于雷，饒春明

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

生物技術(shù)藥物生物學(xué)活性測定方法研究進(jìn)展

于雷，饒春明

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

生物技術(shù)藥物的活性測定在質(zhì)量控制中至關(guān)重要。目前的生物活性分析方法主要包括體內(nèi)（動物）和體外（細(xì)胞）實驗?；诩?xì)胞的活性測定方法由于其具有操作簡便、周期短、成本低、高通量、變異度小等優(yōu)點，正廣泛地替代動物實驗。為了獲得強反應(yīng)性的細(xì)胞系和簡便易行的檢測方法，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系成為較好的選擇。本綜述主要論述了生物技術(shù)藥物活性測定方法的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢，概括了基于細(xì)胞系的活性測定方法的種類和檢測方法，以及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的應(yīng)用進(jìn)展。

生物學(xué)活性測定；動物實驗；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；報告基因法

生物技術(shù)藥物，如細(xì)胞因子、激素、單抗和其他重組蛋白類藥物，是一類快速增長的藥物，正越來越廣泛地應(yīng)用于臨床。由于生物技術(shù)藥物的分子異質(zhì)性，其理化特性較小分子化合物復(fù)雜，在質(zhì)量控制中不僅要檢定其理化性質(zhì)，還要對其生物學(xué)活性進(jìn)行檢測[1-2]。生物活性測定是測定藥物對機體的生物學(xué)效應(yīng)，在新藥開發(fā)和藥物質(zhì)量控制中發(fā)揮重要作用。

早期的生物活性測定主要依賴于動物實驗，通過檢測藥物對實驗動物的藥效反應(yīng)來反映其生物學(xué)活性。動物模型是最能夠真實有效反映藥物臨床藥理效用的方式，但是它存在著一些缺點：定量難，動物個體差異大，動物飼養(yǎng)成本高，實驗周期長，操作繁瑣，倫理學(xué)問題等。體外組織分離實驗縮短了動物實驗的周期，定量相對比較準(zhǔn)確，但是仍不能克服其他缺點。而細(xì)胞實驗不僅操作方便、定量準(zhǔn)確、變異度小，且成本低，正廣泛應(yīng)用于藥物的活性測定領(lǐng)域。隨著分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)和信號通路研究的發(fā)展，基于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的生物活性測定方法越來越受到人們的關(guān)注。表1概括了生物活性分析方法及其特點，下面對各類方法進(jìn)行分別討論。

1 體內(nèi)動物實驗

動物實驗是通過檢測藥物對實驗動物的藥效作用來反映其生物學(xué)活性。早期的生物活性測定主要依賴于動物實驗，目前多數(shù)被細(xì)胞實驗代替。對于一些作用機制復(fù)雜的藥物，目前仍需要借助于動物實驗。例如，促紅細(xì)胞生成素（EPO）是多糖蛋白，糖鏈結(jié)構(gòu)決定了體內(nèi)半衰期，后者與其藥效作用密切相關(guān)，因此體外法不能完全替代體內(nèi)法來反映其藥效作用，EPO的生物學(xué)活性測定方法仍主要依賴于體內(nèi)實驗——網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)法。具體做法是給小鼠皮下注射EPO后，其網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量隨EPO劑量的增加而升高，利用網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)對紅細(xì)胞數(shù)的比值變化，通過劑量反應(yīng)平行線法檢測EPO體內(nèi)生物學(xué)活性。內(nèi)皮抑素具有抑制腫瘤血管形成的作用，但具體作用機制比較復(fù)雜，目前主要通過檢測其對荷瘤小鼠動物模型腫瘤生長的抑制能力進(jìn)行活性測定。還有一些藥物，盡管已有研究報道了基于細(xì)胞系的測活方法，尚未進(jìn)行全面的適用性研究，其常規(guī)測定仍然借助于動物實驗，例如，重組人骨形成蛋白2（小鼠體內(nèi)異位成骨試驗）[3-4]、重組人生長激素（去垂體大鼠體重法/去垂體大鼠脛骨法）、重組人胰島素（小鼠血糖測定法）。

2 體外組織實驗

體外組織實驗縮短了動物實驗周期，定量相對準(zhǔn)確，但仍依賴于實驗動物，不能克服動物個體差異帶來的變異度大等缺點，目前基本被細(xì)胞實驗所替代。例如，B型利鈉肽（BNP）的早期測活方法為家兔主動脈法，具體做法是分離兔主動脈條，加入一定濃度的腎上腺素刺激其收縮，再檢測rhBNP作用后動脈條的張力變化來反映其生物學(xué)活性[5]。該方法操作復(fù)雜，且變異度大，目前已被細(xì)胞法代替[6-7]。神經(jīng)生長因子（NGF）的早期測活方法為雞胚背根神經(jīng)節(jié)法，通過檢測NGF對分離培養(yǎng)的雞胚背根神經(jīng)節(jié)的促生長作用來測定其活性，近年也被TF1細(xì)胞增殖法代替[8-10]。

3 基于細(xì)胞系的生物活性分析方法

隨著藥物高通量篩選平臺的建立和生產(chǎn)規(guī)模的擴大，依賴于實驗動物的活性分析方法已經(jīng)不能滿足需求。而基于細(xì)胞系的生物活性分析方法由于其高通量、高效率、高精確度等優(yōu)勢，越來越受到研究者和生產(chǎn)商的青睞[2,11-15]。雖然單一的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)能否完全代替動物實驗來評價藥物的生物學(xué)活性至今仍是比較有爭議的話題，但是從目前的發(fā)展趨勢來看，細(xì)胞實驗正越來越多地取代動物實驗。一般生物藥物如細(xì)胞因子的作用機制是結(jié)合并激活其特異性受體，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞，最終發(fā)揮細(xì)胞學(xué)效應(yīng)。目前基于細(xì)胞系的生物學(xué)活性測定方法正是基于藥物的作用機制。從檢測的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)來看，目前主要有以下4種類型。

3.1 上游效應(yīng)

主要檢測特異受體的激活程度。多數(shù)細(xì)胞因子類藥物的受體都是磷酸化受體，被配體激活后會發(fā)生磷酸化，通過檢測受體的磷酸化程度來測定藥物激活其受體的能力，間接反映藥物的生物學(xué)活性[16]。這種方法變異度低，且耗時短，但是需要抗磷酸化受體的特異性抗體，使其應(yīng)用受到限制。

3.2 中間效應(yīng)

主要檢測信號分子的濃度。信號分子包括cAMP、cGMP、Ca2+等，在藥物作用的信號傳遞中發(fā)揮重要作用，其濃度的升高或降低間接反映了藥物的生物學(xué)活性，但信號分子的檢測需要特定的檢測試劑盒。

3.3 下游效應(yīng)

主要檢測下游基因表達(dá)的激活或抑制。例如IL-12可以刺激外周血淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，通過測定IFN-γ的分泌量來反映其活性[17]。

3.4 表型效應(yīng)

檢測藥物對細(xì)胞的整體效應(yīng)，如增殖、凋亡、遷移等，是最常用的檢測方法。很多生長因子的活性測定是通過其對靶細(xì)胞的促增殖作用來實現(xiàn)的，例如表皮生長因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）。而某些腫瘤殺傷性藥物是通過其對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用來測定其生物學(xué)活性的，例如腫瘤壞死因子（TNF）。

表1 生物活性分析方法

4 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在生物活性測定中的應(yīng)用

由于很多生物技術(shù)藥物沒有強反應(yīng)性的細(xì)胞系，或者沒有易檢測的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞系成了很好的選擇。構(gòu)建藥物反應(yīng)性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系是依據(jù)藥物的作用機制來制定方案的。首先應(yīng)該全面深入地研究藥物的作用機制，包括受體激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號傳遞及終效應(yīng)，選擇合適的靶標(biāo)作為藥物活性測定的指標(biāo)。報告基因法[13]是目前比較常見的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系活性測定方法，該方法的原理是：藥物作用于細(xì)胞后，通過信號通路最終激活或失活特定的轉(zhuǎn)錄因子，從而引起某些基因的表達(dá)提高或降低。將轉(zhuǎn)錄因子的特定DNA反應(yīng)元件插入報告基因的啟動子區(qū)，并導(dǎo)入藥物反應(yīng)性細(xì)胞，通過檢測藥物作用后報告基因表達(dá)的變化來測定藥物的生物學(xué)活性[2]。除了報告基因法，還有多種改造細(xì)胞系應(yīng)用于活性測定。從目前文獻(xiàn)報道來看，根據(jù)細(xì)胞改造方式的不同，主要分為以下幾類：

4.1 只導(dǎo)入報告基因

對于某些有強反應(yīng)性細(xì)胞系，且能夠強激活或失活轉(zhuǎn)錄因子的藥物，僅僅需要轉(zhuǎn)入報告基因便可滿足檢測需求[18-19]。如IFN與其受體結(jié)合后可以引起轉(zhuǎn)錄因子stat3/stat5激活，后者作用于干擾素反應(yīng)元件ISRE，激活下游基因的表達(dá)。本科室前期與加拿大衛(wèi)生部合作建立了干擾素報告基因測活方法，向293細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入ISRE螢光素酶報告基因，可以有效地進(jìn)行IFN活性測定，該方法現(xiàn)已收入2015版《中國藥典》（三部），作為干擾素活性測定第二法[18]。

4.2 只導(dǎo)入天然受體

對于某些藥物沒有強反應(yīng)性的細(xì)胞系，需要轉(zhuǎn)入天然受體，增強細(xì)胞對該藥物的反應(yīng)性。如本科室前期建立了一種BNP測活新方法：將天然受體GCA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，構(gòu)建GCA超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，該細(xì)胞在受到rhBNP刺激后，分泌至細(xì)胞上清的cGMP水平增加，然后通過競爭ELISA法檢測cGMP的變化來測定rhBNP的生物學(xué)活性[6-7]。

4.3 導(dǎo)入天然受體和報告基因

某些藥物既沒有強反應(yīng)性細(xì)胞系，又沒有易檢測的細(xì)胞效應(yīng)，但是信號通路明確，可以激活特定的DNA反應(yīng)元件。這種情況可以通過同時導(dǎo)入其天然受體和報告基因來解決[12]。本科室前期將促胰島素分泌肽天然受體（GLP-1R）和cAMP螢光素酶報告基因同時導(dǎo)入CHO-K1細(xì)胞，建立了促胰島素分泌肽融合蛋白的報告基因測活方法，成功應(yīng)用于該類品種的活性測定[20-21]。

4.4 導(dǎo)入融合受體

對于某些沒有易檢測的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)的藥物，可以通過導(dǎo)入融合受體來檢測其生物學(xué)活性。例如，B細(xì)胞活化因子（BAFF）受體的胞外區(qū)與TRAIL-R-2的胞內(nèi)區(qū)融合，導(dǎo)入橫紋肌肉瘤細(xì)胞，改造的細(xì)胞系經(jīng) BAFF刺激后，可激活TRAIL-R-2胞內(nèi)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域，引起細(xì)胞死亡，用來檢測BAFF的生物學(xué)活性[22]。

4.5 導(dǎo)入融合受體和報告基因

例如血管內(nèi)皮生長因子抑制劑的活性測定方法，向293細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入融合受體VEGFR-IL-8R和NF-κB報告基因，VEGFR-IL-8R由VEGFR的胞外區(qū)和IL-8R的胞內(nèi)區(qū)組成，VEGF與之結(jié)合后可激活I(lǐng)L-8R的胞內(nèi)區(qū)，經(jīng)過IL-8的信號傳遞過程激活NF-κB報告基因，通過測定血管內(nèi)皮生長因子抑制劑抑制VEGF激活報告基因的能力來反映其生物學(xué)活性[23]。

5 生化分析方法

除了動物實驗和細(xì)胞實驗，目前還出現(xiàn)了不依賴細(xì)胞的生化分析方法，包括免疫分析和受體結(jié)合分析[2]等，某些單抗制品可以通過ELISA來測定其與抗原的結(jié)合活性來間接反映其生物學(xué)活性，如VEGF單抗[3]。但是這種單一的結(jié)合能力能否代表生物學(xué)活性仍存在爭議，通常還須結(jié)合其他細(xì)胞實驗或動物實驗來驗證其適用性。

6 結(jié)語

分子生物學(xué)的快速發(fā)展和細(xì)胞信號通路的深入研究，促進(jìn)了基于細(xì)胞系的生物活性測定方法的發(fā)展。從目前的發(fā)展趨勢來看，如何尋求一種最有效反映藥物生物學(xué)活性的細(xì)胞實驗來替代動物實驗，已經(jīng)成為生物藥物質(zhì)量控制工作中的重要環(huán)節(jié)。而細(xì)胞實驗的方法驗證需要結(jié)合動物實驗來進(jìn)行適用性研究，只有能夠真實可靠地反映藥效作用的實驗方法才能應(yīng)用于藥物的活性測定。

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Research Progress in Bioassay of Biotech Drugs

YU Lei,RAO Chun-Ming*

National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China

*Corresponding author,E-mail:raocm@nifdc.org.cn

The bioassay is essential in quality control of biological therapeutics.Classical bioassay includes animal test and cell test.Cell-based bioassay is replacing animal test,because of its advantages,such as simple operation,short processing cycle,low cost,high flux,and small variation.To obtain strong-responsive cell line and easy-operating analytical method,constructing modified cell line is a good choice.This review mainly discussed the situation and trend of biological therapeutics bioassay,and generalized types and methods of cell-based bioassay,and application of modified cell lines.

bioassay;animal test;modified cell line;report gene assay

Q78

A

1009-0002（2017）03-0392-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.030

2017-04-21

于雷（1984-），女，助理研究員，（E-mail）yulei@nifdc.org.cn

饒春明，（E-mail）raocm@nifdc.org.cn