俞開敏，楊蘭，陸俊佳

(1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧530021；2南寧市第二人民醫(yī)院)

血清Cys C及其+73、-82位點(diǎn)基因多態(tài)性與廣西壯族人群代謝綜合征發(fā)病的關(guān)系

俞開敏1，楊蘭2，陸俊佳2

(1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧530021；2南寧市第二人民醫(yī)院)

目的 探討血清胱抑素C(Cys C)及其+73和-82位點(diǎn)基因多態(tài)性與廣西壯族人群代謝綜合征(MS)發(fā)病的關(guān)系。方法 選擇壯族MS患者和漢族MS患者各100例(分別為壯族MS組和漢族MS組)，同期體檢健康的壯族和漢族志愿者各100例(分別為壯族健康組和漢族健康組)。采用免疫比濁法檢測(cè)各組血清Cys C、肌酐(Cr)，聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法檢測(cè)Cys C+73、-82位點(diǎn)基因多態(tài)性。結(jié)果 血清Cys C、Cr水平：壯族MS組均高于壯族健康組，漢族MS組均高于漢族健康組(P均<0.01)；壯族MS組與漢族MS組比較、壯族健康組與漢族健康組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。血清Cys C與Cr水平呈正相關(guān)(r=0.634，P<0.01)。四組Cys C +73、-82位點(diǎn)等位基因頻率兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 廣西壯族MS患者血清Cys C水平升高，可反映患者的腎功能狀態(tài)；Cys C +73、-82位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與MS的發(fā)病及民族情況均無關(guān)。

代謝綜合征；胱抑素C；基因多態(tài)性；腎功能；壯族；廣西地區(qū)

代謝綜合征(MS)是一組多種代謝異常聚集的病理狀態(tài)和臨床癥侯群，MS患者多伴有高血壓、血脂升高、糖耐量降低以及肥胖，是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。胱抑素C(Cys C)是反映腎小球?yàn)V過功能的內(nèi)源性標(biāo)志物，可調(diào)節(jié)特異性組織蛋白酶的活性，影響細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、降解的動(dòng)態(tài)平衡以及粒細(xì)胞的吞噬、趨化作用，也與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其基因突變位點(diǎn)及其頻率分布受人種、地域等因素的影響較大。本研究探討廣西壯族MS發(fā)病與患者血清Cys C及其+73、-82位點(diǎn)基因多態(tài)性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月～2015年1月廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院收治的壯族MS患者和漢族MS患者各100例(分別為壯族MS組和漢族MS組)，同期體檢健康的壯族和漢族志愿者各100例(分別為壯族健康組和漢族健康組)。MS的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國成人血脂異常防治指南》[3]。壯族MS組及壯族健康組要求至少三代以上未與外族通婚，各組均無遺傳性疾病家族史及其他急慢性病史，各組間均無血緣關(guān)系。壯族MS組男52例、女48例，年齡46～75歲、中位年齡53.1歲；壯族健康組男55例、女45例，年齡50～71歲、中位年齡53.9歲；漢族MS組男55例、女45例，年齡47～78歲、中位年齡54.3歲；漢族健康組男53例、女47例，年齡49～72歲、中位年齡54.4歲。各組性別、年齡均具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，受試者均知情同意。

1.2 血清Cys C和肌酐(Cr)水平檢測(cè) 抽取各組空腹靜脈血3 mL，注入干燥管中。靜置30 min后，低速(3 000 r/min)離心10 min，分離血清后-20 ℃冰箱保存。應(yīng)用日立7600全自動(dòng)生化儀，采用免疫比濁法檢測(cè)血清Cys C和Cr。

1.3 Cys C +73、-82位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法。取各組空腹靜脈血2 mL于EDTA抗凝管，充分混勻，嚴(yán)格按照DNA抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書操作制備全血DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank提供的Cys C基因啟動(dòng)子序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物：Cys C +73上游引物：5′-TCTATCTAGCTCCAGCCTCTCG-3′，下游引物：5′-TGCTGGCTTTGTTGTACTCG-3′，引物長度254 bp；Cys C-82上游引物：5′-GATGGATGGGGAAGGACAG-3′，下游引物：5′-CAGGATGGCCAGCAGGAG-3′，引物長度379 bp。PCR反應(yīng)體系共50 μL：PCR混合反應(yīng)液8 μL(含dNTP、buffer)、Taq酶 0.5 μL、無菌水37.5 μL、DNA模版2 μL，上、下游引物各1 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。進(jìn)行基因位點(diǎn)限制性片段長度多態(tài)性分析：①Cys C +73位點(diǎn)：PCR后產(chǎn)物20 μL、NgoMⅣ內(nèi)切酶1 μL，buffer 3 μL，無菌水6 μL，37 ℃酶切1 h。PCR產(chǎn)物長度為254 bp(A等位基因)，酶切后為63和191 bp的兩個(gè)片段(G等位基因)。②Cys C-82位點(diǎn)：PCR后產(chǎn)物20 μL、SacⅡ內(nèi)切酶1 μL，buffer 3 μL，無菌水6 μL，37 ℃酶切1 h。PCR產(chǎn)物長度為379 bp(C等位基因) ，酶切后為179和200 bp的兩個(gè)片段(G等位基因)。將5 μL酶切后產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，電壓100 V，電泳30 min后凝膠圖象分析儀下觀察電泳結(jié)果并攝像保存，記錄Cys C +73、-82位點(diǎn)基因型，并計(jì)算等位基因頻率。

2 結(jié)果

2.1 四組血清Cys C、Cr水平比較 血清Cys C、Cr水平：壯族MS組均高于壯族健康組，漢族MS組均高于漢族健康組(P均<0.01)；壯族MS組與漢族MS組比較、壯族健康組與漢族健康組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；見表1。直線相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清Cys C與Cr水平呈正相關(guān)(r=0.634，P<0.01)。

表1 四組血清Cys C、Cr水平比較

注：與壯族健康組比較，*P<0.01；與漢族健康組比較，#P<0.01。

2.2 四組Cys C +73、-82位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Cys C +73、-82位點(diǎn)基因分布符合群體遺傳平衡法則，具有群體代表性(P均>0.05)。四組Cys C +73、-82位點(diǎn)等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 四組Cys C +73、-82位點(diǎn)基因型及等位基因頻率

3 討論

MS是環(huán)境因素、多基因遺傳因素和不良生活習(xí)慣綜合作用而引起的綜合征[1]， 其引發(fā)的多種代謝異常均為心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。Cys C表達(dá)于所有有核細(xì)胞，參與機(jī)體許多生理和病理過程，除了作為評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過功能的一個(gè)重要指標(biāo)外[2]，還可與組織蛋白酶等胱抑素酶形成緊密復(fù)合物，從而抑制組織蛋白酶的活性，影響細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和降解的動(dòng)態(tài)平衡，以及粒細(xì)胞的吞噬及趨化作用，參與AS和炎癥反應(yīng)的病理過程[3，4]。Cys C是心血管事件的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，也是心血管事件發(fā)生及死亡的潛在預(yù)測(cè)因子[5～7]。因此推測(cè)Cys C可能與MS有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，壯族MS組血清Cys C及Cr水平均明顯高于壯族健康組，漢族MS組均明顯高于漢族健康組，與以往研究[8，9]結(jié)果相似。直線相關(guān)性分析顯示，血清Cys C與Cr水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步證明Cys C是評(píng)價(jià)腎濾過功能的一項(xiàng)可靠指標(biāo)。但本研究部分研究對(duì)象臨床信息不全，不能進(jìn)一步分層，故血清Cys C水平能否作為MS患者發(fā)生心血管事件的預(yù)測(cè)因子仍需進(jìn)一步完善。

Cys C編碼基因位于染色體20p11.2，是cystatin超家族的成員之一[10]。有前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，Cys C基因突變可能引起其合成和分泌降低，使Cys C酶的抑制功能減弱，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生一系列生理、病理改變[11,12]。Cys C基因突變主要在基因啟動(dòng)子處，且基因突變及其頻率分布受人種、地域等因素的影響較大[13]。國內(nèi)關(guān)于Cys C基因多態(tài)性與MS的關(guān)系研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，Cys C+73位點(diǎn)的A/G突變導(dǎo)致了信號(hào)肽倒數(shù)第2位的丙氨酸被蘇氨酸替換，而這種替換改變了Cys C向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體的輸運(yùn)，通過中斷信號(hào)肽與成熟蛋白的斷裂來修飾Cys C的分泌加工途徑，從而引起Cys C分泌減少或活性降低[14,15]。本研究結(jié)果顯示，四組Cys C +73、-82位點(diǎn)等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因：①Cys C +73、-82位點(diǎn)基因多態(tài)性不是廣西地區(qū)MS發(fā)病的候選基因位點(diǎn)；②Cys C +73、-82位點(diǎn)G等位基因可能與廣西地區(qū)MS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但因本研究觀察的樣本例數(shù)較少，研究人群代表性還不夠強(qiáng)，不足以檢測(cè)出其相關(guān)性。

綜上所述，廣西壯族MS患者血清Cys C水平升高，血清Cys C水平可反映患者的腎功能狀態(tài)； Cys C +73、-82位點(diǎn)基因多態(tài)性在漢族與壯族人群中比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其是否是壯族MS發(fā)病的易感基因，還需進(jìn)一步研究。

[1] 王雅琴,曹霞,楊聘婷,等.體檢人群代謝綜合征與血清胱抑素C水平的相關(guān)性[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,40(7):742-747.

[2] Ayub S, Zafar MN, Aziz T, et al. Evaluation of renal function by cystatin C in renal transplant recipients[J]. Exp C lin Transplant, 2014,12(1):37-40.

[3] 楊松,蔣穎,吳堅(jiān).缺血性腦卒中患者胱抑素C與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系[J].2013,15(10):1021-1023.

[4] Akgul O, Uyarel H, Ergelen M, et al. Predictive value of elevated cystatin C in patients undergoing primary angioplasty for ST-elevation myocardial infarction[J]. J Crit Care, 2013,28(5):13-20.

[5] Lee SH, Park SA, Ko SH, et al. Insulin resistance and inflammation may have an additional role in the link between cystatin C and cardiovascular disease in type 2 diabetes mellitus patients[J]. Metabolism, 2010,59(2):241-246.

[6] Abid L, Charfeddine S, Kammoun S, et al. Cystatin C: a prognostic marker after myocardial infarction in patients without chronic kidney disease[J]. J Saudi Heart Assoc, 2016,28(3):144-151.

[7] Vieira C, Nabais S, Ramos V, et al. Multimarker approach with cystatin C,N-terminal pro-brain natriuretic peptide ,C-reactive protein and red blood cell distribution width in risk stratification of patients with acute coronary syndromes[J]. Rev Port Cardiol, 2014,33(3):127-136.

[8] 遲玥,唐玲麗,于庭.代謝綜合征患者血清同型半胱氨酸與胱抑素C水平檢測(cè)的臨床意義[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2012,19(1):25-27.

[9] 劉平,隋樹建,徐冬玲,等.胱抑素C與代謝綜合征的相關(guān)性分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2013,93(40):3207-3209.

[10] Perlenfein TJ, Murphy RM. Expression, purification, and characterization of human cystatin C monomers and oligomers[J]. Protein Expr Purif, 2016,117:35-43.

[11] Nquyen A, Hullenman JD. Evidence of alternative cystatin c signal sequence cleavage which is influenced by the A25T polymorphism[J]. PLoS One, 2016,11(2):147684.

[12] Pérez-Calvo JI, Castiella Muruzábal T, Búcar Barjud M, et al. Absence of cystatin C involvement in ventricular remodelling and heart failure[J]. Rev Clin Esp, 2016,216(2):55-61.

[13] Mori J, Tanikawa C, Funauchi Y, et al. Cystatin C as a p53-inducible apoptotic mediator that regulates cathepsin L activity[J]. Cancer Sci, 2016,107(3):298-306.

[14] Osk Snorradottir A, Isaksson HJ, Kaeser SA. Parenchymal cystatin C focal deposits and glial scar formation around brain arteries in Hereditary Cystatin C Amyloid Angiopathy[J]. Brain Res, 2015,(1622):149-162.

[15] Butler JM, Sharif U, Ali M, et al. A missense variant in CST3 exerts a recessive effect on susceptibility to age-related macular degeneration resembling its association with Alzheimer′s disease[J]. Hum Genet, 2015,134(7):705-715.

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(Z2013677)；南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃(ZC20133005)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.027

R589

B

1002-266X(2017)16-0080-03

2016-08-18)