王菁，吳高義

臨床醫(yī)學(xué)

低強(qiáng)度脈沖電磁場對鈦種植體表面成骨細(xì)胞增殖的影響

王菁，吳高義

目的通過研究不同參數(shù)的低強(qiáng)度脈沖電磁場（pulsed electromagnetic fields，PEMF）對3種不同的形貌鈦片表面成骨細(xì)胞活性的影響。方法通過機(jī)械拋光、酸蝕噴砂、陽極氧化的方法制備光滑、微米、納米3種純鈦表面結(jié)構(gòu)，而后將其置于0.1 mT，0.5 mT，1 mT和5 mT的脈沖強(qiáng)度和1 Hz和15 Hz的脈沖功率通過不同組合，檢測低強(qiáng)度脈沖電磁場作用下光滑、微米、納米3種表面的成骨細(xì)胞增殖情況。結(jié)果掃描電子顯微鏡顯示機(jī)械拋光組形成了光滑表面、酸蝕噴砂組形成了微米表面和陽極氧化組形成了納米表面。MTT法檢測低強(qiáng)度脈沖電磁場能有效促進(jìn)鈦表面的成骨細(xì)胞的增殖，其中1 mT、15 Hz的組合對光滑、微米、納米表面促成骨細(xì)胞增殖的作用最為顯著。結(jié)論低強(qiáng)度脈沖電磁場能有效促進(jìn)種植體表面成骨細(xì)胞活性。

脈沖電磁場；參數(shù)；鈦種植體；成骨細(xì)胞

低強(qiáng)度脈沖電磁場（PEMF）作為一種非接觸式的物理治療手段，其具有非電離屬性，治療過程不產(chǎn)熱［1］。目前FDI推薦PEMF應(yīng)用在多種難治的骨組織軟骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)相關(guān)疾病，特別是對于骨不連、骨折后愈合緩慢、骨質(zhì)疏松病例骨折愈合等作為一種有效促進(jìn)人體骨軟骨相關(guān)疾病的手段推薦應(yīng)；PEMF的應(yīng)用能促進(jìn)骨組織、軟骨組織愈合、減輕疼痛和炎癥反應(yīng)，是一種臨床重要的輔助療法［2］。動物實驗證明PEMF應(yīng)用于鈦種植體可顯著提高種植體骨結(jié)合率［3］，然而PEMF能否促進(jìn)鈦種植體表面成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為，以及對不同形貌的鈦種植體的最優(yōu)參數(shù)的研究尚未見報道。該研究通過表面改性技術(shù)制備3種具有代表性的鈦種植體表面，研究PEMF能否促進(jìn)成骨細(xì)胞在鈦種植體表面增殖以及對PEMF作用于不同形貌鈦材料表面成骨細(xì)胞的脈沖強(qiáng)度、頻率等各項參數(shù)進(jìn)行篩選。

1 資料與方法

1.1 材料與設(shè)備純鈦（PT TA2，西北有色金屬研究院）；SD大鼠乳鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心）；低糖DMEM培養(yǎng)液（Hyclone）；胎牛血清（Gibco）；Ⅰ型膠原酶（1%，Sigma）；胰蛋白酶（0.25%，Beyotime）；茜素紅S（Sigma）；陽極氧化系統(tǒng)（西安工業(yè)大學(xué)）；酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 試件分組及制備線切割純鈦試件而后用SiC砂紙按順序打磨1500目，使用拋光砂紙高度拋光。將試件置于丙酮溶液、無水乙醇溶液以及去離子水溶液中依次震蕩超聲15 min，干燥。試件分三組（1）機(jī)械拋光組；（2）酸蝕噴砂組：大顆粒氧化鋁Al2O3以垂直方式距離20 cm進(jìn)行試件表面噴砂，時間30 s，而后震蕩清洗置于雙酸蝕液（180 ml/L HCl：490 ml/L H2SO4=1∶1）30 min，雙蒸水清洗；（3）陽極氧化組：使用陽極氧化設(shè)備，鈦試件為陽極、鉑片作為陰極，在0.5 wt%HF的電解液中行陽極氧化處理，雙蒸水清洗后干燥備用。

1.2.2 成骨細(xì)胞分離與鑒定戊巴比妥鈉腹腔注射后，將SD大鼠的乳鼠顱頂骨仔細(xì)分離，取出纖維結(jié)締組織，而后將其剪成約0.5 mm×0.5 mm左右的組織小塊。使用混合消化液（0.25%胰蛋白酶和1%Ⅰ型膠原酶按1∶1）消化后加入培養(yǎng)液終止消化，接種于平皿中。待第一代細(xì)胞鋪滿平皿80%以上傳代，并使用差速貼壁法分離純化。進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)和ALP染色。

1.2.3 PEMF裝置及分組使用第四軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系制作的低強(qiáng)度脈沖電磁設(shè)備發(fā)生器進(jìn)行試驗。目前FDI選用5 Hz和1 Hz作為臨床常用安全有效的頻率（人體），而強(qiáng)度則使用前期預(yù)實驗篩選出的0.1 mT、0.5 mT、1 mT和5 mT。分組交叉刺激，刺激時間為1次/d，2 h/次。

1.2.4 MTT法測定材料表面細(xì)胞增殖將制備好的3組材料進(jìn)行紫外照射消毒，將其放置于24孔板中，使用傳代后的成骨細(xì)胞接于其上，接種密度為2×104個/ml，加液量為每孔1 ml。圖1顯示了24孔放入產(chǎn)生電磁裝置的線圈中。將24孔板置于細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)24 h后，按1.2.3的分組加載PEMF刺激，檢測1 d、4 d和7 d時材料表面的細(xì)胞增殖情況。

圖1 線圈內(nèi)部電磁場分布示意圖（24孔板放置于線圈內(nèi)部）

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定圖2顯示經(jīng)消化后接種的成骨細(xì)胞在3 d及7 d后的形態(tài)（圖2），從圖中可以看出細(xì)胞呈現(xiàn)多角形、長梭形等不規(guī)則形態(tài)，在7 d后鋪滿瓶底約80%。圖3示培養(yǎng)7 d后，ALP染色可見細(xì)胞內(nèi)明顯的點狀深染顆粒，細(xì)胞匯集中心染色后形成黑色結(jié)節(jié)。放大觀察可見深染顆粒主要集中于胞質(zhì)內(nèi)，且隨培養(yǎng)時間的延長而加深。圖4示培養(yǎng)14 d后的成骨細(xì)胞形成了數(shù)量較多的鈣結(jié)節(jié)，細(xì)胞聚集成簇現(xiàn)象明顯，細(xì)胞外深染的分泌顆粒數(shù)量亦有所增多。

圖2 原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞（×100）

圖3 第三代成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色7d

圖4 第三代成骨細(xì)胞茜素紅染色14 d

2.2 PEMF促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖PEMF能顯著促進(jìn)Flat、Micro、Nano表面成骨細(xì)胞增殖，如圖5所示。其中Flat組和Micro組均可見T2（15 Hz，0.5 mT)、T3（15Hz，1 mT)、T6（1 Hz，0.5 mT)、T7（1 Hz，1 mT)組細(xì)胞的增殖情況與T0組相比變快。T3組的15 Hz，1 mT優(yōu)于其余參數(shù)。與其他材料表面不同，Nano各組參數(shù)均顯示優(yōu)于T0組，其中T3和T2組優(yōu)于其余參數(shù)。

圖5 不同參數(shù)PEMF對三種鈦表面形貌成骨細(xì)胞增殖的影響

3 討論

近年來，眾多研究表明種植體表面理化特性是決定種植體成功率的決定因素［4］。目前純鈦是應(yīng)用最為廣泛的種植材料，取得了良好的成功率，然而純鈦的表面耐摩擦系數(shù)較低、光滑純鈦并不能引發(fā)良好的骨整合［5］。材料表面結(jié)構(gòu)、中心結(jié)構(gòu)、地形學(xué)特征對于成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、破骨細(xì)胞等生物行為有著不同程度的影響。

“窗口效應(yīng)”是電磁場作用于細(xì)胞和組織的特殊生物學(xué)現(xiàn)象，即對于不同的組織種類、不同的細(xì)胞，電磁場最優(yōu)影響區(qū)間有著明顯差異［6］。文獻(xiàn)報道1 Hz和15 Hz是有效促進(jìn)人體骨組織生成的頻率參數(shù)［7］。5 mT，1 mT，0.5 mT和0.1 mT四組強(qiáng)度參數(shù)是前期預(yù)實驗培養(yǎng)成骨細(xì)胞確定的梯度參數(shù)。然而，與培養(yǎng)板表面不同，細(xì)胞黏附的基底材料是四級pure titanium，這種材料在空氣中表面會形成一層特有的二氧化鈦涂層［8］。電磁場對三種材料表面成骨細(xì)胞不同的生物效應(yīng)可能與三種材料不同的二氧化鈦分布所導(dǎo)致的電勢梯度不同所導(dǎo)致，與平面二氧化鈦相比，管狀二氧化鈦結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生更為明顯電勢差，電磁場作用其上時會產(chǎn)生明顯的電流相，從而導(dǎo)致材料極化進(jìn)而對其上的成骨細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生影響。

低強(qiáng)度脈沖電磁場促進(jìn)骨細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制尚不明確，目前有研究表明Wnt通路、BMP/ Smad通路在其中扮演著重要角色。然而電信號如何轉(zhuǎn)換成生物學(xué)信號？筆者推測，一方面電磁效應(yīng)促進(jìn)材料表明電勢分布改變，另一方面電磁效應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞極化，使得細(xì)胞膜表面受體極化，從而引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，這種“瀑布式反應(yīng)”引起多條通路被激活，信號通路的激活使得相關(guān)基因蛋白表達(dá)改變從而引發(fā)一系列生物反應(yīng)。然而這些推測需要進(jìn)一步實驗驗證。綜上，PEMF對以上鈦種植體表面成骨細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，不同形貌的材料表面成骨細(xì)胞的電磁效應(yīng)窗口也存在差異。

［1］Wuschech H，van Hehn U，Mikus E，et al.Effects of PEMF on patients with osteoarthritis：Results of a prospective，placebocontrolled，double-blind study［J］.Bioelectromagnetics，2015，36（5）：576-585.

［2］Tan L，Ren Y，van Kooten TG，et al.Low-intensity pulsed ultrasound（LIPUS）andpulsedelectromagneticfield（PEMF）treatments affect degeneration of cultured articular cartilage explants［J］.Int Orthop，2015，39（5）：549-557.

［3］Rosso F，Bonasia DE，Marmotti A，et al.Mechanical stimulation（pulsed electromagnetic fields"PEMF"and extracorporeal shock wave therapy"ESWT"）and tendon regeneration：A possible alternative［J］.Front Aging Neurosci，2015，7（2）：211.

［4］Lee JK，Choi DS，Jang I，et al.Improved osseointegration of dental titanium implants by TiO2nanotube arrays with recombinant human bone morphogenetic protein-2：a pilot in vivo study［J］. Int J Nanomedicine，2015，10（10）：1145-1154.

［5］Zhou R，Wei D，Yang H，et al.Osseointegration of bioactive microarc oxidized amorphous phase/TiO2nanocrystals composited coatings on titanium after implantation into rabbit tibia［J］.J Mater Sci Mater Med，2014，25（12）：1307-1318.

［6］Falone S，Marchesi N，Osera C，et al.Pulsed electromagnetic field（PEMF）prevents pro-oxidant effects of H2O2in SK-NBE（2）human neuroblastoma cells［J］.Int J Radiat Biol，2016，92（3）：281-286.

［7］Pieber K，Schuhfried O，F(xiàn)ialka-Moser V.［pulsed electromagnetic fields（PEMF）：results in evidence based medicine］［J］.Wien Med Wochenschr，2007，157（1）：34-36.

［8］Mugnolo G，F(xiàn)illiponi H.Osseointegration of tissue functional rough TiO2-blasted titanium implants：one-year follow-up of 100 implants［J］.Dent Implantol Update，2001，12（2）：9-15.

［2016－12－16收稿，2017－01－14修回］［本文編輯：宋敏］

The effect of low-intensity pulsed electromagnetic field on the osteoblast proliferation of titanium- implant surfaces with different topographies

WANG Jing，WU Gao-yi.Department of Stomatology，the General Hospital of Jinan Military Region，Jinan，Shandong 250031，China

ObjectiveTo compare variouse parameters of pulsed electromagnetic fields（PEMF）on the osteoblast proliferation of pure titanium with different coating.MethodsA polished surface（Flat），a SLA surface（Micro），and an anodized surface（Nano）were prepared using modified technology.The titanium dics with three representative topographies were respectively placed into 1 and 15 Hz frequency parameters and 0.1，0.5，1 and 5 mt intensity parameters.MTT assay was used to investigate the osteoblast activity.Resultsthree representative titanium surface topographies were successfully prepared namely Flat，Micro，and Nano.MTT assay showed the proliferation of osteoblast bioactivity on titanium surfaces can be hagely enhanced by PEMF.The osteoblast proliferationdisplayedthepositivepromotionwiththeparametersof15Hz，1mtonallthethreesurfaces. ConclusionPEMF can improve the osteoblast proliferation on titanium surfaces and the optimal parameter was obtained by screening.

PEMF；Parameter；Titanium implant；Osteoblast

R783.6

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.06.005

250031山東濟(jì)南，原濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院口腔科（王菁，吳高義）