汪 彬，黃丹梅，王遠航，周巧玲，林 泓，張艷美，石剛剛，鄭付春

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1. 藥理學(xué)教研室，2.第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 汕頭 515041)

碘化N-正丁基氟哌啶醇通過抑制線粒體凋亡通路抗H9c2心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷

汪 彬1，黃丹梅1，王遠航1，周巧玲1，林 泓1，張艷美1，石剛剛1，鄭付春2

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1. 藥理學(xué)教研室，2.第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 汕頭 515041)

目的 研究碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)對H9c2心肌細胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷中線粒體凋亡通路的影響，并探討其分子作用機制。方法 建立H9c2心肌細胞H/R損傷模型，將H9c2心肌細胞隨機分為5組：正常對照組(C組)、缺氧/復(fù)氧組(H/R組)、F2低、中、高劑量組。流式細胞術(shù)分析測定細胞凋亡率；采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測細胞色素C(Cyto C)、Bcl-2、和Bax蛋白表達變化；比色法測定caspase-3的活性。結(jié)果 與H/R組相比，F(xiàn)2低、中、高劑量組可明顯降低H9c2細胞缺氧/復(fù)氧損傷后細胞凋亡率；提高Bcl-2/Bax比值；抑制線粒體中Cyto C的釋放；減少caspase-3的活性。結(jié)論 F2能夠降低H/R后H9c2心肌細胞凋亡率，其機制可能與抑制線粒體通路的細胞凋亡有關(guān)。

碘化N-正丁基氟哌啶醇；缺氧/復(fù)氧；H9c2心肌細胞；凋亡；線粒體；細胞色素C在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官的損傷反而加重的現(xiàn)象稱為缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[1]。心肌I/R損傷是心臟缺血性疾病和心臟外科手術(shù)后常見的一種病理生理現(xiàn)象，減輕或消除這種損傷一直是該領(lǐng)域的一個研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡是心肌I/R損傷后心肌細胞死亡的主要形式，其中線粒體扮演著關(guān)鍵的角色[2]。在心肌I/R損傷過程中，缺血或缺氧等刺激可激活線粒體的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致線粒體釋放細胞色素C(cytochrome C, Cyto C)、endonuclease G以及凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)等分子，進而激活其下游的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific protease, 簡稱caspase)，最終導(dǎo)致心肌細胞凋亡[3]。鑒于線粒體在I/R所致的細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，因此，抑制線粒體凋亡通路已成為研究保護心肌I/R損傷的熱點。

碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide, F2)是我們課題組在氟哌啶醇的基礎(chǔ)上改造合成的一種新型鈣拮抗劑。前期研究證實，F(xiàn)2無論是對整體的心肌I/R損傷還是對離體心肌細胞或心臟微血管內(nèi)皮細胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)損傷均有一定的保護作用。它的保護機制可能與阻斷心肌細胞細胞膜上的鈣通道拮抗鈣超載和抑制早期生長反應(yīng)基因-1(early growth response gene-1, Egr-1)mRNA和蛋白過表達有關(guān)[4-6]。但是，F(xiàn)2是否可通過影響線粒體凋亡通路而產(chǎn)生保護作用尚不清楚。因此，本實驗通過建立H9c2心肌細胞H/R模型，觀察F2對線粒體凋亡通路的影響，并探討其保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株 H9c2心肌細胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 主要試劑及儀器 F2有汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物研究室合成，化學(xué)結(jié)構(gòu)有中國科學(xué)院上海有機所鑒定。胎牛血清(Gibco)；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(Dojindo)；線粒體蛋白抽提試劑盒(碧云天)；Bax一抗、Cyto C一抗(CST)；Bcl-2一抗(Santa Cruz)；β-actin一抗(北京中杉金橋)；VDAC一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(武漢博士德)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo SCIENTIFIC)，caspase-3活性檢測試劑盒(Sigma)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO)；倒置相差顯微鏡(Nikon)；流式細胞儀(BECKMAN COULTER)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices)；電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad)。

1.3 H9c2心肌細胞培養(yǎng) H9c2心肌細胞使用含10%胎牛血清，青-鏈霉素(各100 kU·L-1)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為37 ℃、飽和濕度、5% CO2)，2～3 d傳代1次。

1.4 H/R模型的建立及實驗分組 融合至90%～95%的H9c2心肌細胞隨機分為5組：正常對照組(Ctrl組)、缺氧/復(fù)氧組(H/R組)、F2低、中、高劑量組。H/R組換用被高純氮飽和30 min的缺氧液(pH 6.2:137 mmol·L-1NaCl, 12 mmol·L-1KCl, 0.49 mmol·L-1MgCl2,6H2O, 0.9 mmol·L-1CaCl2,4 mmol·L-1HEPES, and 20 mmol·L-1乳酸鈉)，置于缺氧盒中37℃密閉培養(yǎng)1h，然后換用復(fù)氧液(DMEM+10% FBS培養(yǎng)基)正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 h，建立H/R損傷模型；F2低、中、高劑量組分別在缺氧液和復(fù)氧液中分別加入F2(終濃度為0.1、1、10 μmol·L-1)。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 H9c2心肌細胞按不同的實驗要求處理后，消化、收集細胞，PBS洗滌3次，隨后加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞。加入10 μL Annexin V-TITC和5 μL室溫避光孵育15 min。立即加入400 μL結(jié)合緩沖液混合均勻，上機檢測細胞凋亡。其中每次檢測10 000個細胞。

1.6 線粒體及胞質(zhì)蛋白分離 按照試劑盒說明書，分離線粒體蛋白與胞質(zhì)蛋白。

1.7 Western blot檢測 H9c2心肌細胞根據(jù)實驗要求處理后，使用冰冷的PBS洗滌3次，加入含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min。離心后收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后-30℃冰箱保存。隨后使用SDS-PAGE方法分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，4℃孵育一抗過夜，TBST洗膜3次，每次10 min,室溫孵育二抗60 min，TBST洗膜3次，每次10 min。加入發(fā)光液后暗室壓片，顯影、定影。結(jié)果使用Gel-pro軟件分析。

1.8 Caspase-3活性檢測 Caspase-3活性檢測試劑盒購自Sigma公司，按照說明書上的要求操作。首先，使用胰酶消化細胞，離心。隨后再次使用冰冷的PBS洗滌兩次，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解細胞30 min，16 000×g離心15 min。BCA法測定蛋白濃度，取200 μg總蛋白加入反應(yīng)緩沖液及底物Ac-DEVD-pNA混合均勻后，37 ℃避光孵育1 h，隨后405 nm處測定光吸收值。

2 結(jié)果

2.1 F2對H/R所致細胞凋亡率的影響 如Fig 1所示，與正常對照組相比，H/R組凋亡細胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)。與H/R組相比，F(xiàn)2低、中、高劑量組可明顯減少凋亡細胞數(shù)量(P<0.05)。

Fig 1 Effect of F2 on H/R-induced apoptosis in H9c2 cells with the annexin V-FITC/PI staining by flow ±s,n=3)

C: control,H/R: hypoxia/reoxygenation,F2(H):F2high concentration group, F2(M):F2medium concentration group,F2(L):F2low concentration group.*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsH/R group.

2.2 F2對H/R后Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 如Fig2所示，與正常對照組相比，H/R組心肌細胞的Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)；而與H/R組相比，F(xiàn)2低、中、高劑量組Bcl-2蛋白表達增多，Bax蛋白表達降低，Bcl-2/Bax比值增加，且呈一定的劑量依賴性(P<0.05)。

Fig 2 Effects of F2 on expression of Bcl-2 and Bax by Western blot at different treatment ±s,n=3)

β-actin was probed as the loading control. C:control,H/R:hypoxia/reoxygenation, F2(H):F2high concentration group, F2(M):F2medium concentration group,F2(L):F2low concentration group.*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsH/R group.

2.3 F2對H/R所致線粒體細胞色素C釋放的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，H/R組線粒體中Cyto C蛋白表達降低、胞質(zhì)中Cyto C蛋白表達升高(P<0.05)。與H/R組相比，F(xiàn)2低、中、高劑量組線粒體中Cyto C蛋白表達升高、胞質(zhì)中Cyto C蛋白表達降低，并呈一定的劑量依賴性(P<0.05)，見Fig 3。

2.4 F2對H/R后caspase-3活性的影響 與正常對照組相比，H/R組caspase-3活性升高(P<0.05)；與H/R組相比，F(xiàn)2低、中、高劑量組caspase-3活性明顯降低且具有劑量依賴性(P<0.05)，見Fig 4。3 討論

I/R或H/R引起的細胞應(yīng)激能夠誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生大量的自由基，進而導(dǎo)致心肌細胞凋亡[7]。目前認為心肌細胞凋亡是心肌I/R損傷的主要形式，因此抑制心肌細胞凋亡是保護I/R誘導(dǎo)的心肌損傷的基本策略。前期的研究發(fā)現(xiàn)F2能夠通過抑制H/R誘導(dǎo)的原代心肌細胞凋亡減少H/R損傷[8]，但原代心肌細胞培養(yǎng)時需要飼養(yǎng)大量的大鼠進行繁殖生產(chǎn)乳鼠，而且分離純化方法復(fù)雜，耗時、耗力，且不能進行傳代培養(yǎng)，而H9c2心肌細胞比原代心肌細胞培養(yǎng)方法簡單、方便，且能夠進行傳代培養(yǎng)。因此，我們以H9c2心肌細胞作為研究對象研究F2對心肌細胞H/R過程中線粒體凋亡通路的影響。本實驗首先采用Annexin V-FITC/PI雙染的方法檢測細胞凋亡，流式結(jié)果顯示，H/R處理后H9c2心肌細胞早期和晚期凋亡率明顯升高，而使用F2后可明顯地抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡。

Fig 3 Western blot analysis of cytochrome C in cytosolic and membrane fractions of H9c2 cells

VDAC is a mitochondrial marker. β-actin was probed as the loading control. C:control,H/R: hypoxia/reoxygenation, F2(H):F2high concentration group, F2(M):F2medium concentration group, F2(L):F2low concentration group.*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsH/R group.

線粒體凋亡通路是H/R刺激誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的主要信號通路。在線粒體凋亡通路中，線粒體是調(diào)控心肌細胞凋亡的樞紐，其中，Cyto C是線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵分子，因為它可激活凋亡的執(zhí)行者caspase-3進而導(dǎo)致心肌細胞凋亡[9]。Bcl-2基因蛋白家族是一類與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)的蛋白家族，包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xl、mcl-1等)和促凋亡蛋白(如Bax、Bad、Bcl-xl、Bid、Bik等)。Bcl-2基因蛋白家族可通過直接或間接調(diào)節(jié)凋亡過程中的執(zhí)行者caspase調(diào)控細胞凋亡的發(fā)生[10]。在線粒體凋亡通路中，位于胞質(zhì)中的促凋亡蛋白Bax通過感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子，在線粒體表面形成通道，進而改變線粒體的通透性，從而使Cyto C從線粒體中釋放到胞質(zhì)中，激活凋亡執(zhí)行者caspase-3，最終引起細胞凋亡[11]。而抗凋亡蛋白Bcl-2則位于線粒體外膜上，通過抑制Cyto C的釋放最終抑制凋亡執(zhí)行者caspase-3激活，抑制細胞凋亡的發(fā)生。因此，H/R誘導(dǎo)心肌細胞凋亡與Bcl-2/Bax兩蛋白之間的比例密切相關(guān)，Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高并向線粒體外膜轉(zhuǎn)移，可引起線粒體途徑介導(dǎo)的細胞凋亡[12]。本實驗結(jié)果顯示，H/R處理后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax表達升高，Bcl-2/Bax比值升高，線粒體中Cyto C表達降低，胞質(zhì)中Cyto C表達升高，Cyto C從線粒體中釋放到胞質(zhì)中。提示我們線粒體凋亡通路參與心肌細胞H/R損傷，結(jié)果與文獻一致。而給予F2處理后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高，促凋亡蛋白Bax表達降低，Bcl-2/Bax比值降低，線粒體中Cyto C表達升高，胞質(zhì)中Cyto C表達降低，抑制Cyto C從線粒體中向胞質(zhì)中釋放。Cyto C從線粒體中釋放出來后，進一步激活下游的caspase-3。因為在心肌細胞凋亡過程中，caspase-3是關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者，其表達高低直接反映細胞的凋亡程度[13]。因此，可直接通過檢測caspase-3來反映心肌細胞的凋亡程度。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，H/R后凋亡執(zhí)行者caspase-3活性升高，說明H/R刺激可以活化caspase-3，最終引起心肌細胞凋亡。給予F2處理后，發(fā)現(xiàn)凋亡執(zhí)行者caspase-3活性降低，說明F2可抑制caspase-3的活化，抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

Fig 4 Caspase-3 activity in lysates of H9c2 cells

C:control,H/R: hypoxia/reoxygenation, F2(H):F2high concentration group,F2(M):F2medium concentration group,F2(L):F2low concentration group.*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsH/R group.

綜上所述，F(xiàn)2能夠減少心肌細胞H/R中細胞凋亡，其機制與抑制線粒體釋放Cyto C，從而抑制線粒體凋亡通路有關(guān)。

(致謝：本文實驗是在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室完成，感謝各位老師和同學(xué)在整個實驗設(shè)計及文章撰寫過程中的辛勤勞動。)

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N-n-butyl haloperidol iodide protects H9c2 cardiac myocytes against hypoxia/reoxygenation injury through mitochondria-dependent apoptotic pathway

WANG Bin1, HUANG Dan-mei1, WANG Yuan-hang1,ZHOU Qiao-ling1, LIN Hong1,ZHANG Yan-mei1, SHI Gang-gang1, ZHENG Fu-chun2

(1.DepartmentofPharmacology,ShantouUniversityMedicalCollege,ShantouGuangdong515041,China;2.DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospital,ShantouUniversityMedicalCollege,ShantouGuangdong515041,China)

Aim To investigate the effect ofN-n-butyl haloperidol iodide(F2) on mitochondria-dependent apoptotic pathway of H9c2 cardiac myocytes during hypoxia/reoxygenation(H/R) injury.Methods The H/R models of H9c2 cardiac myocytes were established. The H9c2 cardiac myocytes were randomly divided into five groups: control group(C group), hypoxia/reoxygenation group(H/R group), F2low concentration group(L), F2medium concentration group(M), F2high concentration group(H).Apoptotic rate was evaluated by flow cytometry(FCM). The levels of Cyto C, Bcl-2, Bax were observed by Western blot. Caspase-3 activity was measured with colorimetry.Results Compared with H/R group, F2low, medium and high concentrations group could significantly decrease apoptosis rate and increase the ratio of Bcl-2 to Bax proteins and inhibit the release of Cyto C into the cytosolic fraction, and decrease caspase-3 activity.Conclusion F2can protect H9c2 cardiac myocytes against H/R-induced injury through interfering in mitochondria-dependent pathway.

N-n-butyl haloperidol iodide; hypoxia/reoxygenation; H9c2 cardiac myocytes; apoptosis; mitochondria; cytochrome C

時間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.030.html

2017-02-15,

2017-03-12

國家自然科學(xué)基金-廣東省自然科學(xué)基金聯(lián)合資助基金項目(No U0932005)；廣東省科技廳公益研究與能力建設(shè)專項資金項目(No 2014A020212290); 國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81473215)

汪 彬(1986-)，男，博士，助教，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail: wangbin178.17@163.com; 鄭付春(1967-)，女，碩士，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥物研發(fā)，藥物臨床研究，通訊作者，E-mail:zhengfc@stu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.015

A

1001-1978(2017)06-0819-05

R322.11；R329.25；R845.22；R977.3；R977.6