宋如昕，王蘭，張左兵

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

中華鱉gp130基因全長cDNA克隆及生物信息學(xué)分析

宋如昕，王蘭，張左兵

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

目的：從中華鱉脾臟、肝臟、腸道構(gòu)建的SMART cDNA文庫中克隆中華鱉gp130基因cDNA全長。方法：采用RACE法克隆中華鱉gp130基因全長cDNA，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果：中華鱉gp130基因cDNA全長3806 bp，對應(yīng)基因組全長73 252 bp，包含16個內(nèi)含子及17個外顯子。中華鱉gp130與鳥類、哺乳類相比均有保守的共線性關(guān)系。該基因編碼由927個氨基酸殘基構(gòu)成的序列，二級結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角，三級結(jié)構(gòu)包含配體結(jié)合、跨膜結(jié)構(gòu)域、纖維鏈接蛋白結(jié)構(gòu)域等。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示與鳥類首先聚類，其次是哺乳類，最后是兩棲類與魚類。同時以人GP130蛋白為模型構(gòu)建了中華鱉GP130蛋白的3D結(jié)構(gòu)模型，一致性為58.32%。結(jié)論：獲得了中華鱉gp130基因全長并做了生物信息學(xué)分析，為深入研究GP130及相關(guān)信號通路提供了基礎(chǔ)。

中華鱉；糖蛋白130（GP130）；cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）

JAK-STAT信號通路是近年研究較熱的一條由細(xì)胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程[1]。在此信號通路中，糖蛋白130（glycoprotein 130，GP130）［又稱白細(xì)胞介素6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（IL-6 signal transducer，IL6st）］是白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、抑瘤素 M（oncostatin-M，OSM）、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）、白細(xì)胞介素11（IL-11）等因子共用的受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[2]。GP130既可以膜型形式整合在機(jī)體的細(xì)胞膜上，又能以可溶性蛋白的形式分布于體液中，該蛋白在JAK-STAT信號通路的調(diào)控中起重要作用[3]。

有關(guān)GP130及相關(guān)信號通路的研究主要集中于哺乳動物。在腫瘤發(fā)生方面，Greten小組發(fā)現(xiàn)該基因的第757號酪氨酸至苯丙氨酸的點突變（gp130Y757F）會引起STAT3的超活化，這一位點突變的轉(zhuǎn)基因小鼠在氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉（AOM/DSS）的誘導(dǎo)下發(fā)生腸道腫瘤的比例明顯升高[4]。GP130蛋白可激活多個下游信號通路，如可磷酸化激活STAT轉(zhuǎn)錄因子，尤其是STAT3，激活的STAT3二聚體化，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄；此外，還可引起酪氨酸磷酸酶SHP2聚集并激活下游基因Ras/Erk（胞外信號調(diào)節(jié)激酶）和PI3K（磷酸肌醇3激酶）信號通路[5-6]。免疫功能方面，可參與炎癥反應(yīng)，如對過敏性哮喘患者的外周血檢測發(fā)現(xiàn)GP130異常增高[7]。IL-6/IL-6R/GP130激活STAT3的信號途徑在Th17細(xì)胞的分化過程中起重要作用，GP130信號通路在Th17的誘導(dǎo)中是必需的[8]。另外，在小鼠中的最新研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞中IL-6-GP130-STAT3信號通路在T細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟炎癥中起到一定的保護(hù)作用[9]。河豚中，IL-6可與IL-6R/GP130復(fù)合體結(jié)合，從而激活JAK-STAT3信號通路，促進(jìn)IgM的產(chǎn)生[10]，在斑馬魚的研究中也發(fā)現(xiàn)gp130轉(zhuǎn)錄在魚體發(fā)育的早期就已產(chǎn)生，且在魚體前后軸線上均能檢測到，分布較廣泛[11]。但在進(jìn)化上有重要過渡作用的爬行類中卻鮮有g(shù)p130的研究報道。中華鱉作為研究較多的爬行類物種，是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[12]，廣泛分布于長江流域及華南地區(qū)[13]。故而中華鱉gp130基因的克隆及相關(guān)分析，對研究爬行動物免疫尤其是JAK-STAT3信號通路具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用中華鱉購自河北省玉田縣中華鱉良種場。于實驗室馴化2周，期間每日飼喂商品化飼料一次并換水，水溫維持在（25±1）℃。實驗時，斷頭處死中華鱉，快速分離脾臟、肝臟、腸道組織，液氮速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈

采用TRIzol法提取總RNA[14]。將-80℃保存的組織樣品取出，加入1 mL TRIzol（Invitrogen公司），組織勻漿，室溫靜置5 min，離心（12 000×g，5 min，4℃）；取上清，加入1/5體積的氯仿，渦旋15 s，室溫靜置5 min，離心（12 000×g，15 min，4℃）；取上清轉(zhuǎn)移到新的無RNA酶的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min，離心（12 000×g，10 min，4℃）得到RNA沉淀。沉淀用75%乙醇洗滌2次，室溫干燥5～10 min，待干燥后，加入DEPC處理的去離子水，55℃溶解10 min，冰浴20 min，分光光度計（Eppendorf公司）測量總RNA的濃度。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。按照SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa公司）操作手冊，將提取的脾臟、肝臟、腸道RNA混合后用于合成3'-與5'-RACE-ready cDNA文庫。

1.3 gp130全長cDNA的克隆

根據(jù)自NCBI數(shù)據(jù)庫中得到的中華鱉gp130基因預(yù)測序列設(shè)計引物，由上海生工公司合成（表1），按照SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒操作說明，進(jìn)行5'和3'RACE，從中華鱉cDNA文庫中擴(kuò)增gp130的3'與5'端片段。其中，UPM與NUP為通用引物。按照普通PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測后，切膠回收相應(yīng)的目的片段，克隆到pMD19-T simple（TaKaRa公司）載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑單克隆培養(yǎng)，PCR篩選陽性克隆送上海生工公司測序，將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對并拼接全長，依此拼接序列設(shè)計gp130全長cDNA驗證引物，經(jīng)PCR及測序驗證后獲得cDNA全長序列。

表1 實驗所用引物序列及用途

1.4 生物信息學(xué)分析

用BioEdit 7.2.3軟件對中華鱉gp130cDNA片段進(jìn)行拼接、分析，并利用在線翻譯軟件Ex-PASy Translate（http://web.expasy.org/translate/）將gp130序列翻譯為氨基酸序列。各個脊椎動物基因結(jié)構(gòu)及共線性關(guān)系通過搜索Ensembl數(shù)據(jù)庫（http://asia.ensembl.org/index.htm l）得到。中華鱉和其他脊椎動物的氨基酸序列多重比對采用ClustalX1.8 軟件結(jié)合 BoxShade（http://www.ch.embnet. org/software/BOX_form.htm l）在線軟件完成，并在MEGA 6.06軟件中用鄰接法進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建（自舉檢驗1000次）。用到的其他物種的氨基酸序列均來自GenBank。采用SOPMA（https://npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，蛋白3D結(jié)構(gòu)預(yù)測采用同源建模法，用SWISS-MODEL（http:// swissmodel.expasy.org）在線軟件完成。同時，結(jié)合SMART在線軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 中華鱉gp130基因全長獲得及序列分析

經(jīng)過3'及5'RACE，分別獲得中華鱉gp130基因的3'及5'cDNA片段，經(jīng)全長PCR驗證，獲得了3.5 kb左右的惟一條帶（圖1）。將片段切膠回收，連接到pMD19T simple載體，送上海生工公司測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對確定為中華鱉gp130基因。序列分析表明基因全長為3806 bp，開放讀框長度為2784 bp，編碼927個氨基酸殘基，5'非翻譯區(qū)（UTR）長度為90 bp，3'UTR長度為936 bp（圖2）。分析顯示中華鱉GP130包含WSXWS（色氨酸-絲氨酸-X-色氨酸-絲氨酸）序列、血細(xì)胞生成素受體序列，氨基酸序列末端還具有STAT3結(jié)合位點等（圖2）。

2.2 中華鱉gp130基因結(jié)構(gòu)分析與共線性關(guān)系分析

通過搜索Ensembl數(shù)據(jù)庫中中華鱉的基因組序列，并結(jié)合克隆得到的中華鱉gp130基因cDNA序列，我們獲得了該基因的結(jié)構(gòu)示意圖。對應(yīng)的基因組全長為73 252 bp，包含17個外顯子、16個內(nèi)含子。圖3為中華鱉gp130基因的基因結(jié)構(gòu)。

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得的基因相對位置信息，我們繪制了中華鱉及其他進(jìn)化上具有代表性的脊椎動物（人、小鼠、原雞、爪蟾、斑馬魚）的gp130基因的共線性關(guān)系圖（圖4）。比較發(fā)現(xiàn)，gp130與鄰近的4～5個基因存在保守的共線性關(guān)系，除個別物種外（如斑馬魚），該基因附近均可發(fā)現(xiàn)DDX4、IL31Ra、ANKRD55及MAP3K1等基因；同時與哺乳類與鳥類相比，沒有發(fā)現(xiàn)基因錯位與顛倒現(xiàn)象，但與爪蟾相比，gp130基因的編碼方向發(fā)生了顛倒。

2.3 中華鱉gp130基因編碼的蛋白特征、結(jié)構(gòu)預(yù)測及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

圖5為幾種脊椎動物的GP130氨基酸全序列比對。構(gòu)建的幾種脊椎動物的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖6），中華鱉GP130蛋白與西部錦龜首先聚類，其次是鳥類，然后與哺乳動物聚類，但與兩棲類、魚類等在進(jìn)化上的距離較遠(yuǎn)。采用SOPMA在線軟件預(yù)測結(jié)果表明，GP130蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（17.80%）、延伸鏈（26.11%）、無規(guī)則卷曲（46.93%）、β轉(zhuǎn)角（9.17%）組成。用SMART在線蛋白結(jié)構(gòu)分析軟件分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白包含跨膜結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合區(qū)、數(shù)個纖維鏈接蛋白（FN3）結(jié)構(gòu)域。在SWISS-MODEL網(wǎng)站以人GP130為模型（PDB ID：3l5h.1.A），構(gòu)建了中華鱉GP130蛋白的3D模型（圖7），兩者的一致性為58.32%。

圖1 中華鱉gp130基因全長cDNA的PCR擴(kuò)增驗證

圖2 中華鱉gp130基因全長序列

3 討論

人類GP130首先獲得克隆，是一個包含918個氨基酸殘基的跨膜蛋白，相對分子質(zhì)量為130× 103[15]。在鳥類及魚類中也有相應(yīng)報道[11，16]。本研究以中華鱉為研究對象，采用SMART RACE技術(shù)，獲得了gp130基因的cDNA全長3806 bp，其中開放讀框2784 bp，編碼927個氨基酸殘基。分析顯示該序列含有許多功能結(jié)構(gòu)：WSXWS序列，是造血細(xì)胞因子受體家族膜外部分受體與配體結(jié)合的關(guān)鍵序列[17]；血細(xì)胞生成素受體序列，是GP130家族特征結(jié)構(gòu)；氨基酸序列末端還具有STAT3結(jié)合位點，該結(jié)構(gòu)可促進(jìn)與STAT3的結(jié)合，同時有助于激活STAT3[18]。在與中華鱉基因組比對時發(fā)現(xiàn)，gp130的基因組共跨越了16個內(nèi)含子，總長近70 kb。同時分析比較了其他類型基因，發(fā)現(xiàn)比其他基因的內(nèi)含子要長很多（結(jié)果未展示）。具體功能有待進(jìn)一步探究。

圖2 中華鱉gp130基因全長序列（續(xù)）

圖3 中華鱉gp130基因與基因組DNA結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 幾種脊椎動物gp130基因的共線性關(guān)系圖

在比較了中華鱉與其他脊椎動物的gp130上下游4～5個基因的共線性關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，在基因位置關(guān)系上，中華鱉與原雞、小鼠、人很相近，并沒有發(fā)現(xiàn)基因倒位或顛倒的現(xiàn)象；但在爪蟾中g(shù)p130的編碼方向發(fā)生顛倒，與斑馬魚相比附近基因種類差異較大。這表明，在位置保守性上中華鱉更加接近于鳥類與哺乳類。同樣，在進(jìn)化樹中也可以看到，中華鱉及錦龜GP130首先與原雞聚類，其次是以小鼠和人為代表的哺乳類聚為一支，最后才是爪蟾與魚類。這也表明，在進(jìn)化關(guān)系上，爬行類的GP130進(jìn)化關(guān)系更為接近鳥類與哺乳類，而非兩棲類。這與傳統(tǒng)觀點一致[19]。

氨基酸序列分析表明我們獲得的GP130不含信號肽，說明該蛋白不是分泌型蛋白。包含的二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲和β轉(zhuǎn)角。通過蛋白三級結(jié)構(gòu)分析，該蛋白含有配體結(jié)合區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域及FN3結(jié)構(gòu)域。IL-6與其特異性受體IL-6R結(jié)合后使IL-6R發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而迅速與2分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白GP130結(jié)合，導(dǎo)致GP130同源二聚體的形成[20]。GP130分子的二聚化使得與之偶聯(lián)的JAK激酶相互接近，并通過交互的酪氨酸磷酸化作用而活化，進(jìn)而磷酸化STAT3，激活下游通路[5，21]。采用同源建模法，以人GP130為模型預(yù)測了中華鱉GP130蛋白的3D結(jié)構(gòu)，一致性為58.32%，兩者的結(jié)構(gòu)較為相似。說明該蛋白較為保守。

綜上，我們克隆了中華鱉gp130基因cDNA全長，分析了其基因及蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其在進(jìn)化地位上更接近于哺乳類與鳥類。這為爬行動物的先天性免疫研究，特別是STAT信號通路相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

圖6 NJ法構(gòu)建幾種脊椎動物GP130氨基酸序列進(jìn)化樹

圖7 中華鱉GP130蛋白3D模型

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Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of gp130 in Chinese Soft-Shelled Turtle（Pelodiscus sinensis）

SONG Ru-Xin,WANG Lan*,ZHANG Zuo-Bing*
School of Life Sciences,Shanxi University,Taiyuan 030006,China

Objective:To clone thegp130full-length cDNA from Chinese soft-shelled turtle.Methods:RACE PCR and bioinformation were used to clone the full-length sequence and predict thegp130gene and protein.Result:The length ofgp130cDNA of Chinese soft-shelled turtle was 3806 bp,encoding a 927 amino acid sequence and its genomic DNA length was 73 252 bp,which spans 16 introns and 17 exons.The BLAST results suggested that thegp130is a homolog of those of birds and mammalians.Bioinformatics analysis showed that the secondary structure consists ofα-helix,extension strand,random coil andβ-turn.The result of tertiary structure analysis showed that the protein contains ligand binding domain,trans membrane domains and FN3 domains.Phylogenetic analysis demonstrated that the reptilegp130clustered firstly with birds,and secondly with mammals,and finally with amphibians and fish.Meantime,we use the human GP130 protein as a model to construct the turtle GP130,the identity was 58.32%.Conclusion:We cloned thegp130full-length cDNA from Chinese soft-shelled turtle.This study laid a basement for further study ofgp130and the related signal pathways.

Pelodiscus sinensis;glycoprotein 130（GP130）;rapid amplification of cDNA ends（RACE）

Q78

A

1009-0002（2017）03-0265-09

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.006

2016-12-02

國家自然科學(xué)基金（31400343）

宋如昕（1992-），男，碩士研究生，（E-mail）srxsong@163.com

王蘭，（E-mail）lanwang@sxu.edu.cn；張左兵，（E-mail）zbzhang@sxu.edu.cn

*Co-corresponding authors,WANG Lan,E-mail:lanwang@sxu.edu.cn;ZHANG Zuo-Bin,E-mail:zbzhang@sxu.edu.cn