劉暢，茍小軍，黃迪，趙超群，劉平，4，慕永平，曹健美，張華＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所肝腎病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海201203；2.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室上海201999；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院上海中醫(yī)藥大學(xué)腎病研究所上海201203；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院上海201203；5.上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院上海201203；6.山東省戒毒監(jiān)測治療所濟(jì)南250000）

基于代謝組學(xué)方法的濕熱證“異病同證”研究＊

劉暢1，6，茍小軍2，黃迪3，趙超群1，劉平1，4，慕永平1，曹健美5＊＊，張華1＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所肝腎病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海201203；2.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室上海201999；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院上海中醫(yī)藥大學(xué)腎病研究所上海201203；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院上海201203；5.上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院上海201203；6.山東省戒毒監(jiān)測治療所濟(jì)南250000）

目的：從代謝組學(xué)變化層面揭示“濕熱證”異病同證的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：以慢性乙型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及慢性腎小球腎炎的典型濕熱證患者各30例為研究對象，以健康者30例為對照，聯(lián)合選用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀和氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀兩個代謝物檢測平臺，對血清樣本進(jìn)行全譜代謝組學(xué)檢測。并運(yùn)用多維統(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以探索三種不同疾病濕熱證的共性及特異性變化物質(zhì)。結(jié)果：通過比較不同疾病濕熱證組間代謝組學(xué)差異物質(zhì)，并與健康組對照，發(fā)現(xiàn)肌苷、尿苷、天門冬氨酸、油酸甘油酯、乳酸鹽是三種疾病濕熱證的共同變化物質(zhì)。結(jié)論：基于代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，上述三種不同疾病的典型濕熱證之間，既有反映不同疾病的差異性物質(zhì)，又存在與濕熱證相關(guān)的共性物質(zhì)，從而在代謝水平上為中醫(yī)“異病同證”理論提供了客觀依據(jù)。

中醫(yī)證候代謝組學(xué)濕熱證異病同證物質(zhì)基礎(chǔ)

中醫(yī)學(xué)以整體觀念和辨證論治為理論基礎(chǔ)和思維特色?！白C”是中醫(yī)臨床診治的核心，是中醫(yī)從診斷到治療的橋梁和關(guān)鍵。然而，中醫(yī)證候具有主觀性、復(fù)雜性、多態(tài)性，既往以還原論的思路出發(fā)的研究發(fā)現(xiàn)的證候的微觀指標(biāo)往往是主觀、分散、非特異性的，無法客觀、全面、真實(shí)地反映中醫(yī)學(xué)“證”的本質(zhì)[1]。因此，揭示“證的生物學(xué)基礎(chǔ)及其規(guī)律”仍是中醫(yī)學(xué)有待突破的關(guān)鍵科學(xué)問題之一。

代謝組學(xué)是研究生物體系受到內(nèi)外因素的擾動后，全體分子量低于1 000的代謝產(chǎn)物隨之產(chǎn)生相應(yīng)改變的一種組學(xué)方法[2]，具有能夠從整體、動態(tài)的角度進(jìn)行綜合分析的特點(diǎn)。代謝組學(xué)研究通過整體觀察生物體代謝系統(tǒng)網(wǎng)的終端表象，分析生物體機(jī)能狀態(tài)，與中醫(yī)學(xué)的系統(tǒng)觀、整體觀相一致。代謝產(chǎn)物的變化是機(jī)體生理、病理改變的代謝水平的體現(xiàn)，因而可以很好地揭示中醫(yī)“證”的本質(zhì)[3]，代謝組學(xué)技術(shù)為中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)和臨床有效性研究提供了方法學(xué)依據(jù)[4，5]。

本研究以慢性乙型病毒性肝炎（Chronic Viral Hepatitis B，CHB）、非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）及慢性腎小球腎炎（Chron-ic Glomerulonephritis，CGN）三種不同疾病的典型濕熱證患者為研究對象，并以健康者為對照，聯(lián)合選用超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-QTOFMS）和氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-TOFMS）兩個代謝物檢測平臺，對患者的血清樣本進(jìn)行血清全譜代謝組學(xué)檢測，采用多維統(tǒng)計方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最終發(fā)現(xiàn)肌苷、尿苷、天門冬氨酸、油酸甘油酯及乳酸鹽與三種疾病濕熱證相關(guān)的5種共性物質(zhì)和反映各自不同疾病的差異物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集自2012年10月至2015年2月期間在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院東院肝硬化科病房、脂肪肝?？崎T診、腎病科專家門診以及在廈門中醫(yī)院肝病中心就診的慢乙肝、非酒精性脂肪肝及慢性腎炎三種不同疾病濕熱證患者各30例（按人體I期臨床探索性試驗(yàn)最小樣本量30例，并同時滿足代謝組學(xué)檢測人的樣本所需最小樣本量要求）。并在曙光醫(yī)院東院體檢中心收集健康志愿者30例。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

受試對象符合CHB、NAFLD、CGN疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-8]及濕熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)。濕熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[9]，主癥：①身目黃染，黃色鮮明；②脅肋脹滿或痛；③脘腹脹悶；④煩熱；⑤口干而苦，或口渴少飲；⑥小便黃赤；⑦舌質(zhì)紅，苔黃膩。次癥：①食欲不振；②惡心嘔吐；③肢體困重或困倦乏力；④皮膚瘙癢；⑤大便秘結(jié)或便溏不爽；⑥脈弦滑數(shù)。凡符合上述主癥3項(xiàng)（舌象必備）；或主癥2項(xiàng)（舌象必備），加次癥2項(xiàng)的患者，即辨為濕熱證。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

研究對象的排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①有甲、丙、丁和戊型肝炎等病毒重疊感染；②重型肝炎；③腎功能不全者（Scr≥177 μmol·L-1）；④合并惡性腫瘤、結(jié)締組織疾病者；⑤妊娠或哺乳期婦女；⑥過敏體質(zhì)及明確有其他重要疾病者。

本研究方案經(jīng)所在醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并簽署知情同意書后實(shí)施。

1.2 儀器與試劑

YB-86-400LA型低溫冷凍冰箱（上海億倍實(shí)業(yè)有限公司）；TGL-16B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）；5500型離心機(jī)（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司）；QL-901型微型漩渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；BS124S型電子分析天平（北京賽多利新儀器系統(tǒng)有限公司）；Mill-QⅡ型超純水器（美國Milipore公司）；Xevo G2型超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（Ultraperformance Liquid Chromatography Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometry，UPLC-QTOFMS，美國Waters公司）；氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas Chromatography Time-Of-Flight Mass Spectrometry，GC-TOFMS，美國Leco公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；LightCycler480實(shí)時熒光定量PCR儀，實(shí)驗(yàn)方法為固相吸附法；DXC 800型全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter Synchron公司）；Elecsys 2010型電化學(xué)發(fā)光自動免疫分析儀（瑞士Roche公司）；μs-2200型全自動血細(xì)胞分析儀（深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司）；ACL7000型全自動凝血分析儀（南京利艾成貿(mào)易有限公司）；STZH-HMF-1型肝纖四項(xiàng)檢測儀（北京樂普醫(yī)療器械股份有限公司）。

雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA，含1% TMCS，批號：LB67634，美國Sigma公司）；無水乙醇（批號：20117012）、氯苯丙氨酸（批號：2011314）、甲醇（批號：20111007）、乙腈（批號：20110327）、十七酸（批號：20110421）、氯仿（批號：20110121）、吡啶（批號：20110223）、甲氧胺（批號：20110213）均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 血樣采集

采集早晨空腹血，用4 mL非抗凝真空采血管采血4 mL，4℃，3 000 rpm·min-1離心15 min，離心后用移液器吸取上清（血清）分裝放入EP管內(nèi)，每管400 μL，標(biāo)注后，-80℃下保存?zhèn)溆谩Ｗ⒁馐马?xiàng)：①血清樣本采集前避免劇烈運(yùn)動；②樣本采集前1周囑患者飲食宜清淡，不宜高脂飲食，攝入適量蛋白質(zhì)，禁止飲酒，并忌用刺激性食物如辣椒、胡椒、芥末等，盡量不抽或少抽香煙，不宜喝濃茶及咖啡。

1.4 生化檢測

生化檢測指標(biāo)包括：總膽紅素（Total Bilrubin，TBIL）、直接膽紅素（Direct Bilrubin，DBIL）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)氨酶（Glutamine Transaminase，GGT）、尿素氮（Urea Nitrogen，BUN）、血肌酐（Serum Creatinine，Scr）、白蛋白（Albumin，ALB）、球蛋白（Globulin，GLB）、血糖（Glu-cose，GLU）等指標(biāo)均在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科采用全自動生化分析儀和全自動血細(xì)胞分析儀檢測。

1.5 代謝組學(xué)檢測

1.5.1 血清樣品預(yù)處理方法

（1）UPLC-MS待測樣品制備方法

取解凍后的血清樣本，混和均勻，精密吸取40 μL于1.5 mL的離心管中，加入0.3 mg·mL-1的氯苯丙氨酸水溶液20 μL，再加入40 μL水后，加入于4℃下放置過30 min的萃取溶劑甲醇∶乙腈（1∶9）500 μL，混旋2 min，超聲1 min。于-20℃下放置10 min后，于4℃下，12 000 rpm離心15 min，取上清液各150 μL于玻璃進(jìn)樣瓶中的內(nèi)插管，-80℃凍存。

（2）GC-TOFMS待測樣品制備方法

血清溶解，渦旋混勻后移取100 μL。加入甲醇溶解的1 mg·mL-1的十七酸10μL和水溶解的0.3 mg·mL-1氯苯丙氨酸10μL，混勻后加入混合溶劑300 μL（氯仿∶甲醇=1∶3，v/v），渦旋混勻，-20℃下靜置10 min，4℃下離心10 min（10 000 rpm）。取300 μL上清液于1.5 mL高回收進(jìn)樣瓶中，室溫下真空干燥。抽干后用氮?dú)鈱悠吩俅胃稍铮源_保樣品中沒有水分并排除空氣中水分對衍生的影響（衍生時，空氣濕度≤35%）。氮?dú)獯蹈珊蠹尤?5 mg·mL-1吡啶溶解的甲氧胺80μL，密封后振蕩30 s，30℃搖床（220 rpm）反應(yīng)90 min；反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)瓶中加入80μL的BSTFA（含1%TMCS），密封后振蕩30 s，70℃下反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束之后，振蕩10 s，置于室溫下1 h后進(jìn)樣分析。

1.5.2 UPLC-MS分析條件

色譜分離時采用的色譜柱為AcquityBEHC18分析柱（100·2.1 mm，1.7 μm）（美國Waters公司），柱溫為60℃，流速為0.4 mL·min-1。自動進(jìn)樣器溫度設(shè)為4℃，每次進(jìn)樣5μL。流動相：A相為含0.01%甲酸水溶液，B相為含0.01%的乙腈∶甲醇（95∶5），洗脫方式為梯度洗脫。

質(zhì)譜分析采用ES-（W）模式，檢測參數(shù)設(shè)置如下：毛細(xì)管電壓（Capillary Voltage）為2 300 V，錐孔電壓（Cone Voltage）為40 V，離子源溫度（Source Temperature）為350℃，脫溶劑氣溫（Desolvation Temperature）為120℃，脫溶劑氣流量（Desolvation Gas），700 L·h-1；錐孔氣流量（Cone Gas），40 L·h-1；掃描時間（Scan Time）為0.2 s；掃描范圍（Scan Range）為50-1 000 m/z。

1.5.3 GC-TOFMS分析條件

色譜分析時，取1μL“1.5.1（2）”項(xiàng)下得到的樣品于GC-TOFMS色譜系統(tǒng)進(jìn)樣。色譜及質(zhì)譜參數(shù)如下：系統(tǒng)載氣及流速為氦氣（1 mL·min-1）；電子碰撞電離為70 eV；全掃描范圍（m/z）為30-600；進(jìn)樣口溫度為260℃；接口溫度為270℃；離子源溫度為200℃；色譜柱升溫程序?yàn)?0℃，保持2 min；以10℃·min-1的速度升溫到180℃，以1.5℃·min-1的速度升溫到300℃，保持8 min。

質(zhì)譜分析條件和參數(shù)設(shè)置包括：溶劑延時5 min，電離方式EI，電子能量70 eV，質(zhì)譜掃描范圍：m/z 30-600。

1.6 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入到R2.7軟件中，完成基線校正，峰辨識，峰對齊及內(nèi)標(biāo)扣除和歸一化等計算過程，最終得到一個保留時間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度組成的三維矩陣表。將三維矩陣導(dǎo)入SIMCA-P11.5軟件（Umetrics Sweden）中進(jìn)行多維統(tǒng)計分析。利用商業(yè)化的代謝物譜庫（如Wiley和NIST質(zhì)譜庫）及本實(shí)驗(yàn)室建立的標(biāo)準(zhǔn)品代謝物譜庫進(jìn)行代謝物鑒定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 人口學(xué)特征

分別入組CHB濕熱證患者（YS組）、NAFLD濕熱證患者（FS組）、CGN濕熱證患者（SS組）各30例為病例組；同時收集健康志愿者（N組）30例以對照，4組人口學(xué)分布特征見表1。

2.2 生化檢測

由表2可知，與N組比，YS組的TBIL、DBIL、ALT、AST、GGT、BUN、ALB、GLB含量有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)S組的GGT及S組的ALB的含量有顯著差異（P＜0.01）。與YS組比，F(xiàn)S組的DBIL、ALT、AST、BUN、ALB、GLB及SS組的TBIL、GGT、ALB含量有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。與FS組比，SS組的TBIL、GGT和ALB的含量有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 疾病組與健康組人口學(xué)分布特征表

表2 各組理化指標(biāo)檢測結(jié)果

表2 各組理化指標(biāo)檢測結(jié)果

注：YS.慢乙肝濕熱證組，F(xiàn)S.非酒精性脂肪肝濕熱證組，SS.慢性腎炎濕熱證組，N.健康對照組。與N比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與YS比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與FS比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

SS組10.80±3.59##△2.074±0.71#22.17±13.50##22.28±6.44##23.74±14.79#△△5.15±2.42##72.80±59.22 43.93±3.88**##△△28.7367±3.47##5.86±1.45#檢測項(xiàng)目TBIL/μmol·L-1DBIL/μmol·L-1ALT/IU·L-1AST/U·L-1GGT/IU·L-1BUN/mmol·L-1Scr/μmol·L-1ALB/g·L-1GLB/g·L-1GLU/mmol·L-1N組13.12±3.99 2.60±0.897 44 26.10±14.51 22.375±5.66 22.81±10.73 4.92±1.19 68.66±14.04 48.13±2.88 28.87±2.86 5.37±0.51 YS組26.04±25.38**7.52±16.33*220.57±263.13**117.23±147.02**56.13±51.53*3.39±1.06**75.55±18.21 40.33±3.99**33.13±3.22**5.07±0.53 FS組19.20±8.00 3.29±1.29#83.90±51.29##43.60±27.47##76.98±77.22**4.64±0.97548##70.28±9.85 47.59±2.45##27.79±3.04##5.38±1.09

2.3 代謝組學(xué)

2.3.1 代謝譜分析

為彌補(bǔ)不同檢測平臺的缺陷，聯(lián)合采用氣質(zhì)和液質(zhì)2個代謝物檢測平臺進(jìn)行檢測。GC-TOFMS平臺檢測了91個物質(zhì)，UPLC-MS平臺檢測了79個物質(zhì)。為觀察所有樣本的大致趨勢以及樣本的自然分布和組別關(guān)系，發(fā)現(xiàn)聚類和奇異點(diǎn)，首先使用非監(jiān)督的主成分分析（PCA）法，分別對CHB、NAFLD及CGN的濕熱證和健康對照人群（每組30例）的血液代謝譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在無監(jiān)督狀態(tài)下各組血代謝物譜不能明顯區(qū)分。為進(jìn)一步篩選對分類有重要貢獻(xiàn)的代謝物，再采用有監(jiān)督的偏最小二乘法（PLS-DA）分析方法，對上述4組人群的空腹血清樣本的代謝譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：每兩組間能完全區(qū)分開（圖1）。

2.3.2 差異物質(zhì)分析

聯(lián)合采用單維Mann-Whitney方法的P值（M-WP，P＜0.05，F(xiàn)DR=0.1）和多維模型給出的VIP值（VIP＞1）篩選每兩組間的差異物質(zhì)。結(jié)果顯示，與N組比，YS組發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸（Beta-Alanine）等58種差異物質(zhì)（表3），F(xiàn)S組找到胱氨酸（Cystine）等55種差異物質(zhì)（表4），SS組找到膽胺（Ethanolamine）等49種差異物質(zhì)（表5）；3種不同疾病兩兩組間比較：發(fā)現(xiàn)YS組與FS組的差異物質(zhì)63種（表6），YS組與SS組的差異物質(zhì)57種（表7）；FS組與SS組的差異物質(zhì)57種（表8）。

2.3.3 不同疾病濕熱證的差異性代謝物分析

通過對上述3種疾病的濕熱證組與健康對照組比較，找出了既包括濕熱證也包括疾病信息在內(nèi)的差異物質(zhì)。而通過對不同疾病濕熱證組間差異物質(zhì)的比較，則可以發(fā)現(xiàn)與疾病信息相關(guān)的差異物質(zhì)。故在不同疾病濕熱證整體的差異物質(zhì)中減掉與疾病相關(guān)的信息，便可得到僅與濕熱證相關(guān)的特異性物質(zhì)。

（1）CHB濕熱證的物質(zhì)基礎(chǔ)分析

通過與健康對照組比較，找出CHB濕熱證的58種差異物質(zhì)（表3）；通過對CHB濕熱證與NAFLD濕熱證組疾病差異物質(zhì)的比較，找出反映兩種疾病的63種物質(zhì)信息（表6）。從CHB濕熱證的物質(zhì)中減去CHB疾病的特異性物質(zhì)，得出CHB濕熱證的特異性物質(zhì)（表9）。

（2）NAFLD濕熱證的物質(zhì)基礎(chǔ)分析

通過與健康對照組比較，找出NAFLD濕熱證的55種差異物質(zhì)（表4）。再通過將CHB濕熱證組與NAFLD濕熱證組的差異物質(zhì)比較，找出反映兩種疾病的63種物質(zhì)的信息（表6）。從NAFLD濕熱證的物質(zhì)中減去NAFLD疾病的物質(zhì)后，即為NAFLD濕熱證的28種特異性物質(zhì)（表10）。

（3）CGN濕熱證的物質(zhì)基礎(chǔ)分析

圖1 各組PLS-DA得分圖

表3 YS組與N組的58種差異物質(zhì)

續(xù)表3

表4 FS組與N組的55種差異物質(zhì)

續(xù)表4

表5 SS組與N組的48種差異物質(zhì)

續(xù)表5

表6 YS組與FS組比較的63種差異物質(zhì)

續(xù)表6

表7 YS組與SS組的57種差異物質(zhì)

續(xù)表7

表8 FS組與SS組的57種差異物質(zhì)

通過與健康對照組比較，找出CGN濕熱證的48種差異物質(zhì)（表5）。又通過CGN濕熱證與CHB濕熱證組比較，找出57種反映兩種疾病的物質(zhì)信息（表7）。再從CGN濕熱證的物質(zhì)中減去CGN疾病的特異性物質(zhì)后，就是CGN濕熱證的24種特異性物質(zhì)（表11）。

2.3.4 濕熱證“異病同證”的物質(zhì)基礎(chǔ)分析

通過比較三種不同疾病各自濕熱證特異性物質(zhì)中的共性物質(zhì)，便可發(fā)現(xiàn)其共性物質(zhì)基礎(chǔ)，即異病同證的物質(zhì)基礎(chǔ)。比較表9、表10、表11的特異性物質(zhì)，共找到肌苷、尿苷、天門冬氨酸、油酸甘油酯及乳酸鹽5種與濕熱證相關(guān)的共同物質(zhì)（圖2、表12）。

續(xù)表8

3 討論

“證”的生物學(xué)基礎(chǔ)及其規(guī)律，是當(dāng)下中醫(yī)研究有待突破的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。既往對證的研究，由于未將“病”、“證”結(jié)合討論，故無法厘清所得特異性代謝物是與證相關(guān)還是與疾病相關(guān)。為此，本研究以CHB、NAFLD、CGN 3個具高典型度濕熱證病種的濕熱證患者為研究對象，并與健康者對照，運(yùn)用GC/MS和LC/MS代謝組學(xué)技術(shù)及多維統(tǒng)計分析技術(shù)，探索濕熱證的共性變化物質(zhì)，以闡釋中醫(yī)異病同證的科學(xué)內(nèi)涵。

CHB、NAFLD、CGN均為臨床常見疾病。雖然三者病因迥異，但炎癥反應(yīng)是引起三者肝、腎損傷的共同特點(diǎn)，而相關(guān)研究表明，炎癥與濕熱證密切相關(guān)，炎癥反應(yīng)可能是濕熱證形成的一個重要病理基礎(chǔ)[10-12]。本研究通過對三個疾病組與健康組肝腎功等生化檢測指標(biāo)比較發(fā)現(xiàn)，CHB濕熱證組的肝功能指標(biāo)明顯升高，提示肝細(xì)胞損傷、炎癥狀態(tài)明顯；NAFLD濕熱證組僅見GGT明顯升高，提示脂肪性肝病主要以GGT的變化為主；CGN組則見ALB顯著降低，提示CGN患者腎小球?yàn)V過率異常。三種不同疾病組相互比較，CGN濕熱證組與兩個慢性肝臟病濕熱證組比較，差異主要反映在肝臟功能改變上，顯示了不同臟器疾病的損傷特點(diǎn)；而兩種慢性肝病相比，在不同的肝功能指標(biāo)上也有顯著差異，提示兩種不同的肝臟疾病也存在損傷程度及機(jī)制的區(qū)別。但三組濕熱證沒有發(fā)現(xiàn)特異性共性變化指標(biāo)，因而需代謝組學(xué)方法探索其相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)。

代謝組學(xué)檢測平臺常用的為氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用和核磁共振，因每種儀器都有各自的檢測范圍及缺陷，因而一種儀器不可能檢測到所有物質(zhì)。我們聯(lián)合采用氣質(zhì)和液質(zhì)2個代謝物檢測平臺檢測以彌補(bǔ)不同平臺之不足。結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濕熱證組及健康組每兩組間能完全區(qū)分開。而通過聯(lián)合采用單維和多維模型篩選每兩組間的差異物質(zhì)，我們分別發(fā)現(xiàn)了三種不同疾病濕熱證組各自的特異性物質(zhì)（分別為58種、55種、49種）；兩兩組間比較，發(fā)現(xiàn)YS組與FS組、YS組與SS組及FS組與SS組的差異物質(zhì)分別為63種、57種、57種。

表9 27種CHB濕熱證的差異性物質(zhì)

表10 NAFLD濕熱證的差異性物質(zhì)

表11 CGN濕熱證的特異性物質(zhì)

圖2 三組間差異性物質(zhì)維恩圖

表12 三種疾病濕熱證的共性物質(zhì)

為尋找不同病、證的差異性物質(zhì)及濕熱證的共性物質(zhì)，需去除與病、證無關(guān)的影響因素。故選取了年齡、性別及體重基本可匹配的30例健康志愿者為對照。但因3種疾病中，CHB及NAFLD女性發(fā)病率比較低，3組間在性別上有顯著性差異。因而我們在數(shù)據(jù)的前處理過程中，采用標(biāo)準(zhǔn)化、中心化以及數(shù)據(jù)過濾技術(shù)以排除性別的影響。

此外，為了去除疾病的影響因素，理論上還應(yīng)以非濕熱證組病例為對照。但考慮到非濕熱證組混雜因素較多，為提高對照效能，理想的方案是選擇同種疾病中的隱證者，即傳統(tǒng)中醫(yī)四診“無證可辨”或因信息量少“難以辨證”，而實(shí)驗(yàn)室檢查或影像學(xué)診斷發(fā)現(xiàn)疾病的患者為對照。但受臨床研究時間及患者量所限，很難在有限時間內(nèi)收集到與3個不同疾病各自對應(yīng)的真正隱證的患者。有些看似隱證的患者也只是癥狀表現(xiàn)不典型而已。最終只收集到了醫(yī)院的優(yōu)勢病種且隱證者相對多見的慢乙肝患者隱證30例。因而，我們選擇通過對三種不同疾病的濕熱證差異物質(zhì)進(jìn)行比較分析以去除疾病信息的方法（經(jīng)與慢乙肝中與隱證者對照的方法比較，得到基本一致的結(jié)果，具體結(jié)果略），最終找到肌苷（Inosine）、尿苷（Uridine）、天門冬氨酸（Aspartic acid）、油酸甘油酯（1-oleoyl-rac-glycerol）及乳酸鹽（Lactate）等5種濕熱證共同的差異物質(zhì)。這5個物質(zhì)，除了肌酐在非酒精性脂肪肝患者血清中升高外，其他4個物質(zhì)在三種疾病患者血清中表達(dá)均是下降的，變化的趨勢一致，表明三種疾病的濕熱證具有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)。

肌苷屬于機(jī)體的正常成分，為腺嘌呤的前體，與體內(nèi)能量代謝、核酸代謝及蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)。能活化丙酮酸氧化酶系，提高輔酶A的活性，而輔酶A是體內(nèi)諸多酶促反應(yīng)的輔助因子，與人體能量代謝、物質(zhì)合成、免疫系統(tǒng)的激活都密切相關(guān)，可使組織細(xì)胞在低能缺氧狀態(tài)下的代謝能夠繼續(xù)順利進(jìn)行[13]。其特異性變化反映了濕熱證可能與機(jī)體組織細(xì)胞缺氧狀態(tài)相關(guān)，其外候可能與其影響體內(nèi)一系列代謝及免疫功能的狀態(tài)有關(guān)；尿苷，即尿嘧啶核苷酸，是嘧啶合成代謝的中間體，與核酸代謝相關(guān)，揭示濕熱證可能與嘧啶代謝紊亂相關(guān)；天門冬氨酸對生物體的合成至關(guān)重要。是生物體內(nèi)賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸等氨基酸的合成原料之一，同時也是嘌呤、嘧啶堿基的合成的前體。它是鳥氨酸循環(huán)的必需物質(zhì)，具有增強(qiáng)肝功能、消除疲勞的作用。有報道表明天門冬氨酸含量與濕熱傷陰耗氣所導(dǎo)致的疲勞感聯(lián)系密切。天門冬氨酸作為底物可生成谷氨酸和草酰乙酸，谷氨酸可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺和谷胱甘肽，谷胱甘肽具有抗氧化和解毒功能，草酰乙酸參與三羧酸循環(huán)，為組織細(xì)胞提供能量，促進(jìn)損傷肝細(xì)胞的修復(fù)與再生，恢復(fù)肝臟功能[14]。這也從另一方面表明濕熱證與能量代謝有很大關(guān)系；油酸甘油酯屬于不飽和甘油酯，是由油酸和甘油酯化所生成的，其代謝水平改變可能與濕熱證患者厭食油膩，甘油三酯攝入不足，或是肝臟分解甘油三酯功能減弱有關(guān)；乳酸鹽參與調(diào)控機(jī)體的代謝平衡，對酸堿平衡、ATP的合成等方面起重要作用。乳酸鹽可以在肝臟進(jìn)行糖異生，但大部分是通過血液到達(dá)氧充足的臟器進(jìn)行氧化反應(yīng)。乳酸鹽水平的變化從另一個角度證明了機(jī)體氧化反應(yīng)增強(qiáng)，新陳代謝加快[15]。

綜上，上述5種物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，提示CHB、NAFLD及GGT三種疾病濕熱證的出現(xiàn)，可能與體內(nèi)核酸代謝、能量代謝、脂肪酸代謝以及氨基酸失調(diào)等環(huán)節(jié)有關(guān)。因而部分揭示了中醫(yī)“異病同證”存在共性物質(zhì)基礎(chǔ)的假說。魏濱等[16]通過采用GC-MS檢測平臺及PCA方法對大腸癌和肝癌兩種不同疾病術(shù)后肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證的血漿代謝物譜進(jìn)行分析，亦發(fā)現(xiàn)了甘氨酸等7種濕熱證的共同代謝產(chǎn)物，同樣涉及到能量代謝通路，與我們的結(jié)果有相似之處。因而表明代謝組學(xué)方法是研究“異病同證”生物學(xué)基礎(chǔ)的有效工具之一。但囿于臨床收集患者濕熱證的典型度、樣本量、病種以及不同疾病人群人口學(xué)特征匹配度低等的局限，故上述結(jié)果，還有待于今后擴(kuò)大樣本量，并通過代謝組學(xué)靶向檢測以進(jìn)一步驗(yàn)證，以期能更準(zhǔn)確地揭示不同疾病濕熱證的共性物質(zhì)基礎(chǔ)。

1陳逸明.作為方法的中醫(yī)學(xué)—中醫(yī)藥的復(fù)雜性研究.哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文,2012：1-106.

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16魏濱,呼雪慶,宋雅楠,等.大腸癌和肝癌術(shù)后“異病同證”的代謝組學(xué)研究.世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2016,18(9)：1500-1506.

Study on“Different Diseases of the Same Syndrome”Damp-heat Syndrome based on Metabonomics

Liu Chang1,6,Gou Xiaojun2,Huang Di3,Zhao Chaoqun1,Liu Ping1,4, Mu Yongping1,Cao Jianmei5,Zhang Hua1
(1.Institute of Liver Diseases,Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Key Laboratory of Liver and Kidney Disease(Ministry of Education),Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine,Shanghai 201203,China;2.Central Laboratory,Baoshan District Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine of Shanghai,Shanghai 201999,China;3.Traditional Chinese Medicine Institute of Kidney Disease, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China;4.EInstitute of TCM Internal Medicine,Shanghai Municipal Education Commission,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China;5.Graduate School of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China;6.Institute of Detoxification Monitoring and Treatment of Shandong Province,Jinan 250000,China)

This study was aimed to reveal the material basis on“different diseases of the same syndrome”damp-heat syndrome from the level of metabonomics.The typical damp-heat syndrome patients diagnosed as chronic viral hepatitis B,non-alcoholic fatty liver disease,or chronic glomerulonephritis were included,with 30 cases in each disease.There were 30 healthy volunteers in the control group.The serum samples were detected by UPLC-QTOFMS and GC-TOFMS. And then,the results were analyzed by variance analysis in order to find out the generality and specificity of metabolic material in three different diseases with damp-heat syndrome.The results showed that through comparisons of different diseases with damp-heat syndrome,as well as the healthy group as control,it was revealed that inosine,uridine,aspartic acid,oleic acid glyceride and lactate were the same substances of three diseases of damp-heat syndrome.It was concluded that based on metabonomics,as for three different diseases with damp-heat syndrome,there were different substances among different diseases,but common substances related to damp-heat syndrome.Thus,it provided objective evidences for the theory of“different diseases of the same syndrome”in traditional Chinese medicine(TCM)from the level of metabonomics.

Traditional Chinese medicine syndrome,metabonomics,damp-heat syndrome,different diseases of the same syndrome,material basis

10.11842/wst.2017.03.003

R2-031

A

（責(zé)任編輯：吳朦，責(zé)任譯審：王晶）

2017-01-16

修回日期：2017-03-15

＊上海市自然科學(xué)基金（12ZR1432300）：基于代謝組學(xué)技術(shù)的濕熱證"異病同證"生物學(xué)基礎(chǔ)研究，負(fù)責(zé)人：張華；上海市教育委員會科研創(chuàng)新項(xiàng)目（重點(diǎn)項(xiàng)目）（14ZZ119）：基于代謝組學(xué)及化學(xué)計量學(xué)方法的肝炎后肝硬化中醫(yī)虛實(shí)證候分類特征研究，負(fù)責(zé)人：張華；國家自然科學(xué)基金（81673849）：慢性乙型肝炎及非酒精性脂肪性肝病“濕熱證”的代謝網(wǎng)絡(luò)研究，負(fù)責(zé)人：張華。

＊＊通訊作者：張華，博士，副教授，主要研究方向：中醫(yī)肝病與證候物質(zhì)基礎(chǔ)研究；曹健美，博士，副研究員，主要研究方向：中醫(yī)肝病臨床與基礎(chǔ)。