陳伊，韋常宏，寧淑芳，韋文娥，劉海洲，利基林，張力圖

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021)

結(jié)直腸癌組織KRAS、BRAF基因突變情況及其臨床意義

陳伊，韋常宏，寧淑芳，韋文娥，劉海洲，利基林，張力圖

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021)

目的 探討結(jié)直腸癌組織KRAS、BRAF基因突變情況及其臨床意義。方法 選擇行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者262例，采用ARMS-PCR法檢測其結(jié)直腸癌組織KRAS基因外顯子2第12、13位密碼子及BRAF V600E基因突變情況，分析其與患者臨床病理參數(shù)、肝轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 262例結(jié)腸癌患者中女性患者98例。262例份結(jié)腸癌組織中，KRAS基因突變49例(18.7%)，其中第12位密碼子突變37例(包括1例KRAS復(fù)合突變)，第13位密碼子突變12例；184例份結(jié)腸癌組織中，BRAF V600E基因突變6例。結(jié)直腸癌組織KRAS基因突變與患者性別(女性)、原發(fā)腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況均有關(guān)，BRAF基因突變與民族、家族史、原發(fā)腫瘤分化程度均有關(guān)(P均<0.05)。同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者KRAS基因突變率高于異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者，KRAS基因G13D突變率低于異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者(P均<0.05)。KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間短于未突變者(P<0.05)。KRAS基因突變是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)。BRAF基因突變與未突變者生存時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 結(jié)直腸癌組織KRAS基因突變率高，BRAF基因突變率低；KRAS基因突變多發(fā)生于女性，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

結(jié)直腸癌；KRAS基因；BRAF基因；基因突變；預(yù)后

KRAS基因是EGFR信號(hào)通路上的一個(gè)重要作用靶點(diǎn)，抗EGFR單克隆抗體(西妥昔單抗、帕尼單抗)治療結(jié)直腸癌的療效與KRAS基因突變狀態(tài)密切相關(guān)，只有KRAS野生型患者才可從抗 EGFR單克隆抗體單藥治療或聯(lián)合化療中獲益[1]。BRAF V600E基因是KRAS基因下游的作用位點(diǎn)，其突變狀態(tài)可能會(huì)影響抗EGFR單克隆抗體的治療效果。2009年1月～2012年12月，本研究觀察了結(jié)直腸癌組織KRAS與BRAF基因的突變情況，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者262例，男164例、女98例，年齡24～87歲、中位年齡55歲；民族：漢族182例、壯族70例、其他10例；家族史：結(jié)直腸腺癌家族史4例、大腸腺瘤家族史2例、潰瘍性結(jié)腸炎家族史2例、家族性腺瘤性息肉病1例；組織學(xué)類型：腺癌229例、黏液腺癌+印戒細(xì)胞癌33例；腫瘤部位：左半結(jié)腸81例、右半結(jié)腸70例、直腸111例；原發(fā)腫瘤分化程度：低分化93例、中分化161例、高分化8例；原發(fā)腫瘤直徑：≤5 cm 146例、>5 cm 116例；T分期：T1、T2期20例、T3、T4期242例；N分期：N0期95例、N1期98例、N2期69例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況：無轉(zhuǎn)移70例、肝轉(zhuǎn)移135例、其他部位轉(zhuǎn)移57例；肝轉(zhuǎn)移情況：同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移105例、異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移30例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期35例、Ⅲ、Ⅳ期227例。均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌，術(shù)前均未接受抗EGFR靶向治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 癌組織KRAS、BRAF基因突變檢測 采用ARMS-PCR法。收集262例患者術(shù)中切除的新鮮腫瘤組織，立即放入液氮中冷凍， -80 ℃冰箱保存。將組織進(jìn)行甲醛固定、石蠟包埋，4 μm厚切片，脫蠟、水化，共10張切片。取1張切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下選擇腫瘤細(xì)胞富集區(qū)域，確保其腫瘤細(xì)胞比例≥80%。取其余9張切片，參照DNeasy Blood &Tissue Kit和QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒(德國Qiagen公司)說明書提取樣本DNA，采用ARMS-PCR法檢測KRAS基因外顯子2第12、13位密碼子突變情況。其中184例份結(jié)直腸癌組織僅行BRAF V600E突變檢測。參照人類KRAS基因7種突變檢測試劑盒和人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒說明書，KRAS基因外顯子2上游引物：5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTG-3′，下游引物：5′-GGTGCAGGACCATTCTTTGA-3′，目的片段：173 bp；BRAF基因第15號(hào)外顯子上游引物：5′-GCTFGCTCTGATAGGAAAATGAG-3′，下游引物：5′-GTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3′，目的片段：237 bp。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95 ℃、5 min；95 ℃、25 s，64 ℃、20 s，72 ℃、20 s，循環(huán)15次；93 ℃、25 s，60 ℃、35 s，72 ℃、20 s，循環(huán)31次。每次試驗(yàn)均按要求設(shè)定陰性、陽性對(duì)照孔及空白對(duì)照孔。使用Roche480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳確定后，根據(jù)突變檢測試劑盒說明書提供的判讀原則，將樣品ΔCt值(突變Ct值-外控Ct值)與信號(hào)閾值比較，樣品檢測結(jié)果分為陽性和陰性。

1.3 相關(guān)性分析 分析KRAS、BRAF基因突變與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系；隨訪至2015年12月，以死亡為終點(diǎn)事件，繪制生存曲線，分析KRAS、BRAF基因突變與患者生存時(shí)間及預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。KRAS、BRAF基因突變率與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-Rank檢驗(yàn)法分析KRAS、BRAF基因突變對(duì)患者生存時(shí)間的影響，COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行預(yù)后影響因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS、BRAF基因突變情況 262例份結(jié)腸癌組織中，KRAS基因突變49例(18.7%)；第12位密碼子突變37例(14.1%)，包括1例KRAS復(fù)合突變(G12V和G12R同時(shí)突變)，第13位密碼子突變12例(4.6%)，未檢出第12、13位密碼子同時(shí)突變；其余均未發(fā)生突變。184例份結(jié)腸癌組織中，BRAF V600E基因突變6例(3.3%)。見表1。同時(shí)性與異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者KRAS基因突變率分別為27.6%(29/105)、6.7%(2/30)，二者比較P<0.05； KRAS基因G13D突變率分別為4.8%(5/105)、30%(9/30)，二者比較P<0.05；同時(shí)性與異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者KRAS基因其他類型突變率比較P均>0.05。

2.2 結(jié)直腸癌組織KRAS、BRAF基因突變與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表2。

2.3 結(jié)直腸癌組織KRAS、BRAF基因突變與患者預(yù)后的關(guān)系 患者術(shù)后隨訪2.37～77.31個(gè)月，失訪8例，隨訪率為96.9%。 共30例患者死亡， 中位

表1 結(jié)直腸癌組織中KRAS、BRAF基因突變情況

注：檢出1例KRAS復(fù)合突變，為G12V和G12R同時(shí)突變。

表2 結(jié)直腸癌組織KRAS、BRAF基因突變與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

生存時(shí)間為22.43個(gè)月。生存曲線分析結(jié)果顯示，KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間為(27.43±3.2)個(gè)月，未突變者為(46.22±4.25)個(gè)月，二者比較P<0.05；BRAF基因突變的結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間為(31.23±3.61)個(gè)月，未突變者為(35.93±2.19)個(gè)月，二者比較P>0.05。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析結(jié)果顯示，KRAS基因突變是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(β=2.044，RR=7.725，95%CI：2.722～21.927，P<0.01)。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移是一個(gè)受多基因、多因素影響的過程，EGFR與肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。KRAS、BRAF基因是該信號(hào)通路下游的重要位點(diǎn)，其中BRAF基因又是KRAS基因下游的重要位點(diǎn)，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。KRAS基因野生型患者能從抗EGFR靶向治療中獲益，但仍有部分患者對(duì)抗EGFR藥物治療無反應(yīng)；BRAF基因與抗EGFR治療效果的關(guān)系目前無統(tǒng)一定論，尚不能單獨(dú)作為預(yù)測因子。本研究結(jié)直腸癌組織KRAS基因突變率為18.7%，BRAF基因突變率為3.3%，與目前國內(nèi)外研究報(bào)道接近[3～5]。一項(xiàng)來自多地區(qū)、納入6 346例患者的研究表明， G12R突變?yōu)槲覈币娡蛔冾愋蚚6]。本研究檢出1例G12R突變，該患者同時(shí)伴有G12V突變；并未檢出KRAS基因第12、13位密碼子同時(shí)突變，表明各密碼子突變是相互獨(dú)立的。V600E為BRAF基因的常見突變位點(diǎn)，本研究顯示該位點(diǎn)突變率較低，僅為3.3%。

高靜等[4]研究認(rèn)為，KRAS突變更易發(fā)生在女性且分化程度較好的右半結(jié)腸癌患者中，并與年齡有關(guān)。也有研究認(rèn)為，KRAS基因突變與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤位置等臨床病理參數(shù)均無關(guān)[7，8]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織KRAS基因突變與患者的性別、原發(fā)腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況均有關(guān)。Chen等[9]大樣本Meta分析結(jié)果顯示，女性、老年患者以及右半結(jié)腸癌患者BRAF基因突變率較高；但也有研究顯示BRAF突變與臨床病理參數(shù)之間無顯著性關(guān)系[10]。本研究中結(jié)直腸癌組織BRAF基因突變與患者的民族、家族史、原發(fā)腫瘤分化程度均有關(guān)。

KRAS、BRAF基因突變對(duì)結(jié)直腸癌患者肝轉(zhuǎn)移及預(yù)后的影響報(bào)道不一[10,11]。Bazan等[12]認(rèn)為，KRAS基因第13位密碼子突變與高度侵襲性結(jié)直腸癌相關(guān)，預(yù)示其可能是腫瘤擴(kuò)散和導(dǎo)致患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Yaeger等[13]研究表明，BRAF基因突變與轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌預(yù)后差有關(guān)，伴有該基因突變的患者更容易發(fā)生肝、腹膜轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移瘤術(shù)后生存期更短。Modest等[14]研究結(jié)果表明，KRAS基因第13位密碼子突變與結(jié)直腸癌發(fā)生同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移及局部轉(zhuǎn)移相關(guān)。梁立等[15]指出，結(jié)直腸癌同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移與RAS-RAF-ERK、P13K-PTEN-AKT通路同時(shí)激活有關(guān)，異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移與P13K-PTEN-AKT單獨(dú)激活、RAS-RAF-ERK不激活有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者KRAS基因突變率高于異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者，KRAS基因G13D突變率低于異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者。G13D突變有一定的療效評(píng)估作用，G13D突變的結(jié)直腸癌患者能從一線西妥昔單抗治療中獲益，而且其獲益程度與KRAS野生型相仿，提示KRAS基因G13D突變的特殊性。由于已經(jīng)得出BRAF基因突變與患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況無關(guān)的結(jié)果，故本研究未對(duì)同時(shí)性與異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者的BRAF基因突變率進(jìn)行對(duì)比分析。文獻(xiàn)報(bào)道，KRAS第13位密碼子突變的患者較未突變者生存期更短[5, 16]。但本研究結(jié)果顯示，KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間明顯短于未突變者，KRAS基因突變是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示KRAS基因突變患者預(yù)后較差；但本研究并未發(fā)現(xiàn)KRAS基因G13D突變、BRAF基因突變與預(yù)后的關(guān)系，可能與樣本量小、隨訪時(shí)間短有關(guān)。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織KRAS基因突變率高，BRAF突變率低；KRAS基因突變多發(fā)生于女性，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。未來將進(jìn)一步明確KRAS基因在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用，及其突變相關(guān)生物標(biāo)志物的表達(dá)變化，以期為結(jié)直腸癌的快速診斷、病情判斷及預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

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廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(桂科攻1298003-2-8)；南寧市青秀區(qū)科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(2015S03)。

張力圖(E-mail： zhanglitu@gmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.026

R735.3

B

1002-266X(2017)16-0077-04

2016-10-13)