zhì)的量［5］，單位為nmol/（mg·min），計(jì)算公式見(jiàn)式（1）。

式中，VEXM為環(huán)己烷的體積，mL；VCS為菌懸液的體積，mL；k為萘在本實(shí)驗(yàn)條件下的摩爾吸光系數(shù)，1.260 3×102L/（mol·cm）；1為比色皿光程長(zhǎng)度，cm；ρpro為菌懸液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/ mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.5 分析方法

菌液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Folin-酚試劑法［17］。

萘質(zhì)量濃度的測(cè)定：以環(huán)己烷為參比，測(cè)定含不同濃度萘的環(huán)己烷萃取液在275 nm處的吸光度。在所選擇的萘濃度（c，mmol/L）范圍（0～0.3mmol/L）內(nèi)，萘濃度與其相應(yīng)的吸光度（A）呈直線(xiàn)關(guān)系，回歸方程為A=0.1260 3c，得出萘在環(huán)己烷中的摩爾吸光系數(shù)為1.260 3×102L/（mol·cm）。降解液中加入等體積環(huán)己烷，劇烈振蕩30 min，相分離后用適量環(huán)己烷適當(dāng)稀釋萃取液，在275 nm處以環(huán)己烷為參比測(cè)定其吸光度，計(jì)算反應(yīng)液中萘的濃度，并折算成萘的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

圖1 菌株X32和X12的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)

菌株X32和X12的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)：菌株X32的延滯期為0～12 h，12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，48 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期；菌株X12的延滯期為0～24h，24 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，60 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.2 最適生長(zhǎng)條件

pH、溫度和鹽度（w（NaCl），%）對(duì)菌株X32和X12生長(zhǎng)的影響分別見(jiàn)圖2～4。由圖2可見(jiàn)，菌株X32和X12在pH 6.5～8.5都可生長(zhǎng)，pH 7.0時(shí)生長(zhǎng)最好，為最適生長(zhǎng)pH，與已報(bào)道的多數(shù)萘降解菌［10，15-16，18-20］相同，但與菌株H. Palleronii LHJ38（最適pH 6.6）［5］有所不同。由圖3可見(jiàn)，30～35 ℃為兩株菌的最適生長(zhǎng)溫度范圍，這與多種萘降解菌［15-16，18，20］類(lèi)似，但也與菌株H. Palleronii LHJ38（最適溫度28 ℃）［5］有所不同。由圖4可見(jiàn)：兩菌株在鹽度小于2%時(shí)，生長(zhǎng)良好；鹽度為1 %時(shí)，生長(zhǎng)最好，有一定的耐鹽性；當(dāng)鹽度達(dá)到3%時(shí)，生長(zhǎng)受到極大的抑制。

圖2 pH對(duì)菌株X32和X12生長(zhǎng)的影響

圖3 溫度對(duì)菌株X32和X12生長(zhǎng)的影響

圖4 鹽度對(duì)菌株X32和X12生長(zhǎng)的影響

2.3 萘降解曲線(xiàn)及降解活性

在最適條件下，菌株X32和X12對(duì)萘的降解曲線(xiàn)見(jiàn)圖5。

圖5 菌株X32和X12對(duì)萘的降解曲線(xiàn)

由圖5可見(jiàn)：兩菌在延滯期的萘降解率均極低，而當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，即細(xì)菌生長(zhǎng)速率最快時(shí)，萘降解率快速增加；進(jìn)入穩(wěn)定期后，兩菌的降解曲線(xiàn)出現(xiàn)拐點(diǎn)，菌株X32在培養(yǎng)60 h時(shí)萘降解率達(dá)91.43%，隨后增長(zhǎng)趨緩；菌株X12在培養(yǎng)90 h時(shí)萘降解率達(dá)93.93%，隨后增長(zhǎng)趨緩。經(jīng)計(jì)算，菌株X32在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（培養(yǎng)12～48 h）時(shí)對(duì)萘的降解活性達(dá)53.9 nmol/（mg·min），高于菌株H. PalleroniiLHJ38的萘降解活性（47.3 nmol/（mg·min））［5］，而菌株X12在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（培養(yǎng)24～60 h）時(shí)對(duì)萘的降解活性達(dá)34.8 nmol/（mg·min）。

3 結(jié)論

a）氫噬胞菌Hydrogenophaga sp. X32的生長(zhǎng)延滯期為0～12 h，12～48 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，48 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；氫噬胞菌Hydrogenophaga sp. X12的生長(zhǎng)延滯期為0～24 h，24～60 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，60 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

b）菌株X32和菌株X12的最適培養(yǎng)條件為：pH 7.0，生長(zhǎng)溫度30～35 ℃，鹽度1%。

c）在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，菌株X32和X12對(duì)初始質(zhì)量濃度為3 500 mg/L的萘的降解活性分別達(dá)53.9 nmol/（mg · min）和 34.8 nmol/（mg· min）；進(jìn)入穩(wěn)定期后，菌株X32在培養(yǎng)60 h時(shí)萘降解率達(dá)91.43%，菌株X12在培養(yǎng)90 h時(shí)萘降解率達(dá)93.93%。因此，菌株X32和X12是兩株具有很高多環(huán)芳烴（PAHs）污染治理應(yīng)用價(jià)值的細(xì)菌。對(duì)其降解性能和降解機(jī)制的深入研究，可為PAHs的微生物修復(fù)提供新的可行性途徑。

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（編輯 葉晶菁）

Analysis on naphthalene degradation characteristics of two Hydrogenophaga sp. strains

Meng Jianyu，Li Heng，Tang Kai，Song Kaikai，F(xiàn)eng Fuying
（Institution of Applied and Environmental Microbiology，College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot Inner Mongolia 010011，China）

The culture conditions and naphthalene degradation characteristics of Hydrogenophaga sp. X32 and Hydrogenophaga sp. X12，which were isolated from Wuliangsuhai Lake of Inner Mongolia，were studied. The experimental results showed that：The optimal growth pH value was 7.0，the optimal growth temperature was 30-35℃ and the optimal salt concentration was 1%；When the initial naphthalene mass concentration was 3 500 mg/L，the naphthalene-degrading activity of X32 in logarithmic growth phase was 53.9 nmol/（mg·min），while that of X12 was 34.8 nmol/（mg·min）；After 48 h of cultivation，the strain X32 was in steady growth phase，and the naphthalene degradation rate was 91.43% in 60 h；After 60 h of cultivation，the strain X12 was in steady growth phase，and the naphthalene degradation rate was 93.93% in 90 h. Hydrogenophaga sp. X32 and Hydrogenophaga sp. X12 were two PAHs-degrading bacterial strains with high application value.

Hydrogenophaga sp.；polycyclic aromatic hydrocarbon；naphthalene-degrading bacteria；growth condition；degradation characteristics

X172

A

1006-1878（2017）03-0300-04

10.3969/j.issn.1006-1878.2017.03.008

2016 - 10 - 08；

2017 - 02 - 17。

孟建宇（1977—），男，內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市人，碩士，副教授，電話(huà) 0471 - 6508315，電郵 meng_jianyu@ imau.edu.cn。聯(lián)系人：李蘅，電話(huà) 0471 - 6508315，電郵liheng0123@sina.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （31460002，31560030）；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （2015MS0355）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目 （NJZY14084）。