尹作靜,曹志偉,閆鑫淼,陽奕琰,盛 振

(同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092)

黃連素和吳茱萸堿協(xié)同抗癌的miRNA網(wǎng)絡(luò)機(jī)制研究

尹作靜,曹志偉,閆鑫淼,陽奕琰,盛 振

(同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092)

目的 從miRNA 及其調(diào)控的通路網(wǎng)絡(luò)水平，研究黃連素和吳茱萸堿產(chǎn)生協(xié)同抗癌作用的機(jī)制。 方法 先在細(xì)胞水平上驗證并詳細(xì)分析了黃連素與吳茱萸堿對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，確定了二者的劑量效應(yīng)范圍及協(xié)同作用產(chǎn)生的濃度配比，然后采用基因表達(dá)芯片技術(shù)分析了黃連素和吳茱萸堿處理后的肝癌細(xì)胞BEL-7402的miRNA表達(dá)譜，通過構(gòu)建miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，對二者的協(xié)同作用機(jī)制進(jìn)行闡釋。 結(jié)果 黃連素與吳茱萸堿合用可以明顯協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402的增殖能力； 合用后產(chǎn)生的差異miRNA(DEmiRNA) 主要參與MAPK信號通路、內(nèi)吞通路及胰島素信號通路等癌癥增殖相關(guān)通路的調(diào)控；合用影響的特異的靶基因既涵蓋了通路上游細(xì)胞膜上的3類膜受體，又參與到下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)論 從miRNA的調(diào)控關(guān)系可以看出，黃連素可能在兩藥協(xié)同抑癌作用中起著主要的作用。 黃連素和吳茱萸堿在miRNA水平上協(xié)同機(jī)制的闡釋，為今后協(xié)同藥物組合的發(fā)現(xiàn)提供了一種新的思路。

黃連素；吳茱萸堿；聯(lián)合用藥；協(xié)同用藥；作用機(jī)制；KEGG通路；通路網(wǎng)絡(luò)

癌癥，由于其高發(fā)病率和高致死率，在參與藥物研發(fā)的疾病中所占比重逐年增長[1]。在傳統(tǒng)的癌癥治療中，“單成分-單靶點”的藥物往往由于腫瘤細(xì)胞耐藥性的迅速產(chǎn)生而逐漸失去療效[2]，或者由于對機(jī)體的毒副作用大，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量而導(dǎo)致治療效果不佳[3]。而協(xié)同藥物組合，比單藥療法具有更好的整體治療效果，并且具有增效減毒，劑量降低的優(yōu)勢，日益受到藥物研發(fā)人員和臨床醫(yī)生的青睞[4]。

目前關(guān)于協(xié)同作用機(jī)制的研究主要是從藥物作用后影響的單個生物學(xué)過程如細(xì)胞凋亡等來研究，或只考慮了單一的通路上基因表達(dá)的變化[5]。2009年，新加坡國立大學(xué)Yuzong Chen教授課題組對藥物組合進(jìn)行了歸類，并針對每一類藥物組合，探索了它們的作用機(jī)制。他們的研究指出，藥物效應(yīng)上的協(xié)同作用以及藥物代謝上的增效作用被認(rèn)為是有效的藥物組合。其中，藥物效應(yīng)上的協(xié)同作用主要通過藥物靶向到疾病網(wǎng)絡(luò)的不同位置來實現(xiàn)的[6]。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達(dá)與多種癌癥的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[7]，大約50%得到注解的miRNA在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點，這說明miRNA可能在腫瘤發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用[8]。并有研究顯示，中藥及其成分可以通過影響表達(dá)異常的miRNA來調(diào)控相應(yīng)靶基因或靶蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[9]。因為miRNA與其靶mRNA的調(diào)控關(guān)系是多對多的，不同的miRNA可以通過調(diào)控關(guān)系與它們的靶mRNA形成特定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)模塊，從而相互協(xié)同地發(fā)揮作用[9]。中藥多成分之間可能也會通過調(diào)節(jié)不同miRNA的表達(dá)，從而協(xié)同地改變了特異性mRNA的翻譯活性，進(jìn)而產(chǎn)生特定的藥理學(xué)協(xié)同效應(yīng)。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，中藥單體化合物黃連素與吳茱萸堿具有多種抗腫瘤作用，包括抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、減少腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移等[10]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用這兩種中藥成分在胃癌等癌癥中有明顯的協(xié)同抗癌效果[11]。然而，其協(xié)同抑癌作用機(jī)制還不夠清楚。

本文主要從黃連素和吳茱萸堿單用及合用于肝癌細(xì)胞后miRNA表達(dá)水平的變化及其對靶基因的調(diào)控，結(jié)合KEGG通路網(wǎng)絡(luò)，從通路網(wǎng)絡(luò)層面分析兩藥產(chǎn)生協(xié)同作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 BEL-7402細(xì)胞以5 ×108·L-1培養(yǎng)于10 cm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁生長12 h后，據(jù)MTT實驗結(jié)果，分別加入單藥或者合用藥物的IC50劑量處理BEL-7402細(xì)胞24 h。抽提和純化RNA，并做miRNA芯片實驗。實驗分成4組：對照組、黃連素處理組(BER)、吳茱萸堿處理組(EVO)、黃連素和吳茱萸堿合用處理組(BER+EVO)。

1.2 miRNA芯片數(shù)據(jù)的獲得及差異miRNA的篩選 黃連素和吳茱萸堿單用和合用于肝癌細(xì)胞BEL-7402后的miRNA芯片，由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。芯片平臺是Agilent human miRNA(8×15k) v12.0芯片(design ID：21827)，每組包括4個樣本，14 752個miRNA。

歸一化后的芯片數(shù)據(jù)，通過以下參數(shù)來篩選差異表達(dá)的miRNA：① 倍數(shù)差異(Fold Change)：一般寫成FC，就是將待比較的兩個標(biāo)準(zhǔn)化以后的信號相除得到的數(shù)值。即Fold Change = Signal A/Signal B。② 顯著性檢驗：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)t檢驗，計算P值。③ 每個探針點的Flag值/Call值，表達(dá)譜芯片中用A、P、M來表示3種不同的情況：A-Absent，表示該探針點信號與背景信號差異無顯著性；P-Present，表示該探針點信號與背景信號差異具有顯著性；M-Marginal，表示該探針點的信號與背景的差異介于A和P之間。

本實驗確認(rèn)差異表達(dá)miRNA的參數(shù)如下：①P<0.05，并且FC>=2或FC<=0.5；② 每個探針點的Flag值設(shè)定閾值為至少一組內(nèi)不出現(xiàn)A。

1.3 差異miRNA對應(yīng)靶基因的篩選及功能富集 將篩選出的差異的miRNA通過miRWalk軟件查找到對應(yīng)的靶基因。miRWalk軟件收集了來自5個數(shù)據(jù)庫的miRNA對應(yīng)的靶基因信息，分別包括miRWalk、miRanda、Pictar2、RNA2、Targetscan。為了確保查找到的靶基因的準(zhǔn)確性，選擇至少在4個數(shù)據(jù)庫中被證實的靶基因。

為分析差異miRNA影響的生物學(xué)功能，分別將差異miRNA對應(yīng)的靶基因通過DAVID軟件富集到GO生物學(xué)過程和KEGG通路中，取FDR<0.01。并對富集的GO生物學(xué)過程用DAVID軟件中的clustering做聚類分析，對聚為一類的GO生物學(xué)過程的FDR值取平均，作為新聚成的GO生物學(xué)過程的顯著性P值。

為分析合用后影響的通路中的基因組成，分別以合用后影響的4類靶基因(合用特異的靶基因、分別與兩藥單用共同的靶基因、單用及合用共同的靶基因)與富集通路中基因的交集在通路總基因中所占的比例作為此類靶基因?qū)τ谠摋l富集通路的貢獻(xiàn)率，比值越大，表示貢獻(xiàn)率越大。并對于4類靶基因，取其與某條通路基因的交集與其在所有靶基因中所占的比例做卡方檢驗，如果P值小于0.05，則認(rèn)為該通路對靶基因的選擇具有偏好性。

1.4 KEGG通路的網(wǎng)絡(luò)分析 將KEGG中目前存在的所有通路蛋白或基因的調(diào)控關(guān)系解析出來，針對用藥后靶基因富集的幾條明顯通路，構(gòu)建通路網(wǎng)絡(luò)，并聯(lián)合藥物作用后的差異miRNA的調(diào)控信息，從通路網(wǎng)絡(luò)的角度分析兩藥協(xié)同作用的機(jī)制。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩藥合用的協(xié)同效果分析 由Fig 1看出：黃連素和吳茱萸堿都可以抑制腫瘤細(xì)胞BEL-7402的增殖。48 h處理后的IC50值分別為：黃連素57.36 μmol·L-1，吳茱萸堿4.68 μmol·L1。 這一結(jié)果表明吳茱萸堿對BEL-7402的毒性作用可能略強(qiáng)于黃連素。另外，根據(jù)CI分析，二者合用(黃連素 ∶吳茱萸堿=10 ∶1)情況下，其CI值大部分都小于1，表明二者可以產(chǎn)生協(xié)同作用[12]。為了從miRNA水平上解釋兩藥協(xié)同作用的機(jī)制，本文選用miRNA芯片對藥物處理24 h 前后 BEL-7402細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)量的變化進(jìn)行檢測。

Fig 1 Influence of drugs on proliferation of liver cancer cell BEL-7402

The left figure stands for the dose-effect relationship. The ratio of berberine and evodiamine is 10 ∶1, and the X axis stands for the dose of berberine. The right figure stands for the CI value of the combination of berberine and evodiamine. If the CI is less than 1, it stands for the synergistic effect

Fig 2 The quality control of miRNA chips

2.2 miRNA芯片的質(zhì)量分析 為檢測miRNA芯片的質(zhì)量，根據(jù)芯片結(jié)果，繪制不同處理條件下miRNA平均表達(dá)值的散點圖，由Fig 2看出，4種不同處理條件下miRNA的平均表達(dá)值沒有偏離正對角線，表明芯片的質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的分析。

2.3 差異miRNA的篩選和靶基因預(yù)測及功能富集 黃連素和吳茱萸堿單用及合用后差異表達(dá)的miRNA分別有10、5、32個(其中上調(diào)分別為4、4、9個，下調(diào)分別為6、1、23個)。 合用后影響的miRNA中有3個(hsa-miR-188-5p，hsa-miR-23b*、hsa-miR-663)是與兩藥單用重疊的，4個(hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-135a*、hsa-miR-572、hsa-miR-630)是與黃連素單用重疊的，而25個是合用新產(chǎn)生的。3種不同處理條件下的差異miRNA列表見Appendix Tab 1。合用特異的差異miRNA如Tab 1所示。

有意思的是，合用后影響的特異miRNA中，有近70%的miRNA的表達(dá)量在藥物處理后發(fā)生了明顯的下調(diào)。幾個典型的miRNA中，hsa-miR-1225-5p經(jīng)研究證明在胃癌樣本中差異表達(dá)，并且可以作為胃癌術(shù)后的腹膜復(fù)發(fā)的重要生物標(biāo)記[13]。hsa-miR-125a-3P可以通過激活p53通路中p53的表達(dá)來誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡[14]。這些間接地說明合用后產(chǎn)生的特異的差異miRNA與癌癥的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系。

由Fig 3可以看出，黃連素單用與兩藥合用，不論在miRNA水平上，還是靶基因水平上，重疊度都比較高。這說明黃連素可能在兩藥聯(lián)合作用時起到了主要的作用，干擾作用更大更廣泛。兩藥合用后，特異性的miRNA占78%，特異性的靶基因占43.9%，這些特異性的差異miRNA和靶基因可能與兩藥產(chǎn)生協(xié)同作用有著密不可分的關(guān)系。

Tab 1 The special DEmiRNAs induced by drug combination

Appendix Tab 1 List of DEmiRNAs

The “b” in parentheses stands for DEmiRNA under berberine; the “e” stands for DEmiRNAs under evodiamine; the “c” stands for DEmiRNAs under combination.

Fig 3 The venn plot of DEmiRNAs and target genes under different treatment

為研究兩藥合用后影響的生物學(xué)過程和生物學(xué)通路，我們對差異miRNA的靶基因分別進(jìn)行GO生物學(xué)過程和KEGG通路富集分析。由Fig 4A看出，與兩藥單用相比，合用后特異性地調(diào)控了代謝、 微管的發(fā)育和形態(tài)發(fā)生、感覺器官的形成、泌尿和腎臟的發(fā)育等生物學(xué)過程。研究表明，癌癥的發(fā)生與某些基礎(chǔ)代謝相關(guān)，mTORC能夠調(diào)控肝癌細(xì)胞中FGF19的代謝，因此可以作為靶向治療肝癌的靶蛋白[15]。兩藥單用和合用都能夠?qū)α姿峄?、神?jīng)的分化與發(fā)育等生物學(xué)過程產(chǎn)生調(diào)控。有研究表明，AKT的抑制劑AZD5363能夠通過抑制AKT信號通路下游分子的磷酸化，來抑制肝癌中Hep-G2和Huh-7細(xì)胞的磷酸化，從而達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞增殖的目的[16]。有研究表明，神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)抗原的過表達(dá)，預(yù)示著肝細(xì)胞癌預(yù)后效果不好，間接說明了肝癌與神經(jīng)的活動有關(guān)[17]。

Appendix Tab 2 The gene preference and gene contributions in pathways

The first column stands for the enriched pathways; the second column stands for the gene preference; the last 4 columns stand for the gene contributions to the pathways.

由Fig 4B看出，在富集的KEGG通路上，合用后明顯影響的通路主要包括胰島素信號通路，軸突信號通路等。特異性影響的通路主要包括Ⅱ型糖尿病，黏著斑，內(nèi)吞等通路。有研究表明，臨床上發(fā)現(xiàn)有很多腫瘤都存在通過神經(jīng)進(jìn)行局部擴(kuò)散的現(xiàn)象，并且目前大量的動物實驗表明，癌細(xì)胞天生就有通過軸突在某種機(jī)制下激活遷移的能力[18]。并有研究表明，靶向篩查和治療丙型肝炎，治療糖尿病并預(yù)防初級肥胖，是降低未來肝癌發(fā)病率的關(guān)鍵[19]，間接說明糖尿病與肝癌有一定的聯(lián)系。有趣的是，合用明顯影響的通路也是黃連素單用也可以影響的，說明合用影響的這些通路來自于黃連素的作用。單用和合用共同影響的通路主要包括與癌癥發(fā)展相關(guān)的MAPK信號通路、神經(jīng)信號通路等。

通過對合用影響的通路基因偏好性及基因貢獻(xiàn)率的分析(Appendix Tab 2)，發(fā)現(xiàn)合用明顯影響的通路中，軸突導(dǎo)向通路，MAPK信號通路，前列腺癌通路，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路，結(jié)腸直腸癌通路等對于基因具有偏好性，并且在這些具有靶基因偏好性的通路中，合用與黃連素共同的靶基因、單用及合用共同的靶基因，對于通路的貢獻(xiàn)率大，說明黃連素可能在兩藥協(xié)同作用中起著主要的作用。

2.4 KEGG 通路網(wǎng)絡(luò)的分析

2.4.1 KEGG 通路的選取及基因整合 為從網(wǎng)絡(luò)水平上分析兩藥協(xié)同作用的機(jī)制，從合用后影響的通路中，挑選出顯著性強(qiáng)的5條通路。 并根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中基因的整合信息，對靶基因進(jìn)行整合，得到整合后的靶基因映射的通路網(wǎng)絡(luò)。

2.4.2 KEGG通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在cytoscape軟件中，分別將黃連素、吳茱萸堿單用對應(yīng)的靶基因映射到合用后富集的5個通路網(wǎng)絡(luò)中。重點分析網(wǎng)絡(luò)中兩類關(guān)鍵的靶基因：第一類靶基因是兩藥合用影響的特異靶基因，另一類靶基因是兩藥單用和合用共同影響的靶基因。調(diào)控兩類靶基因的miRNA以及FC值，如Tab 2。

由Tab 2可以看出，兩藥合用后，調(diào)控特異靶基因的miRNA，F(xiàn)C值都小于0.5，表明miRNA被下調(diào)。由于miRNA表達(dá)的變化與基因表達(dá)的變化往往是相反的，因此對應(yīng)的靶基因很可能被上調(diào)。而對于單用和合用共同影響的靶基因來說，黃連素主要使得這些靶基因表達(dá)下調(diào)。在miRNA水平上，有研究表明，hsa-miR-1207-5p和hsa-miR-188-5p在乳腺癌等癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可以通過此特征來判斷是否患有乳腺癌[20]，而黃連素能夠起到下調(diào)hsa-miR-1207-5p和hsa-miR-188-5p的作用，吳茱萸堿主要起到上調(diào)這些miRNA表達(dá)的作用。在靶基因水平上，有研究表明，在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中，AQP9的過表達(dá)，降低了PI3K的表達(dá)，從而抑制了肝細(xì)胞瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和體內(nèi)異種移植腫瘤的生長[21]。吳茱萸堿主要影響這些靶基因低表達(dá)，而兩藥合用影響的miRNA主要誘導(dǎo)這些靶基因高表達(dá)，說明黃連素在兩藥合用時可能起到主要作用，而吳茱萸堿可能起到平衡黃連素的輔助作用。

Tab 2 The FC values of DEmiRNAS

兩藥合用后差異miRNA的靶基因富集的KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖，如Fig 5。從Fig 5聯(lián)合用藥差異miRNA的靶基因富集的通路可以得到，在癌細(xì)胞膜上，兩藥合用主要影響到4類膜受體，包括酪氨酸激酶受體：RTK；腦信號蛋白受體：PLEXINA、PLEXINB，主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、軸突引導(dǎo)、浸潤性生長和細(xì)胞轉(zhuǎn)移等；橫跨模信號受體：SEMA4D，在細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，指導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突的生長；Wnt信號蛋白受體：FRIZZLED，具有G蛋白偶聯(lián)受體和橫跨膜信號受體的活性，與癌癥通路相關(guān)。在癌細(xì)胞內(nèi)部，兩藥合用主要明顯影響到5條與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路，分別為Calcium signaling 通路、mTOR signaling通路、PI3K-AKT signaling通路、MAPK signaling通路、Wnt signaling通路。這些信號通路的擾動主要影響細(xì)胞的生長，擴(kuò)增和分化等，進(jìn)而引發(fā)癌癥。

合用影響的靶基因還參與7個與癌癥發(fā)生相關(guān)的生物學(xué)過程，分別為受體泛素化的降解、細(xì)胞周期的進(jìn)程，肌動蛋白骨架的調(diào)控等。有文獻(xiàn)證實，黃連素能夠影響細(xì)胞周期，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長進(jìn)程[22]。并且黃連素有使受體泛素化并降解的作用，在與其他藥物產(chǎn)生協(xié)同抗癌作用時發(fā)揮重要作用[23]。有趣的是，兩藥合用時影響一種特殊的生物學(xué)過程：調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架(regulation of actin cytoskeleton)，有文獻(xiàn)證實肌動蛋白的異?；顒涌梢砸l(fā)癌癥[24]。合用影響的特異靶基因既分布于上游的細(xì)胞膜上，又參與到下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且調(diào)控這些靶基因的miRNA都明顯低表達(dá)。這與先前已知的很多抗癌藥物都是根據(jù)膜受體設(shè)計的報道，具有一致性[25]。

黃連素和吳茱萸堿作用的蛋白靶點具有一定的重合?？傮w來說，黃連素作用的蛋白靶點比吳茱萸堿作用的靶點多，由Fig 5看出，在合用明顯影響的5條通路中，有3條通路的下游是由黃連素影響的特異靶基因靶向的。在MAPK signaling 通路，Wnt signaling 通路中，上下游都是由聯(lián)合用藥來調(diào)控的，有可能改變了細(xì)胞骨架，調(diào)控了基因的轉(zhuǎn)錄水平，抑制了細(xì)胞的擴(kuò)增，促進(jìn)了細(xì)胞的分化。 黃連素和吳茱萸堿合用后，細(xì)胞膜上的4類膜受體，除了橫跨膜信號受體SEMA4D沒有靶向之外，其他3類膜受體都被靶向了，這說明協(xié)同作用的藥物組合傾向于靶向更多種類的膜受體，可能會起到增強(qiáng)對信號通路下游的抑制，從而進(jìn)一步放大藥物協(xié)同作用的目的。

Fig 4 Enriched GO_BPs and KEGG pathways

In fig 4-1, the x axis stands for the enriched GO_BPs, the y axis stands for the-log(P); In fig 4-2, the x axis stands for the treatments, the y axis stands for the enriched KEGG pathways. The points stand for the numbers of the target genes. The larger is the point, the more target genes in the enriched pathways. The color stands for the-log(pvalue). The deeper of the color is, the more significant of the enrichments.A:Protein amio acid phosphorylation;B:Neuron differentiation;C:regulation of transcription;D:Ras protein signal transduction;E:regulation of kinase activity;F:vesicle-mediated transport;G:positive regulation of apoptosis…;H:response to organic substance;I:tube development and…;J:sensory organ development;K:urogenital system and kidney…;L:metabolic process.1:hsa05223:Non-small cell lung cancer;2:hsa05221:Acute myeloid leukemia;3:hsa05220:Chronic myeloid leukemia;4:hsa05215:Prostate cancer;5:hsa05214:Glioma;6:hsa05213:Endometrial cancer;7:hsa05212:Pancreatic cancer;8:hsa05210:Colorectal cancer;9:hsa05200:Pathways in cancer;10:hsa04930:TypeⅡ diabetes mellitus;11:hsa04916:Melanogenesis;12:hsa04910:Insulin signaling pathway;13:hsa04722:Neurotrophin signaling pathway;14:hsa04666:Fc gamma R-mediated phagocytosis;15:hsa04510:Focal adhesion;16:hsa04360:Axon guidance;17:hsa04310:Wnt signaling pathway;18:hsa04144:Endocytosis;19:hsa04012:ErbB signaling pathway;20:hsa04010:MAPK signaling pathway

Fig 5 The KEGG pathway network influenced by DEmiRNA of drug combinations

The color: red stands for the special target genes of drug combination; blue stands for non-target genes. The shape: diamond stands for the common targets under different treatments; hexagon stands for the common targets under two single drugs; rectangle stands for the common targets under berberine and combination; the circle stands for the special targets under combination; the triangl stands for the special targets under berberine.

由用藥后，miRNA的調(diào)控水平來看，黃連素作用后，miRNA的表達(dá)都是下調(diào)，吳茱萸堿作用后，miRNA的表達(dá)主要是上調(diào)，但是兩藥合用后miRNA的表達(dá)都是下調(diào)，并不等于兩藥聯(lián)合作用后miRNA的表達(dá)之和，有的甚至還會低于黃連素作用后miRNA的下調(diào)水平，原因可能是兩藥合用產(chǎn)生的協(xié)同效果，使得作用效果變強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文從黃連素和吳茱萸堿單用及合用后影響的miRNA及對應(yīng)的靶基因，結(jié)合生物學(xué)過程和KEGG通路，整合出藥物影響的KEGG通路網(wǎng)絡(luò)，從生物信息學(xué)角度系統(tǒng)地解析黃連素和吳茱萸堿協(xié)同作用的生物學(xué)機(jī)制。本文發(fā)現(xiàn)，黃連素和吳茱萸堿合用影響的特異靶基因既涵蓋了通路上游細(xì)胞膜上的3類膜受體，又參與到下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。通路上游全部由兩藥合用影響的特異靶基因靶向，并且合用使得調(diào)控這些靶基因的miRNA的表達(dá)都明顯下調(diào)。單用和合用共同的靶基因中，黃連素和吳茱萸堿單用分別主要使得調(diào)控這些靶基因的miRNA的表達(dá)下調(diào)和上調(diào)，而合用使得調(diào)控這些靶基因的miRNA的表達(dá)下調(diào)，說明黃連素在兩藥合用中起到的干擾作用更大或更廣泛，可能起到了主要作用。先前關(guān)于藥物協(xié)同機(jī)制的研究大都基于基因及蛋白水平。黃連素和吳茱萸堿在miRNA水平上協(xié)同機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，提示我們在今后挖掘藥物協(xié)同機(jī)制時，不僅要從基因和蛋白水平，更要結(jié)合miRNA的調(diào)控水平等多維角度聯(lián)合分析，為今后協(xié)同藥物組合的發(fā)現(xiàn)提供了新的思路。

(致謝:本研究論文在同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院曹志偉教授課題組完成。感謝課題組老師和同學(xué)的盡心協(xié)助。)

[1] Mullard A. 2015 FDA drug approvals[J].NatRevDrugDiscov,2016,15(2): 73-6.

[2] 彭 軍.抗腫瘤藥物聯(lián)合化療新進(jìn)展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2003,23(12): 754-6.

[2] Peng J. The new development of combination of anti-tumor drug and chemotherapy[J].ChinJHospitPharm,2003,23(12): 754-6.

[3] Al-Lazikani B, Banerji U, Workman P. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era[J].NatBiotechnol, 2012,30(7): 679-92.

[4] 王佳藝,何俊勁,郝靜超,等.多肽AP25 與多西他賽聯(lián)合用藥對人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制活性研究[J].中國藥理學(xué)通報,2015,31(9): 1233-8.

[4] Wang J Y, He J J, Hao J C, et al.Combination of polypeptide AP25 and docetaxel in the treatment of breast cancer[J].ChinPharmacolBull,2015,31(9):1233-8.

[5] 陳 虹,張閃閃,董錦蕾,等.紫檀茋和乙酰紫草素抑制B16F10細(xì)胞增殖的協(xié)同作用[J].中國藥理學(xué)通報,2016,32(6): 818-24.

[5] Chen H, Zhang S S, Dong J L, et al. The synergistic antiproliferative effect of pterostilbene and acetylshikonin on B16F10 cells[J].ChinPharmacolBull, 2016, 32(6): 818-24.

[6] Jia J, Zhu F, Ma X, et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives[J].NatRevDrugDiscov,2009,8(2):111-28.

[7] Garofalo M, Condorelli G,Croce C M. MicroRNAs in diseases and drug response[J].CurrOpinPharmacol,2008,8(5): 661-7.

[8] Cuperus J T, Fahlgren N, Carrington J C. Evolution and functional diversification of MIRNA genes[J].PlantCell,2011,23(2): 431-42.

[9] Chen L, Lu M H, Zhang D, et al. miR-1207-5p and miR-1266 suppress gastric cancer growth and invasion by targeting telomerase reverse transcriptase[J].CellDeathDis,2014,5(1):e1034.

[10]Tang J, Feng Y, Tsao S, et al. Berberine and Coptidis rhizoma as novel antineoplastic agents: a review of traditional use and biomedical investigations[J].JEthnopharmacol,2009,126(1): 5-17.

[11]Shi H L, Wu X J, Liu Y, et al. Berberine counteracts enhanced IL-8 expression of AGS cells induced by evodiamine[J].LifeSci, 2013, 93(22): 830-9.

[12]Chou T C, Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J].PharmacolRev, 2006, 58(3):621-81.

[13]Tokuhisa M, Ichikawa Y, Kosaka N, et al. Exosomal miRNAs from peritoneum lavage fluid as potential prognostic biomarkers of peritoneal metastasis in gastric cancer[J].PLoSOne,2015,10(7): e0130472.

[14]Jiang L, Chang J, Zhang Q, et al. MicroRNA hsa-miR-125a-3p activates p53 and induces apoptosis in lung cancer cells[J].CancerInvest,2013,31(8):538-44.

[15]Wan Z Y, Tian J S, Tan H W, et al. Mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) is an essential mediator of metabolic and mitogenic effects of FGF19 in hepatoma cells[J].Hepatology,2016,64(4):1289-1301.

[16]Zhang Y, Zheng Y, Faheem A, et al.A novel AKT inhibitor,AZD5363,inhibits phosphorylation of AKT downstream molecules, and activates phosphorylation of mTOR and SMG-1 dependent on the liver cancer cell type[J].OncolLett,2016,11(3): 1685-92.

[17]Lu L L, Sun J, Lai J J, et al. Neuron-glial antigen 2 overexpression in hepatocellular carcinoma predicts poor prognosis[J].WorldJGastroenterol,2015,21(21): 6649-59.

[18]Amit M, Na′ara S,Gil Z. Mechanisms of cancer dissemination along nerves[J].NatRevCancer,2016,16(6):399-408.

[19]Petrick J L, Braunlin M, Laversanne M, et al. International trends in liver cancer incidence, overall and by histologic subtype, 1978-2007[J].IntJCancer,2016,139(7):1534-45.

[20]Hamam R, Ali A M, Alsaleh K A, et al. microRNA expression profiling on individual breast cancer patients identifies novel panel of circulating microRNA for early detection[J].SciRep,2016,6: 25997.

[21]Zhang W G, Li C F, Liu M, et al. Aquaporin 9 is down-regulated in hepatocellular carcinoma and its over-expression suppresses hepatoma cell invasion through inhibiting epithelial-to-mesenchymal transition[J].CancerLett,2016,378(2): 111-9.

[22]Zhao H, Halicka H D, Li J, et al. Berberine suppresses gero-conversion from cell cycle arrest to senescence[J].Aging(AlbanyNY), 2013,5(8): 623-36.

[23]Kleihues P. Erwin G. Van Meir (ed): CNS cancer:models, markers, prognostic factors, targets, and therapeutic approaches. J Neurooncol, 2010,98(3):435-6.

[24]Youm I, Bazzil J D, Otto J W, et al. Influence of surface chemistry on cytotoxicity and cellular uptake of nanocapsules in breast cancer and phagocytic cells[J].AAPSJ,2014,16(3): 550-67.

[25]Dahan A, Beig A, Lindley D, et al. The solubility-permeability interplay and oral drug formulation design: Two heads are better than one[J].AdvDrugDelivRev,2016,101(6):99-107.

Study of synergistic mechanism in the combination of berberine and evodiamine from the perspective of miRNA

YIN Zuo-jing,CAO Zhi-wei,YAN Xin-miao,YANG Yi-yan,SHENG Zhen

(SchoolofLifeScienceandTechnology,TongjiUniversity,Shanghai200092,China)

Aim To explore the mechanisms of action (MOA) of synergistic anticancer function in the combination of berberine and evodiamine. Methods We first analyzed the action of suppression in the drug combination from the cell level and validated the dose scope as well as ratio of concentration in synergistic effects of drug combination. Then, the miRNA chip of liver cancer cell BEL-7402 under different treatment was analyzed. By building the miRNA-mRNA network, the MOA of the synergistic drug combination was illustrated. Results Berberine and evodiamine used in combination could significantly synergistically suppress the proliferative ability of liver cancer cells. The special differentially expressed miRNAs (DEmiRNAs) mainly participated in some cancer proliferation-related pathways and biological processes, such as MAPK signaling pathway, endocytosis pathway and insulin signaling pathway. The special target genes influenced by the drug combination not only covered three kinds of membrane receptors, but also took part in the regulation of downstream pathways. Conclusions From the regulation of miRNAs, it is clear that berberine may play a primary role in the synergistical suppression activity of the drug combination in cancer cells. The discovery of synergistic MOA in the combination of berberine and evodiamine from the miRNA level will provide a new guidance to explore more synergistic drug combinations in the future.

berberine; evodiamine; drug combination; synergistic drug combination; mechanisms of action; KEGG pathway; pathway network

時間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.016.html

2017-01-19,

2017-02-27

國家高等科技研究與發(fā)展基金(863項目)資助項目(No 2012AA020405)；衛(wèi)生部資助基金項目(No 2012ZX10005001)

尹作靜(1990-)，女，碩士生，研究方向：生物信息學(xué)，E-mail：bioyin@126.com; 盛 振(1988-)，男，博士，研究方向：生物信息學(xué)，通訊作者，E-mail：shengzhen@live.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.008

A

1001-1978(2017)06-0772-09

R284.1；R329.24；R342.2；R735.705.31；R979.1