王強強，王夢潔，張玉虹，李皓，高飛，劉陽晨

(1蚌埠醫(yī)學院研究生部，安徽蚌埠 233000；2泰興市人民醫(yī)院)

miR-449a對食管鱗癌細胞Eca-109增殖、遷移、侵襲的影響及機制

王強強1，2，王夢潔1，2，張玉虹1，2，李皓2，高飛2，劉陽晨2

(1蚌埠醫(yī)學院研究生部，安徽蚌埠 233000；2泰興市人民醫(yī)院)

目的 探討miR-449a對食管鱗癌細胞Eca-109增殖、遷移、侵襲的影響及其可能的機制。方法 將食管鱗癌細胞Eca-109分為miR-449a組和NC組，分別轉(zhuǎn)染miR-449a-mimics和NC-mimics；采用實時熒光定量PCR法檢測兩組miR-449a相對表達量，miR-449a組 miR-449a相對表達量明顯高于NC組，證實上調(diào)miR-449a表達的Eca-109細胞模型建立成功。采用CCK-8法、平板克隆形成試驗檢測兩組細胞增殖能力(分別以培養(yǎng)12、24、48 h吸光度值和克隆數(shù)表示)，細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力(以細胞之間的距離表示)，Transwell小室試驗檢測細胞侵襲能力(以侵襲到下室的細胞數(shù)量表示)，流式細胞儀檢測細胞周期比例。采用實時熒光定量PCR法和Western blotting法分別檢測兩組miR-449a直接靶基因E2F3 mRNA及蛋白相對表達量。結果 miR-449a組細胞培養(yǎng)12、24、48 h時的吸光度值及克隆數(shù)、細胞之間的距離、侵襲到下室的細胞數(shù)量均低于NC組(P<0.05或<0.01)。miR-449a組G1期細胞比例高于NC組，S期細胞比例低于NC組(P均<0.05)；兩組G2/M期細胞比例比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-449a組E2F3 mRNA及蛋白相對表達量均低于NC組(P均<0.01)。結論 miR-449a可抑制食管鱗癌細胞Eca-109的增殖、遷移和侵襲；抑制靶基因E2F3表達可能是其作用機制。

食管鱗癌；微小RNA-449a；E2F3基因；細胞增殖；細胞遷移；細胞侵襲

食管癌是中國發(fā)病率排名第四的惡性腫瘤[1]，其中食管鱗癌占80%以上。食管鱗癌惡性程度較高，患者就診時多屬晚期，五年生存率僅20%左右。微小RNA(miRNAs)是一類非編碼小RNA，長21～23個核苷酸序列，通過與靶基因的3′-非編碼區(qū)(UTR)結合而抑制靶基因的表達。研究表明，miRNAs與多種疾病相關，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。miR-449a是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，在肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮抑癌基因作用[3,4]，但是其在食管鱗癌中的生物學作用尚不明確。2015年12月～2016年8月，本研究觀察了miR-449a對食管鱗癌細胞Eca-109(下稱Eca-109細胞)增殖、遷移及侵襲的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：Eca-109細胞購自中國醫(yī)學科學院。主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，miR-449a-mimics及NC-mimics購自蘇州吉瑪基因股份有限公司，TRIzol、LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，Transwell(8 μm孔徑)購自美國Corning公司，Materigel購自美國BD公司，兔抗E2F3多克隆抗體購自美國Abcam公司，細胞周期試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒、RIPA裂解液、ECL-plus試劑盒、兔抗鼠人GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的lgG(羊抗兔)二抗、小牛血清均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 上調(diào)miR-449a表達的Eca-109細胞模型建立 將Eca-109細胞置于含10%胎牛血清及雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/mL)的RPMI1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天重懸細胞，按5×105個/孔的密度接種至6孔板中。待細胞貼壁后將其分為miR-449a組和NC組，分別轉(zhuǎn)染miR-449a-mimics和NC-mimics，嚴格按照LipofectamineTM2000說明書操作。轉(zhuǎn)染6 h后更換含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，200倍熒光顯微鏡下拍照。轉(zhuǎn)染的模擬物帶有熒光標記，轉(zhuǎn)染成功的細胞呈綠色熒光，計算細胞轉(zhuǎn)染效率為90%左右。轉(zhuǎn)染48 h收集兩組細胞，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-449a表達：以TRIzol提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度、濃度合格，光密度(OD)260/280為1.9～2.0，用于后續(xù)實驗。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板進行PCR擴增。miR-449a引物序列：上游引物：5′-GCTGGCAGTGTATTGTTA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。內(nèi)參基因U6引物序列：上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。PCR擴增條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共39個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-449a相對表達量。結果顯示，miR-449a組與NC組miR-449a相對表達量分別為9 278.00±412.62、96.33±6.43，兩組比較P<0.01。證實上調(diào)miR-449a表達的Eca-109細胞模型建立成功。

1.3 miR-449a對Eca-109細胞增殖、遷移、侵襲能力影響的觀察

1.3.1 細胞增殖能力 ①CCK-8法：取兩組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期細胞，制成細胞懸液，按4×103個/孔接種于96孔板中，每組設置3個復孔。分別于細胞貼壁后12、24、48 h加入CCK-8試劑(每100 μL培養(yǎng)液加入10 μL CCK-8試劑)，避光孵育3 h。采用酶標儀檢測450 nm處OD值。OD值越高說明細胞增殖能力越強。②平板克隆形成試驗：取兩組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期細胞，消化后按200個/孔接種于6孔板中。繼續(xù)培養(yǎng)9天左右，待6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時停止培養(yǎng)。加入0.1%結晶紫染液進行染色，200倍顯微鏡下觀察，以細胞染成紫色且數(shù)量大于50個作為1個克隆，計數(shù)兩組克隆數(shù)。實驗重復3次。

1.3.2 細胞遷移能力 采用細胞劃痕試驗。取兩組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期細胞，以3×105個/孔接種于6孔板中。待細胞融合達到80%左右時，使用高壓消毒后的100 μL槍頭在6孔板上垂直劃一直線。PBS沖洗2遍，加入無血清培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。200倍顯微鏡下拍照，采用Image J軟件打開圖片，隨機測量劃線即刻與培養(yǎng)24 h后的細胞距離，以兩次細胞距離的差值計算細胞遷移距離。實驗重復3次。

1.3.3 細胞侵襲能力 采用Transwell小室試驗。取60 μL Materigel稀釋液(1∶3)包被小室。取兩組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期細胞，消化后以無血清培養(yǎng)基重懸，將200 μL細胞懸液加于Transwell上室中，下室中加入含有血清的完全培養(yǎng)基500 μL。培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液，使用棉簽拭去上室中未侵襲的細胞，PBS洗滌2次；10%甲醛固定15 min，PBS洗滌2次；0.1%結晶紫染色15 min，PBS洗滌兩次。400倍顯微鏡下拍照，計數(shù)侵襲到下室的細胞數(shù)量。實驗重復3次。

1.3.4 細胞周期比例 采用流式細胞術。取兩組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期細胞，消化后按5×105個/孔接種于6孔板中。PBS洗滌2次，胰酶消化，離心后棄上清，4 ℃ PBS洗滌2次，加入70%預冷乙醇固定，冰箱過夜。按細胞周期檢測試劑盒說明書配制碘化丙啶溶液，染液重懸后暗室放置30 min，將染色后的細胞上流式細胞儀檢測周期比例。實驗重復3次。

1.4 miR-449a靶基因預測、驗證及靶基因mRNA、蛋白表達檢測

1.4.1 miR-449a靶基因預測及驗證 通過生物信息軟件工具(Targetscan、miR-Base)預測miR-449a靶基因。結果顯示，E2F3基因3′端有潛在的miR-449a結合位點。推測E2F3可能是miR-449a的直接靶基因。參照Ren等[5]的方法，采用熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。結果顯示：miR-449a組和NC組E2F3 3′-UTR野生型相對表達量分別為0.37±0.13、0.97±0.86，兩組比較P<0.05；E2F3 3′-UTR突變型相對表達量分別為0.91±0.15、0.97±0.87，兩組比較P>0.05。證實E2F3是miR-449a的直接靶基因。

1.4.2 E2F3 mRNA及蛋白表達檢測 ①E2F3 mRNA表達：采用實時熒光定量PCR法。E2F3引物序列：上游引物：5′-AATATGGCGTAGTATCTCCG-3′，下游引物：5′-CTTCCCAAACATACACCCAC-3′。以GAPDH為內(nèi)參基因，實驗步驟參照1.2的方法，計算E2F3 mRNA相對表達量。②E2F3蛋白表達：采用Western blotting法。收集兩組對數(shù)生長期細胞，RIPA裂解液(加入PMSF)提取總蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，Western封閉液于室溫條件下封閉4 h。加入一抗(E2F3 1∶2 000、GAPDH 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日加入二抗室溫反應2 h，經(jīng)BeyoECL化學發(fā)光檢測試劑顯色，化學發(fā)光儀顯色拍照，采用Image軟件分析灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參(GAPDH)蛋白灰度值的比值作為E2F3蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞增殖能力比較 miR-449a組細胞貼壁后12、24、48 h的OD值分別為0.86±0.53、1.56±0.29、2.17±0.69，NC組分別為0.75±0.22、1.27±0.25、1.58±0.47；兩組同時間點比較P均<0.01。miR-449a組、NC組克隆數(shù)分別為(76.00±10.07)、(175.66±18.23)個，兩組比較P<0.01。

2.2 兩組細胞遷移能力比較 miR-449a組細胞遷移距離為(12.68±0.77)μm，NC組為(27.68±6.01)μm，兩組比較P<0.05。

2.3 兩組細胞侵襲能力比較 miR-449a組侵襲到下室的細胞數(shù)量為(76.67±9.61)個，NC組為(267.00±33.42)個；兩組比較P<0.05。

2.4 兩組細胞周期比例比較 miR-449a組G1期細胞比例高于NC組，S期細胞比例低于NC組(P均<0.05)；兩組G2/M期細胞比例比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組不同時期的細胞比例比較

注：與NC組比較，*P<0.05。

2.5 兩組E2F3 mRNA及蛋白相對表達量比較 miR-449a組E2F3 mRNA及蛋白相對表達量均低于NC組(P均<0.01)。見表2。

表2 兩組E2F3 mRNA及蛋白相對表達量比較

注：與NC組比較，*P<0.01。

3 討論

研究表明，miRNAs能夠參與調(diào)節(jié)腫瘤的多種生物學功能，包括增殖、凋亡、侵襲、遷移等[6,7]。miRNAs與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關系是近年研究的熱點。Byrnes等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a與食管癌的發(fā)生有關。亦有報道稱，miR-124能夠下調(diào)信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)表達，從而抑制食管癌細胞的增殖和侵襲[9]。本課題組前期研究結果顯示，miR-124在食管癌組織中低表達，可通過激活miR-124/CDK4信號通路而抑制食管癌細胞TE-1的增殖和遷移[10]。以上研究均表明，某些miRNAs異常表達可促進食管癌的發(fā)生、發(fā)展。miR-449a作為一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，已被證實在多種惡性腫瘤中低表達[3]。在腦膠質(zhì)瘤中，miR-449a通過誘導細胞分化和阻滯細胞停留在G0/G1期而抑制腫瘤細胞增殖[11]。miR-449a在肺癌組織中低表達，上調(diào)miR-449a可以減少肺癌細胞增殖，從而影響腫瘤進程[5]。在胃癌中，過表達miR-449a后可通過調(diào)節(jié)Bcl-2基因和細胞周期蛋白D1而抑制癌細胞增殖[12]。

本研究結果顯示，miR-449a組細胞貼壁后12、24、48 h的OD值及克隆數(shù)、細胞遷移距離、侵襲到下室的細胞數(shù)量均低于NC組，說明miR-449a表達上調(diào)可降低Eca-109細胞的增殖、遷移及侵襲能力。本研究miR-449a組G1期細胞比例高于NC組，S期細胞比例低于NC組，說明miR-449a表達上調(diào)可將Eca-109細胞阻滯于G1期，減少細胞進入S期。以上均表明，miR-449a在食管癌的發(fā)展中發(fā)揮一定的抑癌基因作用。

在肺癌組織中，E2F3被證實是miR-449a的一個靶基因[5]。E2F3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子定位于染色體6p22，是E2F家族8個成員中的一個，在細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換過程中擔任著重要角色[13]。E2F3作為一種致癌基因，具有促進細胞增殖、減少細胞凋亡的作用[14]。最近研究報道，E2F3與腎透明細胞癌患者的某些臨床病理特征有關，并在腎癌和非小細胞肺癌組織中表達升高[15,16]。E2F3在肺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移過程中也具有重要作用[17]，一些miRNA(如miR-199a、miR-141、miR-144等)可調(diào)節(jié)E2F3表達而發(fā)揮作用[14,18]。因此，E2F3是促進腫瘤細胞增殖和遷移的重要致癌基因。尋找靶向抑制E2F3基因的小分子藥物，對腫瘤的治療具有重要價值。本研究通過生物信息學網(wǎng)站預測，E2F3是miR-449a的靶基因，并通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證；miR-449a組E2F3 mRNA及蛋白相對表達量均低于NC組，說明上調(diào)miR-449a可以抑制E2F3表達。

綜上所述，miR-449a可抑制Eca-109細胞的增殖、遷移、侵襲，抑制靶基因E2F3表達可能是其作用機制。因此，miR-449a可作為食管鱗癌治療的一個新靶點。本研究的不足為只在細胞水平進行了分析，缺乏實體實驗證據(jù)；未深入分析E2F3對食管鱗癌細胞的生物學影響。以上均為本課題組未來的研究重點。

[1] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[2] Cheng CJ, Bahal R, Babar IA, et al. MicroRNA silencing for cancer therapy targeted to the tumour microenvironment[J]. Nature, 2014,518(7537): 107-110.

[3] Chen SP, Liu BX, Xu J, et al. MiR-449a suppresses the epithelial-mesenchymal transition and metastasis of hepatocellular carcinoma by multiple targets[J]. BMC Cancer, 2015(15):706.

[4] Li X, Li H, Zhang R, et al. MicroRNA-449a inhibits proliferation and induces apoptosis by directly repressing E2F3 in gastric cancer[J]. Cell Physiol Biochem, 2015,35(5):2033-2042.

[5] Ren XS, Yin MH, Zhang X, et al. Tumor-suppressive microRNA-449a induces growth arrest and senescence by targeting E2F3 in human lung cancer cells[J]. Cancer Lett, 2014,344(2):195-203.

[6] Di Leva G, Garofalo M, Croce CM. MicroRNAs in cancer[J]. Annu Rev Pathol, 2014(9):287-314.

[7] 祖彩華,張國梁,劉濤.miR-506對結腸癌細胞增殖的影響及其作用機制[J].山東醫(yī)藥,2016,56(40):5-8.

[8] Byrnes KA, Phatak P, Mansour D, et al. Overexpression of miR-199a-5p decreases esophageal cancer cell proliferation through repression of mitogen-activated protein kinase kinase kinase-11 (MAP3K11) [J]. Oncotarget, 2016,7(8):8756-8770.

[9] Cheng Y, Li Y, Nian Y, et al. STAT3 is involved in miR-124-mediated suppressive effects on esophageal cancer cells[J]. BMC Cancer, 2015(15):306.

[10] Zhang YH, Wang QQ, Li H, et al. miR-124 radiosensitizes human esophageal cancer cell TE-1 by targeting CDK4[J]. Genet Mol Res, 2016,15(2):15027893.

[11] Zhao Z, Ma X, Sung D, et al. microRNA-449a functions as a tumor suppressor in neuroblastoma through inducing cell differentiation and cell cycle arrest[J]. RNA Biol, 2015,12(5):538-554.

[12] Hu J, Fang Y, Cao Y, et al. miR-449a Regulates proliferation and chemosensitivity to cisplatin by targeting cyclin D1 and BCL2 in SGC7901 cells[J]. Dig Dis Sci, 2014,59(2):336-345.

[13] Miles WO, Tschop K, Herr A, et al. Pumilio facilitates miRNA regulation of the E2F3 oncogene[J]. Genes Dev, 2012,26(4):356-368.

[14] Dong D, Gong Y, Zhang D, et al. miR-874 suppresses the proliferation and metastasis of osteosarcoma by targeting E2F3[J]. Tumour Biol, 2016,37(5):6447-6455.

[15] Gao Y, Li H, Ma X, et al. E2F3 upregulation promotes tumor malignancy through the transcriptional activation of HIF-2a in clear cell renal cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2016,43(12):501-503.

[16] Sun C, Li S, Zhang F, et al. Long non-coding RNA NEAT1 promotes non-small cell lung cancer progression through regulation of miR-377-3p-E2F3 pathway[J]. Oncotarget, 2016,7(32):51784-51814.

[17] Trikha P, Sharma N, Pena C, et al. E2f3 in tumor macrophages promotes lung metastasis[J]. Oncogene, 2016,35(28):3636-3646.

[18] Lee JM, Heo MJ, Lee CG, et al. Increase of miR-199a-5p by protoporphyrin Ⅸ, a photocatalyzer, directly inhibits E2F3, sensitizing mesenchymal tumor cells to anti-cancer agents[J]. Oncotarget, 2015,6(6):3918-3931.

Effects of miR-449a on proliferation, migration and invasion of esophageal squamous-cell carcinoma cell line Eca-109

WANGQangqiang1,WANGMengjie,ZHANGYuhong,LIHao,GAOFei,LIUYangchen

(1BengbuMedicalCollege,Bengbu233000,China)

Objective To investigate the effects of miR-449a on cell proliferation, migration and invasion of esophageal squamous-cell carcinoma cell line Eca-109 and its mechanism. Methods Eca-109 cells were divided into the miR-449a group and the negative control (NC) group, in which miR-449a mimics and NC-mimics were transfected into Eca-109 cells, respectively. Real-time fluorescent quantitative PCR was performed to detect the relative expression of miR-449a in Eca-109 cells. When the expression of miR-449a in Eca-109 cells of the miR-449a group was higher than that of the NC group, indicating Eca-109 cell models with up-regulated miR-449a expression were successfully established. The cell proliferation abilities of the two groups were analyzed by CCK-8 and colony formation assay, which were shown in OD values and cell survival numbers at 12, 24 and 48 h. The cell migration and invasion was measured by Scratch test and Transwell invasion testing system, respectively. Additionally, flow cytometry was performed to detect cell cycle. Real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting were performed to detect the expression of E2F3 mRNA and protein in the two groups. Results At 12, 24 and 48 h, the OD value, the number of survival cells, distance between cells and the number of cells invading into the lower chamber of the miR-449a group were lower than those in the NC group (P<0.05 orP<0.01). The percentage of cells in G1phase of the miR-449a group was higher than that in the NC group, and the percentage of cells in S phase was lower than that of the NC group (allP<0.05). However, there was no significant difference in the percentage of cells in G2/M phase between the two groups (P>0.05). The relative expression of E2F3 mRNA and protein in the miR-449a group was lower than that in the NC group (allP<0.01). Conclusion miR-449a can inhibit the proliferation, migration and invasion of esophageal squamous-cell carcinoma cell line Eca-109 by inhibiting the expression of target gene E2F3.

esophageal squamous-cell carcinoma; microRNA-449a; E2F3 gene; cell proliferation; cell migration; cell invasion

江蘇省“333工程”科研項目(BRA2015225)。

王強強(1989-),男，住院醫(yī)師，研究方向為消化系統(tǒng)腫瘤臨床與基礎。E-mail: wangqiangqiang89@163.com

劉陽晨(1969-)，男，主任醫(yī)師、碩士生導師，研究方向為腫瘤綜合治療。E-mail: liuyctx@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.007

R735.1

A

1002-266X(2017)16-0024-04

2016-11-29)