俞發(fā)榮，楊 博，連秀珍，謝明仁，李登樓，張詩爽，陳望軍，郭蘊萱

(甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

◇研究簡報◇

十八碳烯酸對人MGC-803細胞毒性作用機制研究

俞發(fā)榮，楊 博，連秀珍，謝明仁，李登樓，張詩爽，陳望軍，郭蘊萱

(甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

人類與癌癥的斗爭已兩千多年，至今已取得了突破性的進展。但是，癌癥的危害仍未得到充分遏制。癌癥不僅發(fā)病率、死亡率上升迅猛，而且發(fā)病年齡明顯降低。癌癥已由死因的第3位升至第1位，超過了腦血管病和心臟病，成為人類的“第一殺手”。尋找有效的抗癌癥藥物與方法, 徹底攻克癌癥, 已成為無數(shù)科學(xué)家和臨床醫(yī)生夢寐以求的理想。從2002年開始至今，我們與美國佛羅里達大學(xué)生物技術(shù)研究中心合作，在前期研究的基礎(chǔ)上，通過改進實驗條件和方法，將甘肅貓兒眼(甘遂Euphorbiaceae:Euphorbiakansui)提取分離出十八碳烯酸，給予人胃癌細胞，研究對腫瘤細胞增殖的抑制作用及其機制，為甘肅貓兒眼的進一步研究開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器 十八碳烯酸:由蘭州大學(xué)化工學(xué)院天然植物研究所從甘肅天水產(chǎn)的貓兒眼提取分離制得，其組分由中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所采用GC-MS(HP6890/5973)分離，鑒定為十八碳烯酸(octadecenoic acid)，分子式：C18H32O2，分子質(zhì)量：280.43，純度:98.13%,為無色透明液體。實驗時，用二甲基亞砜(DMSO)助溶加RPMI 1640培養(yǎng)液配制成所需濃度(DMSO含量為30 μl·L-1)；5-氟尿嘧啶(5-FU)：上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號20150409. RPMI 1640：Grand Island N.Y.14072 USA； 胎牛血清：中美合資蘭州民海生物工程有限公司生產(chǎn)，批號：20150603； 噻唑藍(MTT)：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供；酶聯(lián)免疫檢測儀：購于上海雷勃分析儀器有限公司(MULTISKAN MK3)；流式細胞儀：Coulter EPICS XL型，USA； 96孔板：Costar 3599，Corning，NY14831，USA。

1.2 細胞系 人胃癌細胞系，由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥理毒理實驗中心惠贈。全部實驗在甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點實驗室完成。

1.3 人胃癌細胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇的人胃癌細胞置于內(nèi)含10%的胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素、1×105U·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，5%CO2，37℃，飽和濕度條件中傳代培養(yǎng)。

1.4 十八碳烯酸對人胃癌細胞毒性作用實驗 取人胃癌細胞濃度為2×107個·L-1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔90 μL。十八碳烯酸：設(shè)3個濃度(0.2、0.4、0.8 mg·L-1，PBS液配制)，每孔加10 μL；5-FU組：每孔加5-FU(10 mg·L-1，PBS液配制)10 μL；對照組加等量PBS液。各設(shè)4個重復(fù)孔。置5%CO2孵育箱中37℃，飽和濕度條件培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)6、12、18、24和48 h各取1板加0.4%臺盼藍每孔10 μL，用血球計數(shù)板在光鏡下計活細胞數(shù)，取平均值，以時間為橫坐標，活細胞數(shù)為縱坐標作圖。

1.5 十八碳烯酸對人胃癌細胞增殖的影響 將人胃癌細胞置于內(nèi)含10%的胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素、1×105U·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，5%CO2，37℃，飽和濕度條件中培養(yǎng)。當細胞增殖生長到對數(shù)期，取培養(yǎng)細胞以2×107個·L-1的密度分別接種于96孔板，其中每孔加RPMI1640培養(yǎng)液180 μL。給藥組：設(shè)3個濃度(0.2、0.4、0.8 mg·L-1，PBS液配制)，每孔加藥20 μL；5-FU組：每孔加5-FU(10 mg·L-1，PBS液配制)20 μL；對照組加等量PBS液。每組4個重復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，加MTT(5 g·L-1，PBS液配制)每孔10 μL，孵育4 h，每孔加DMSO 100 μL，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在494 nm處測其OD值，計算細胞增殖抑制率(IR%)。

1.6 十八碳烯酸對人胃癌細胞凋亡的影響 取15 mL培養(yǎng)瓶7個，每瓶加RPMI1640培養(yǎng)液6 mL，加人胃癌細胞液2 mL(細胞密度為2×107個·L-1)，給藥組分別加入十八碳烯酸 0.2、0.4、0.8 mg·L-1和5-Fu各0.8 mL；空白對照組加等量的PBS，培養(yǎng)48 h后，離心收集細胞，PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇固定24 h，離心棄乙醇，加PBS洗1次，加入Rnase(200 mg·L-1) 0.5 mL,37℃放置4 h，離心，棄上清，PBS洗一次，加0.5 mL碘化丙啶(propidium iodine, PI,20 mg·L-1),4℃，避光染色30 min，用流式細胞儀測定凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。十八碳烯酸對人胃癌細胞毒性作用以百分比表示，組間差異采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 十八碳烯酸對人胃癌細胞毒性作用 分別給予人胃癌細胞5-FU和十八碳烯酸 0.2、0.4、0.8 mg·L-1培養(yǎng)48 h，在光鏡下計數(shù)活細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活細胞數(shù)隨給藥濃度的增加和作用時間的延長而減少。

2.2 十八碳烯酸對人胃癌細胞增殖的抑制作用 分別給予人胃癌細胞十八碳烯酸0.2、0.4、0.8 mg·L-1和5-FU培養(yǎng)48 h，用MTT法測定，人胃癌細胞增殖抑制率分別為46.48%、62.99%、74.92%和60.55%，半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.21 mg·L-1。

2.3 十八碳烯酸對人胃癌細胞凋亡的影響 分別給予人胃癌細胞十八碳烯酸 0.2、0.4、0.8 mg·L-1和5-FU培養(yǎng)48 h，用流式細胞儀測得凋亡率分別為16.42%、21.26%、25.64%和18.23%。見Tab 1。

Tab 1 Effects of octadecenoic acid on MGC-803 cell apoptosis

3 討論

十八碳烯酸是從甘肅貓兒眼(甘遂)中提取分離出的多不飽和脂肪酸[1]。多不飽和脂肪酸是人體必需的不飽和脂肪酸[2]，是重要的營養(yǎng)物質(zhì)[3]。多不飽和脂肪酸能通過誘導(dǎo)細胞凋亡[4]，抑制腫瘤細胞的增殖[5]和血管生成[6]，并能抑制腫瘤細胞的侵襲[7]和轉(zhuǎn)移[8]。本文將十八碳烯酸給予人胃癌細胞分別于培養(yǎng)6、12、18、24和48 h，臺盼藍染色(正常的活細胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺盼藍，使之不能夠進入胞內(nèi)；細胞膜結(jié)構(gòu)破環(huán)，通透性增加，可被臺盼藍染成藍色)、MTT法檢測(活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜并沉積在細胞中，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度，活細胞越多，吸光度就越高；若線粒體結(jié)構(gòu)損傷，不能將外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜，吸光度就隨之降低)和光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果，隨給藥濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長，破裂死亡的細胞數(shù)增多，細胞增殖的抑制率就越高；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，給藥組G0期和G1期細胞數(shù)比對照組明顯升高，G2期和M期細胞明顯減少，細胞阻滯于G0期和G1期，進入G2期和M期的細胞減少,起到抑制細胞分裂增殖和促進細胞凋亡的作用。

以上結(jié)果表明，十八碳烯酸對人胃癌細胞具有明顯的毒性作用，其機制與十八碳烯酸破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，抑制細胞分裂，損傷線粒體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞凋亡、破裂、死亡等有關(guān)。實驗結(jié)果為進一步研究開發(fā)和十八碳烯酸的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

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Toxicity mechanism of octadecenoic acid on MGC-803 cells

YU Fa-rong, YANG Bo, LIAN Xiu-zhen, XIE Ming-ren, LI Deng-lou, ZHANG Shi-shuang, CHEN Wang-jun， GUO Yun-xuan

(KeyLaboratoryofEvidenceofScienceandTechnologyResearchandApplication,GansuProvince,Lanzhou730070,China)

甘肅貓兒眼；十八碳烯酸; 人胃癌細胞；毒性作用; 細胞增殖; 細胞凋亡

maoeryan of Gansu origin； octadecenoic acid; MGC-803 cells; toxic effect；cell proliferation；cell apoptosis

時間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.056.html

201701-03，

2017-02-18

甘肅省基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項目(No 145RJIA333)；蘭州市科技計劃項目(No 2014-1-182; 2015-3-80)；蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目；甘肅省高校科技創(chuàng)新團隊項目(No 2016C-09)；西北民族地區(qū)偵查理論與實務(wù)研究中心項目；甘肅政法學(xué)院重大科研項目

俞發(fā)榮(1959-)，男，博士，研究員,研究方向：腫瘤藥物學(xué)、行為心理學(xué),E-mail: tim9898@163.com; 謝明仁(1977-),男，碩士，副教授，研究方向：物證科學(xué)技術(shù),通訊作者，E-mail: xmr7600@gsli.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.028

A

1001-1978(2017)06-0887-02

R282.71；R329.24；R329.25；R735.202.2