高凱麗，李維娜，薛曉暢，張存，郝強，張偉，張英起

1．腫瘤生物學(xué)國家重點實驗室；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室；陜西 西安 710032

T7噬菌體展示人肝癌cDNA文庫篩選人CD8+T淋巴細(xì)胞特異結(jié)合分子

高凱麗1,2，李維娜1,2，薛曉暢1,2，張存1,2，郝強1,2，張偉1,2，張英起1,2

1．腫瘤生物學(xué)國家重點實驗室；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室；陜西 西安 710032

目的：利用噬菌體表面展示技術(shù)從人肝癌T7 cDNA文庫中篩選出能與人CD8+T淋巴細(xì)胞特異結(jié)合的蛋白分子。方法：以人CD8+T淋巴細(xì)胞為篩選靶標(biāo)，對人肝癌T7 cDNA噬菌體肽庫進(jìn)行4輪“吸附-洗脫-擴增”生物淘選與富集，ELISA鑒定特異結(jié)合的噬菌體單克?。粚Λ@得的陽性克隆裂解液進(jìn)行PCR擴增及DNA測序，然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定所編碼的結(jié)合蛋白。結(jié)果：經(jīng)過4輪篩選，結(jié)合人CD8+T淋巴細(xì)胞的噬菌體克隆得到富集，通過測序與同源性比對分析獲得17個特異性結(jié)合的多肽序列；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)陽性噬菌體克隆的同源蛋白中，可能與肝癌免疫逃逸相關(guān)的分子有Unc-51樣自噬活化激酶1（ULK1）、一般受體磷酸肌醇相關(guān)支架蛋白1（GRASP）、中間α球蛋白抑制因子H1（ITIH1）、富含亮氨酸重復(fù)8家族成員D（LRRC8D）和CD164等。結(jié)論：從人肝癌T7 cDNA噬菌體肽庫中篩選獲得了能與人CD8+T淋巴細(xì)胞特異結(jié)合的分子，為闡明人肝癌發(fā)生發(fā)展過程中腫瘤免疫逃逸相關(guān)機制奠定了基礎(chǔ)。

噬菌體展示技術(shù)；肝癌；CD8+T淋巴細(xì)胞；結(jié)合分子

惡性腫瘤嚴(yán)重危害著人類的健康和生命，已成為人類的重要死因。腫瘤免疫治療是腫瘤治療的一個有前景的新方向，其目的是激發(fā)或調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞。CD8+T淋巴細(xì)胞是機體免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，也是主要的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞亞群[1]，在機體抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2]，可通過釋放穿孔素和顆粒酶，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。

近年來針對腫瘤免疫的機制研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者體內(nèi)存在免疫抑制機制[3]，使腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞的表型及功能發(fā)生改變，突出表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞處于抑制狀態(tài)、免疫學(xué)活性降低、增殖能力減弱，導(dǎo)致機體免疫應(yīng)答低下，從而妨礙機體對腫瘤的清除[4]。腫瘤微環(huán)境中CD8+T淋巴細(xì)胞功能受到抑制的現(xiàn)象已被廣泛關(guān)注，但腫瘤究竟通過何種機制影響CD8+T淋巴細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答仍不清楚。

噬菌體表面展示技術(shù)常用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。T7噬菌體展示肽庫的特點是通過把外源基因序列插入編碼T7噬菌體包膜蛋白的基因，使外源基因編碼的多肽與噬菌體包膜蛋白融合表達(dá)，并展示在噬菌體表面。通過親和篩選，能夠特異性地富集和篩選出含有目的多肽的噬菌體重組子，進(jìn)一步獲取其插入的編碼核苷酸序列，從而從cDNA展示文庫中分析鑒定出相互作用蛋白[5]。為了系統(tǒng)篩選肝癌細(xì)胞所表達(dá)的影響CD8+T淋巴細(xì)胞功能的腫瘤細(xì)胞相關(guān)分子，我們通過噬菌體表面展示這一高通量篩選技術(shù)，從人肝癌cDNA噬菌體展示肽庫中篩選CD8+T淋巴細(xì)的相互作用分子，為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞相互作用從而引起腫瘤免疫微環(huán)境改變及免疫逃逸的新機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌T7 cDNA噬菌體展示文庫、T7噬菌體宿主菌大腸桿菌BLT5403（Novagen公司）；人淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；MACS人CD8微珠（Mitenyi Biotec公司）；FITC-抗人CD3單克隆抗體、APC-抗人CD8單克隆抗體（BD Pharmingen公司）；RPMI1640培養(yǎng)基與小牛血清（Gibco公司）；瓊脂糖（博大科技公司）；TaqDNA聚合酶（Promega公司）；DNA提取試劑盒（TaKaRa公司）；T7重組噬菌體中插入片段引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，上游引物序列為5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'，下游引物序列為5'-AACCCCTCAAGACCCGTT TA-3'。

1.2 人外周血CD8+T淋巴細(xì)胞的分選與體外培養(yǎng)

從第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院血庫領(lǐng)取健康志愿者外周血白膜，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，吸取中間云霧狀細(xì)胞層獲得外周血單個核細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)后用美天旎公司磁珠分選試劑盒分離CD8+T淋巴細(xì)胞。

1.3 CD8+T淋巴細(xì)胞的表型鑒定

收集磁珠分選的CD8+T細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度后加入離心管，每管1×106細(xì)胞。分別加入CD3、CD8單抗，4℃孵育30 min，流式細(xì)胞洗液洗滌固定后行流式細(xì)胞儀分析。

1.4 原始文庫滴度測定

將大腸桿菌BLT5403接種于LB培養(yǎng)液，37℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期；用氣溶膠阻隔槍頭取10μL噬菌體文庫溶液，以LB培養(yǎng)液進(jìn)行1/10梯度稀釋，各梯度稀釋產(chǎn)物各取100μL，加至含250μL BLT5403菌液的試管中，快速渦旋混勻，室溫孵育5 min，加人3 mL 45℃頂層瓊脂糖凝膠中混勻，傾至預(yù)熱的LB培養(yǎng)板，37℃倒置培養(yǎng)；當(dāng)噬菌斑長至1～2 mm時，計數(shù)平板上的噬菌斑生成數(shù)目，按下式計算噬菌體滴度：滴度=∑（各平板的噬菌斑個數(shù)×該平板的稀釋率×10）/平板數(shù)。

1.5 人肝癌T7 cDNA噬菌體肽庫親和篩選

計數(shù)1×106個CD8+T淋巴細(xì)胞，加入含2% BSA的DPBS，室溫條件下封閉2 h；TBS洗滌后加入10μL人肝癌T7 cDNA噬菌體肽庫，孵育30 min；TBST洗滌去除非特異性結(jié)合的噬菌體，加入濃度為1%的SDS緩沖液200μL，振蕩15 min進(jìn)行特異性結(jié)合噬菌體洗脫，離心取50μL洗脫上清，加入BLT5403菌液中，37℃、200 r/min擴增至菌液澄清；分別對未擴增的洗脫液和擴增后噬菌體上清留樣進(jìn)行噬菌體滴度測定，進(jìn)行下一輪篩選。共重復(fù)篩選4次，獲得高度富集的噬菌體。

1.6 細(xì)胞ELISA初步鑒定特異性結(jié)合的噬菌體陽性克隆

新鮮分選的CD8+T淋巴細(xì)胞用3%脫脂奶粉于37℃封閉2 h，用封閉液稀釋細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度，按1×106/孔接種于96孔酶聯(lián)板，將噬菌體單克隆擴增上清分別加入各細(xì)胞孔及PBS孔（空白對照）中，37℃孵育1 h；TBST洗滌，1500 r/min離心15 min；加入T7 Fiber單克隆抗體，37℃孵育1 h，洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，37℃孵育0.5 h，洗滌后用鄰苯二胺底物（OPD）顯色，2 mol/L硫酸中止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定D490nm值。D490nm值高于陰性對照3倍以上為陽性克隆。

1.7 噬菌體單克隆的PCR擴增、測序

挑選40個經(jīng)細(xì)胞ELISA鑒定能特異性結(jié)合CD8+T淋巴細(xì)胞的噬菌體單克隆，分別加入宿主菌中，37℃培養(yǎng)至徹底澄清，用10 mmol/L EDTA稀釋后于65℃加熱10 min進(jìn)行裂解；以裂解液為模板，采用PCR對特異噬菌體的插入序列進(jìn)行擴增（PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min）；通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增結(jié)果，并送金斯瑞公司用 Applied Biosystems 3730-XL測序儀進(jìn)行測序。

1.8 序列分析及蛋白功能預(yù)測

對篩選富集得到的噬菌體重組子PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，通過BLASTn程序搜索NIH的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列查找[6]。利用Inter Pro Scan（http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/）及http: //www.expasy.org在線預(yù)測蛋白功能。

2 結(jié)果

2.1 CD8+T淋巴細(xì)胞的純度檢測

用免疫磁珠分選法從健康志愿者外周血白膜中獲得人CD8+T淋巴細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行純度檢測，結(jié)果如圖1，所得CD8+T淋巴細(xì)胞純度高于95%。

2.2 人肝癌cDNA文庫的4輪生物淘選

為篩選出人肝癌中能與人CD8+T淋巴細(xì)胞特異結(jié)合的分子，以CD8+T淋巴細(xì)胞為篩選靶標(biāo)，通過4輪“吸附-洗脫-擴增”生物淘選與富集，完成人肝癌T7噬菌體展示肽庫的篩選。每輪的噬菌體投入量保持一致，第4輪與第1輪相比，富集了8.4倍（富集倍數(shù)=第4輪產(chǎn)出率/第1輪產(chǎn)出率，產(chǎn)出率=產(chǎn)出的噬菌體數(shù)量/投入的噬菌體數(shù)量），結(jié)果顯示陽性噬菌體克隆有一定的有效富集（表1）。

2.3 細(xì)胞ELISA初步鑒定噬菌體陽性克隆

利用細(xì)胞ELISA對篩選后的噬菌體單克隆進(jìn)行初步鑒定，檢測其與CD8+T淋巴細(xì)胞的結(jié)合情況。隨機挑選10個第3輪篩選后的單克隆，編號為1～10；隨機挑選10個第4輪篩選后的單克隆，編號為11～20。結(jié)果如圖2，除克隆3外，其余各克隆的CD8+T淋巴細(xì)胞實驗組D值與PBS空白對照組D值之比大于3，提示它們能與CD8+T淋巴細(xì)胞較好地結(jié)合。第3輪篩選所得其余9個噬菌體克隆中有3個D值較高，第4輪篩選所得10個噬菌體克隆中有8個D值較高，說明篩選過程有良好的富集效果，4輪篩選后最終獲得的是能與CD8+T淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體陽性克隆。

圖1 人CD8+T淋巴細(xì)胞純度檢測結(jié)果

表1 噬菌體富集結(jié)果

2.4 目的基因的PCR擴增

挑選40個經(jīng)細(xì)胞ELISA鑒定能特異性結(jié)合CD8+T淋巴細(xì)胞的高親和力噬菌體單克隆，轉(zhuǎn)入宿主菌中擴增，以其裂解液為模板，用T7 Select引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示大小不等的DNA條帶。部分陽性克隆的電泳結(jié)果見圖3。

2.5 DNA序列測定與同源性比對分析

對上一步得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果經(jīng)BLASTn程序進(jìn)行同源性搜索，排除重復(fù)序列，共篩選出17個與CD8+T淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，同源性為99%～100%。經(jīng)文獻(xiàn)檢索及生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)陽性噬菌體克隆的同源蛋白中，可能與肝癌免疫逃逸相關(guān)的分子有：Unc-51樣自噬活化激酶1（ULK1）、一般受體磷酸肌醇相關(guān)支架蛋白1（GRASP）、中間α球蛋白抑制因子H1（ITIH1）、富含亮氨酸重復(fù)8家族成員D（LRRC8D）和CD164等。

3 討論

圖2 ELISA鑒定噬菌體陽性克隆與CD8+T淋巴細(xì)胞的親和力

圖3 部分陽性噬斑PCR擴增產(chǎn)物

腫瘤組織局部免疫反應(yīng)在抗腫瘤免疫過程中起重要作用，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有重要影響。近年來，以免疫調(diào)節(jié)為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療因其良好的臨床療效，得到越來越多的重視和認(rèn)可。然而研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可以通過多種機制逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控、攻擊，從而在體內(nèi)生存，繼而生長和轉(zhuǎn)移，即腫瘤的免疫逃逸。

T細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中具有關(guān)鍵作用，T細(xì)胞免疫在機體抗腫瘤過程中扮演重要角色。T淋巴細(xì)胞包括CD4+和CD8+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞具有輔助細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的作用，CD8+T細(xì)胞則是重要的效應(yīng)細(xì)胞，是抗腫瘤免疫反應(yīng)過程中最主要的效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮著核心作用。CD8+T細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，可釋放穿孔素和顆粒酶，直接殺死靶細(xì)胞，導(dǎo)致靶細(xì)胞的死亡。

近年來在對腫瘤免疫逃避的機制研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤免疫微環(huán)境可以改變腫瘤的生物學(xué)特性、篩選適應(yīng)微環(huán)境的腫瘤細(xì)胞存活，并通過分泌多種炎癥因子、生長因子等構(gòu)成免疫抑制網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞的表型發(fā)生改變，負(fù)調(diào)控其免疫活性，使其無法有效清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞；并且能促使具有抑制功能的免疫細(xì)胞在腫瘤內(nèi)部不斷蓄積，建立適宜的腫瘤微環(huán)境促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。荷瘤機體中CD8+T細(xì)胞的免疫功能障礙是調(diào)控腫瘤逃逸免疫的重要機制，是限制腫瘤免疫治療的關(guān)鍵因素。在腫瘤復(fù)雜的微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)、分泌大量分子，究竟是哪些表面分子或因子影響了CD8+T細(xì)胞的免疫功能，仍有待研究。篩選腫瘤細(xì)胞表達(dá)或分泌的能與人CD8+T淋巴細(xì)胞特異結(jié)合的分子，將有助于闡明人肝癌發(fā)生發(fā)展過程中誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞無能或功能障礙，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸的相關(guān)機制。

噬菌體展示技術(shù)是一種高效的分子相互作用篩選體系，具有庫容大、高通量、快速、簡便的特點，在生命科學(xué)理論和應(yīng)用研究中都有廣泛的應(yīng)用[7-8]。Novagen公司的T7噬菌體載體能將外源基因序列插入編碼T7噬菌體包膜蛋白的基因中，使得外源多肽或蛋白與噬菌體包膜蛋白融合表達(dá)并展示在噬菌體表面。通過3～5輪親和篩選，能夠從cDNA展示文庫中特異性地富集和擴增能與靶標(biāo)結(jié)合的噬菌體，分離和鑒定出陽性噬菌體重組子，獲取插入序列。噬菌體展示肽庫最常用的策略是以純化的特定蛋白為靶標(biāo)進(jìn)行篩選，以整體細(xì)胞為靶標(biāo)的篩選是一個新的方向，為相關(guān)研究提供了全新的思路[9]。

本課題的策略是以整個CD8+T細(xì)胞為靶標(biāo)篩選人肝癌T7 cDNA噬菌體肽庫，獲得腫瘤細(xì)胞表達(dá)的能與CD8+T細(xì)胞特異結(jié)合的多肽。經(jīng)過4輪篩選，保持一定的噬菌體投入量，回收率逐輪提高，表明陽性噬菌體克隆得到良好富集。利用細(xì)胞ELISA方法，對篩選后隨機挑選的陽性克隆進(jìn)行初步鑒定，獲得了能與CD8+T細(xì)胞特異結(jié)合的高親和力噬菌體陽性克??；進(jìn)而對高親和力克隆進(jìn)行DNA序列測定與同源性比對分析，排除重復(fù)序列，共篩選出17個與CD8+T淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中包括ULK1、GRASP、ITIH1、LRRC8D和CD164等有意義的分子。已知這些蛋白參與機體內(nèi)多種生理、生化反應(yīng)，推測可能與肝癌免疫逃逸相關(guān)。后續(xù)工作將以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探討這些分子對CD8+T細(xì)胞表型、分化發(fā)育、免疫功能、細(xì)胞毒活性等方面的影響，為闡明人肝癌發(fā)生發(fā)展過程中通過影響CD8+T淋巴細(xì)胞引起腫瘤免疫逃逸相關(guān)機制奠定基礎(chǔ)，對提升腫瘤的免疫治療效果具有潛在臨床應(yīng)用價值。

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Screening of Proteins Binding with Human CD8+T Lymphocytes with T7 Select Human Hepatoma cDNA Library

GAO Kai-Li1,2,LI Wei-Na1,2,XUE Xiao-Chang1,2, ZHANG Cun1,2,HAO Qiang1,2,ZHANG Wei1,2,ZHANG Ying-Qi1,2*

1.State Key Laboratory of Cancer Biology;2.Department of Biopharmaceutics,School of Pharmacy,Fourth Military Medical University;Xi'an 710032,China

*Corresponding author,E-mail:zhangyqh@fmmu.edu.cn

Objective:To screen human hepatoma T7 phage cDNA library for proteins binding with human CD8+T lymphocytes by using phage display technique．Methods:By using human CD8+T lymphocytes as the selective target,the T7 select human hepatoma cDNA library was biopanned for four times and positive phage clones were selected.The positive plaques were identified by ELISA and DNA sequencing.Homology analysis and bioinformatics analysis were used to investigate the function of the candidate molecules.Results:T7 phage cDNA inserts were acquired after 4 rounds of biopanning.We have obtained a series of tumor-associated molecules that can specifically bind human CD8+T lymphocytes,such as ULK1,GRASP,ITIH1,LRRC8D and CD164.Conclusion:We obtained some candidate molecules that may interact with human CD8+T lymphocytes through cDNA library phagedisplay method.The present study laid a foundation for further exploring the mechanism of the effect of cancer cells on CD8+T lymphocytes and targeted therapy for hepatoma．

phage display;hepatoma;CD8+T lymphocytes;binding molecules

R392.1;Q78

A

1009-0002（2017）03-0333-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.018

2017-01-06

國家自然科學(xué)基金（81672800，81301785，81472649）

高凱麗（1992-），女，碩士研究生，（E-mail）1325202624@qq.com

張英起，（E-mail）zhangyqh@fmmu.edu.cn