朱 磊，沈維干，許正新

(揚州大學醫(yī)學院，江蘇 揚州 225001)

楊梅素對肝癌SMMC-7721細胞遷移及侵襲影響的研究

朱 磊，沈維干，許正新

(揚州大學醫(yī)學院，江蘇 揚州 225001)

目的 探討楊梅素對肝癌SMMC-7721細胞遷移和侵襲的影響。方法 以不同濃度楊梅素處理的肝癌SMMC-7721細胞為研究對象，分別采用Wound healing實驗、Transwell細胞遷移和侵襲實驗檢測細胞的遷移和侵襲過程，用RT-qPCR和Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin的表達。結(jié)果 楊梅素呈濃度依賴性(10～40 μmol·L-1)抑制肝癌SMMC-7721細胞活力；楊梅素還可以抑制SMMC-7721細胞遷移和侵襲過程，并且隨著楊梅素濃度的增加，細胞中絲狀、片狀偽足逐漸減少，細胞排列越來越緊密；RT-qPCR和Western blot結(jié)果均顯示，楊梅素可以上調(diào)SMMC-7721細胞的E-cadherin表達，下調(diào)N-cadherin表達。結(jié)論 楊梅素能抑制肝癌SMMC-7721細胞的遷移和侵襲過程，此作用的發(fā)生可能是通過上調(diào)E-cadherin、下調(diào)N-cadherin等EMT相關的信號通路以及肌動蛋白細胞骨架的重排實現(xiàn)的。

上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化；楊梅素；SMMC-7721細胞；細胞遷移；細胞侵襲；細胞骨架

肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在我國惡性腫瘤中死亡率位列第2位[1]。近年來隨著診療水平的改善，肝癌患者的生存率雖有較大提高，但是術后肝癌細胞的轉(zhuǎn)移已成為影響肝癌預后的重要因素[2]。而肝癌轉(zhuǎn)移是多基因參與的、復雜的過程，它涉及大量基因異常表達以及相關信號通路的異常[3]。其中， 上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)被認為是腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要過程；在EMT過程中，腫瘤細胞會喪失本身的上皮樣特性而具有某些間質(zhì)細胞的特性，從而促使細胞的遷移和侵襲[4]，而抑制EMT過程則可抑制癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移[5]。

楊梅素(myricetin)是一種天然存在的黃酮醇類化合物，廣泛存在于雙子葉植物中，化學名為3，3′，4′，5，5′，7-六羥基黃酮(Fig 1)，又名楊梅樹皮素[6]，文獻報道，該化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛[7]、降血糖[8]和保肝[9]等藥理作用。此外，Labbé、鄭作文等還發(fā)現(xiàn)，楊梅素也具有抗腫瘤活性[10-11]，然而，此方面的報道目前還不是很多，相關的研究還不夠深入，這就給我們對本領域的深入研究提供了空間。

Fig 1 Chemical structural formula of myricetin

李蓉等[12]研究結(jié)果表明，漆樹黃酮可以通過逆轉(zhuǎn)肝癌HepG2細胞的EMT來抑制細胞的遷移和侵襲能力。龐慧芳等[13]也發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以通過抑制胰腺癌PANC-1細胞的EMT過程來影響細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。上述結(jié)果表明，某些藥物可以通過調(diào)控EMT過程等環(huán)節(jié)來影響細胞的運動能力，那么楊梅素的抗腫瘤作用是否也有EMT等因素的參與呢？基于此考慮，本研究將以人肝癌SMMC-7721細胞為研究對象，觀察楊梅素對細胞遷移和侵襲的影響并進一步探索楊梅素可能的作用機制，為今后楊梅素在疾病的預防治療上的進一步開發(fā)利用提供實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗試劑 人肝癌SMMC-7721細胞株(本實驗室保存)用含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)。楊梅素購于成都普思生物公司，純度為98%，以DMSO配成500 g·L-1的貯存液/母液(-20 ℃冰箱中保存)，臨用前以DMEM培養(yǎng)基配成各種不同濃度的工作液；DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；胎牛血清購于上海洛神生物技術公司；RIPA細胞裂解液、胰蛋白酶、四氮唑藍(MTT)和SDS-PAGE凝膠配置試劑盒均購于碧云天生物技術公司；小鼠抗人GAPDH 單抗、兔抗人E-cadherin單抗和兔抗人N-cadherin單抗以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠的二抗均購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞活力檢測(MTT實驗) 取SMMC-7721細胞制成單細胞懸液，計數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板中(1×104個細胞/孔)；置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；向96孔板中加入不同濃度的楊梅素，共分為7組(分別為0、10、20、30、40、50、60 μmol·L-1)，每組6復孔，培養(yǎng)48 h后；取出96孔板，每孔中加入5×10-3mg·L-1的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清，向每孔中加入DMSO 150 μL，在搖床上以100 r·min-1避光孵育15 min后，用酶標儀測定490 nm處的OD值并繪制細胞活力曲線圖。實驗重復3次。

1.3 細胞形態(tài)觀察 取SMMC-7721細胞，將密度為3×104個/孔的細胞接種于24孔板中，待細胞貼壁后分別加入含楊梅素的完全培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)。

1.4 細胞劃痕實驗 取SMMC-7721細胞接種于6孔板中(1×106個細胞/孔)，待細胞匯合度約為0.70時，換無血清DMEM培養(yǎng)過夜，次日用槍頭劃出“傷痕”線，并在光學顯微鏡下觀察、拍攝細胞開始時劃痕狀態(tài)(即0 h)；隨后向6孔板中分別加入含0、10、20、40 μmol·L-1楊梅素的無血清DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后分別在倒置相差顯微鏡下拍照。每個實驗組取5個視野，實驗重復3次。

1.5 Transwell細胞遷移和細胞侵襲實驗 細胞遷移實驗是將SMMC-7721細胞用無血清DMEM培養(yǎng)過夜后制備單細胞懸液；取Transwell小室置于24孔板中，先在Transwell下室中分別加入600 μL含0、10、20、40 μmol·L-1楊梅素的完全培養(yǎng)基；隨后向Transwell 上室中分別加入200 μL含0、10、20、40 μmol·L-1楊梅素的無血清細胞懸液(細胞終濃度為2.5×108·L-1)；置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出Transwell小室，用PBS漂洗后將小室浸泡在吉姆薩染液中染色，PBS沖洗后用棉簽輕柔擦去上室內(nèi)未遷移的細胞，在倒置相差顯微鏡下，觀察膜底細胞數(shù)目、拍照、統(tǒng)計。每孔隨機計數(shù)6個視野(100×)。每個實驗組設2個復孔，實驗重復3次。

細胞侵襲實驗的實驗操作與Transwell細胞遷移實驗基本相同，僅稍做修改：① 將Matrigel膠放入冰箱中隔夜使其解凍，在膜上表面鋪上100 μL Matrigel(用DMEM稀釋成1 mg·L-1)，置于培養(yǎng)箱中孵育8 h，使Transwell小室中形成一個基質(zhì)屏障膜；② 將含有Transwell小室的孔板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每個實驗組設2個復孔，實驗重復3次。

1.6 免疫熒光實驗 將SMMC-7721細胞接種于鋪有蓋玻片的6孔板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞貼壁后分別在孔中加入含0、10、20、40 μmol·L-1楊梅素的完全培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后(確保細胞匯合度約為0.70)，取出蓋玻片，PBST漂洗后，用固定液室溫固定細胞30 min，漂洗后加入體積分數(shù)為0.002 Triton X-100的PBS透化10 min，再漂洗；用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽室溫避光孵育1h，漂洗后再用5 mg·L-1DAPI避光孵育15 min，充分漂洗后加抗熒光淬滅劑封片；于熒光顯微鏡下觀察，隨機拍照。

1.7 RT-qPCR實驗 取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞種于6孔板中，待密度為0.70左右時加入相應濃度(0、10、20、40 μmol·L-1)的楊梅素作用48 h。用Trizol提取細胞總RNA;取2 μL RNA樣品用于濃度和純度的測定；對總RNA樣品按照TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒的說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。對合成的cDNA樣品按照南京Vazyme公司的AceQTMqPCR SYBR Green Master Mix試劑盒的說明書進行Real time-PCR反應，每種濃度的cDNA樣品設3個復孔，實驗重復3次。實驗所用引物見Tab 1。qPCR反應的條件是95 ℃，5 min預變性，95 ℃，10 s和60 ℃，34 s共40個循環(huán)。實驗結(jié)果可采用2-△△Ct來分析。

Tab 1 Primers used for real-time PCR

1.8 Western blot實驗 將細胞種于6孔板中，待生長至50%左右密度分別加入0、10、20和40 μmol·L-1的楊梅素作用48 h；收集細胞，加入RIPA buffer裂解細胞，裂解后收集上清，加入上樣緩沖液，在沸水中煮5～10 min可制得蛋白樣品備用；取細胞裂解后收集的上清進行BCA蛋白定量，確定蛋白樣品的濃度；根據(jù)定量結(jié)果將蛋白樣品置于SDS-PAGE上進行電泳分離，并在PVDF膜上進行轉(zhuǎn)膜反應；用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的封閉用奶粉進行封閉；加入稀釋的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH等單克隆抗體于4 ℃下孵育過夜；加入相應HRP標記的二抗；在凝膠成像系統(tǒng)中進行化學發(fā)光。實驗結(jié)果以GAPDH作為內(nèi)參，利用軟件Image J對蛋白條帶進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 楊梅素對肝癌細胞活力的影響 為了證明楊梅素對SMMC-7721細胞活力是否具有影響，本研究采用MTT法檢測不同濃度的楊梅素處理前后的細胞的活力，結(jié)果見Fig 2。由圖可見，與對照組(0 μmol·L-1)相比，細胞活力在楊梅素濃度為0和40 μmol·L-1之間均沒有明顯改變，提示楊梅素濃度在這個范圍內(nèi)對細胞的影響較??；而當濃度增加至50～60 μmol·L-1時，細胞活力則明顯下降，說明此濃度范圍的楊梅素對細胞具有明顯的毒性作用。因此本項研究選擇濃度為10、20、40 μmol·L-1的楊梅素作下一步的繼續(xù)探討。

Fig 2 Effect of myricetin on viability of SMMC-7721 cells

*P<0.05vscontrol

2.2 楊梅素對SMMC-7721細胞形態(tài)的影響 為了說明楊梅素對SMMC-7721細胞的形態(tài)是否具有影響，本實驗系統(tǒng)觀察了不同濃度的楊梅素處理前、后(48 h)的細胞的形態(tài)變化，結(jié)果見Fig 3。結(jié)果顯示：與對照組(0 μmol·L-1)比較，SMMC-7721細胞經(jīng)40 μmol·L-1的楊梅素作用48h后，其細胞形態(tài)由長梭形間質(zhì)樣細胞轉(zhuǎn)變?yōu)轾Z卵石狀上皮樣細胞；提示楊梅素可能促進SMMC-7721細胞的形態(tài)發(fā)生EMT(上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化)向MET(間質(zhì)上皮樣轉(zhuǎn)化) 的轉(zhuǎn)換。

Fig 3 Effect of myricetin on cell morphous of SMMC-7721 cells

2.3 楊梅素對SMMC-7721遷移能力的影響 為了研究楊梅素能否影響SMMC-7721細胞的遷移亦或其影響程度，本實驗分別采用細胞劃痕實驗和Transwell細胞遷移實驗對此進行研究。在細胞劃痕實驗中，先對用不同濃度楊梅素處理的SMMC-7721細胞“傷口”愈合情況進行評價。如Fig 4A所示，與對照組細胞相比，無論是24 h還是48 h，隨著藥物濃度的增加，“傷口”的面積越大，傷口愈合的速度越慢；并且在48 h時，楊梅素對SMMC-7721細胞的傷口愈合速度仍然有抑制作用。結(jié)果提示楊梅素能明顯抑制SMMC-7721細胞“二維”平面的遷移，且這種抑制作用具有時間和濃度依賴性。

Transwell 細胞遷移實驗結(jié)果見Fig 4B和4C。由圖可知，與對照組相比，隨著楊梅素濃度的增加，SMMC-7721細胞的遷移數(shù)量逐漸減少。提示楊梅素能濃度依賴性地抑制SMMC-7721細胞“三維”平面的遷移。因此，細胞劃痕實驗和Transwell細胞遷移實驗結(jié)果均證明楊梅素確實對SMMC-7721細胞的遷移有明顯抑制作用。

2.4 楊梅素對SMMC-7721細胞侵襲的影響 為了探討楊梅素是否能對SMMC-7721細胞侵襲能力產(chǎn)生影響，本實驗分別給予細胞進行0、10、20、40 μmol·L-1各不同濃度的楊梅素處理，采用Transwell細胞侵襲實驗對細胞侵襲能力進行檢測，結(jié)果見Fig 4B和4D。由圖可見，與對照組相比，當楊梅素的濃度為20和40 μmol·L-1時可以明顯地抑制SMMC-7721細胞侵襲(P<0.05)。

2.5 楊梅素對SMMC-7721細胞肌動蛋白細胞骨架纖維重排的影響 肌動蛋白細胞骨架纖維在裝配動力學上的改變在細胞遷移和侵襲過程中發(fā)揮了重要作用。前述實驗已經(jīng)證明楊梅素能抑制SMMC-7721細胞的遷移和侵襲，那么，此作用是否有楊梅素影響了SMMC-7721細胞肌動蛋白細胞骨架纖維重塑因素的參與？為了回答這一問題，我們設計了這項實驗，結(jié)果如Fig 5所示。由圖可見，與對照組相比，隨著楊梅素濃度的增加，SMMC-7721細胞中張力纖維數(shù)目明顯減少，細胞邊緣的絲狀偽足和片狀偽足也有所減少；實驗結(jié)果提示，楊梅素對SMMC-7721細胞遷移和侵襲的影響可能是通過影響細胞中肌動蛋白細胞骨架纖維的重塑來實現(xiàn)的。

2.6 楊梅素對EMT相關標記基因表達的影響 為了進一步闡明楊梅素調(diào)控SMMC-7721細胞的遷移和侵襲的分子機制，本實驗分別采用RT-qPCR和Western blot檢測不同濃度的楊梅素處理后SMMC-7721細胞中的E-cadherin、N-cadherin等相關標記基因的表達情況。RT-qPCR實驗結(jié)果如Fig 6A所示，與對照組相比， E-cadherin相對表達量在楊梅素濃度為40 μmol·L-1時明顯上升(P<0.05)；而N-cadherin的相對表達量在楊梅素濃度為20和40 μmol·L-1時明顯下降(P<0.05)。Western blot實驗結(jié)果如Fig 6B和6C所示，與對照組相比，E-cadherin蛋白相對表達量隨著楊梅素濃度增加而明顯上調(diào)(P<0.05)；N-cadherin蛋白相對表達量隨著楊梅素濃度增加而明顯下調(diào)(P<0.05)。

以上結(jié)果證明，楊梅素可能通過上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin等相關標記基因的表達來抑制細胞的遷移和侵襲。

3 討論

EMT是上皮細胞受外源或內(nèi)源性因素刺激后，通過細胞骨架重塑轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞\動能力的間質(zhì)細胞從而獲得有較強的轉(zhuǎn)移能力以及侵襲、降解細胞外基質(zhì)能力等間質(zhì)表型的生物學過程[3]。細胞骨架纖維重塑過程需要肌動蛋白(F-actin)參與，F(xiàn)-actin通過改變細胞片狀偽足及絲狀偽足的形成，進而影響細胞遷移和侵襲過程[14]。本實驗采用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽染色SMMC-7721細胞中F-actin，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著楊梅素濃度的增加，SMMC-7721細胞中張力纖維數(shù)目逐漸減少，同時細胞邊緣的絲狀偽足及片狀偽足也有所減少，在形態(tài)學上表現(xiàn)為促進SMMC-7721細胞的形態(tài)發(fā)生EMT向MET的轉(zhuǎn)換。為了說明這種轉(zhuǎn)變與細胞遷移和侵襲能力的改變是否存在必然的聯(lián)系，本研究通過RT-qPCR以及Western blot檢測了E-cadherin和N-cadherin的表達情況，后兩者的實驗結(jié)果進一步證明了細胞的EMT過程受到抑制以致EMT向MET的轉(zhuǎn)換。由此證明，楊梅素具有抑制SMMC-7721細胞遷移及侵襲的作用。

有研究表明EMT與腫瘤細胞的浸潤過程密切相關[6]。在EMT發(fā)生過程中，上皮標志物E-cadherin(E-鈣粘蛋白)表達水平會下調(diào)，間質(zhì)標志物N-cadherin(N-鈣粘蛋白)表達水平會上調(diào)[4]，最終導致腫瘤細胞的遷移和侵襲等運動能力增強，使腫瘤細胞更易于發(fā)生原位浸潤或轉(zhuǎn)移至體內(nèi)的其他部位，在新的組織或器官中重新定位[7]。EMT除影響腫瘤進展的發(fā)生機制外，還與抗腫瘤藥物的敏感性以及病人預后等相關。Jenchlinger等[15]發(fā)現(xiàn)，在MAPK 介導下發(fā)生EMT時，可出現(xiàn)MDR2(多藥耐藥基因2)的高表達。故研究EMT的發(fā)生機制對發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療靶點至關重要。

目前陸續(xù)有一些報道顯示楊梅素具有抗腫瘤作用，該藥或者能夠影響肺癌及前列腺癌細胞的增殖[16-17]，或者通過抑制肝細胞惡化、降低肝癌發(fā)病率[10]。在此基礎上，本文對楊梅素抗腫瘤作用的分子機制進行了初步探討，研究結(jié)果對基礎和臨床上關于該藥的后續(xù)深入開發(fā)和進一步挖掘提供了理論依據(jù)。但是由于SMMC-7721細胞是遷移能力較低的細胞，因此，為了更好的探究楊梅素抑制肝細胞轉(zhuǎn)移亦或抗腫瘤作用，還需要其他的多種手段和措施的反復驗證。

Fig 4 Effect of myricetin on migration and invasion of SMMC-7721 cells

A:Cell wound healing assay detected effect of myricetin on cell migration of SMMC-7721 cells;B～D:Transwell cell migration assay and cell invasion assay detected effect of myricetin on migration and invasion of SMMC-7721 cells;*P<0.05vscontrol

Fig 5 Effect of myricetin on actin cytoskeleton rearrangement of SMMC-7721 cells

綜上所述，楊梅素可能是干擾細胞骨架的重塑進而促進細胞發(fā)生EMT向MET轉(zhuǎn)換來抑制細胞的遷移和侵襲。本實驗初步探討楊梅素對肝癌細胞遷移和侵襲的抑制作用，為楊梅素進一步開發(fā)利用提供實驗基礎和理論依據(jù)，但具體作用機制仍需進一步研究。

(致謝:感謝我的師姐鄭雪，師妹馬宏昕、任靜娜，師弟饒本龍對我的實驗提供很多的幫助與支持。)

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Effect of myricetin on migation and invasion of hepatoma SMMC-7721 cells

ZHU Lei, SHENG Wei-gan, XU Zheng-xin

(SchoolofMedicine,YangzhouUniversity,YangzhouJiangsu225001，China)

Aim To investigate the effects of myricetin on the migration and invasion of hepatoma SMMC-7721 cells.Methods SMMC-7721 cells were treated with different concentrations of myricetin. Migration and invasion of SMMC-7721 cells were examined by Wound healing and Transwell, and the expression of E-cadherin and N-cadherin was detected by RT-qPCR and Western blot.Results Myricetin may inhibit the viability of SMMC-7721 cells via different concentration(10～40 μmol·L-1); furthermore, myricetin might also inhibit the migration and invasion of hepatoma SMMC-7721 cells. Meanwhile with the increasing of myricetin concentration, both filopodia and lamellipodia formation was reducd, and 7721 cells displayed in more integrity. And data from RT-qPCR and Western blot demonstrated that myricetin may up-regulate the expression of E-cadherin, simultaneously, down-regulate N-cadherin in SMMC-7721 cells.Conclusion Myricetin may influence the cell migration and invasion through up-regulating the expression of E-cadherin, simultaneously, down-regulating N-cadherin and activate cytoskeleton remolding of SMMC-7721.

EMT; myricetin; SMMC-7721 cell; cell migration; cell invasion; cytoskeleton

時間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.032.html

2017-01-15,

2017-03-22

國家自然科學基金面上項目(No 31071171);遺傳工程國家重點實驗室開放課題(SKLGE-1405)

朱 磊(1985-)，男，碩士生，研究方向：藥理學，E-mail：395923269@qq.com； 許正新(1964-)，男，博士，教授，碩士生導師，通訊作者,E-mail：xuzhengxin405@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.016

A

1001-1978(2017)06-0823-07

R284.1；R329.24；R73-37；R735.702.2