張曉青，郝建安，任華峰，司曉光，王靜，張雨山

國家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192

生物表面活性劑對紅球菌SY095降解正十六烷及細胞表面性質(zhì)的影響

張曉青，郝建安，任華峰，司曉光，王靜，張雨山

國家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192

目的：研究紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑對正十六烷的溶解性、微生物降解正十六烷的效率、菌體生長及菌體表面疏水性的影響。方法：測定添加不同生物表面活性劑的降解體系中菌體生物量、細胞表面疏水性、正十六烷含量的變化。結(jié)果：生物表面活性劑對疏水性底物正十六烷具有很強的增溶作用，可以顯著提高正十六烷的表觀溶解度；生物表面活性劑對正十六烷的生物降解具有促進作用，添加量為100 mg/L時，96 h正十六烷去除率達93.32%；生物表面活性劑能明顯促進紅球菌SY095生長，添加量為300 mg/L時，菌株32 h生物量為未添加生物表面活性劑對照組的2.7倍；生物表面活性劑還能引起紅球菌SY095菌體表面疏水性明顯增大，添加量為25 mg/L時，菌株對數(shù)生長期BATH值達66.94%，高于未添加生物表面活性劑對照組的42.99%。結(jié)論：生物表面活性劑可以增加菌體的表面疏水性，促進微生物對正十六烷的生物降解。

生物表面活性劑；增溶作用；生物降解；生長促進；細胞表面疏水性

隨著海洋經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們海洋活動的增加，海洋污染正在日益加劇，其中難降解疏水性有機物的污染問題突出。疏水性有機物進入海洋環(huán)境后，由于其溶解度低，持續(xù)時間長，能通過食物鏈進入人體，給海洋環(huán)境和人類健康帶來嚴重危害。據(jù)統(tǒng)計，2015年春、夏、秋、冬季石油類含量超過第一、二類海水水質(zhì)標準的海域面積分別為9410、19560、15580和14930平方公里。

微生物修復(fù)技術(shù)具有低成本、高效、環(huán)保等優(yōu)點，已成為去除石油類污染的重要手段，發(fā)展?jié)摿薮骩1]。但石油烴類中疏水性較強的長鏈烷烴和芳香烴等化合物水溶性差限制了其生物修復(fù)效率[2]。表面活性劑可以提高疏水性污染物在水相中的表觀溶解度，增加這類污染物與微生物的接觸面積，加強有機相和水相的傳質(zhì)，從而提高污染物的生物可利用性[3]。生物表面活性劑是微生物生長代謝的活性產(chǎn)物，與化學(xué)表面活性劑相比具有更好的環(huán)境兼容性，有利于微生物的降解，因此生物表面活性劑作為一種石油助解劑成為研究熱點[4]。目前研究最多的生物表面活性劑為鼠李糖脂，據(jù)文獻報道，鼠李糖脂對疏水性烴類有機物（如菲、芘等）增溶作用顯著[5-6]，能促進降解菌生長[7-8]，改變菌體表面疏水性[9]，從而加快石油烴的生物修復(fù)進程。

我們通過研究紅球菌SY095所產(chǎn)生物表面活性劑對疏水性污染物增溶作用，考察添加生物表面活性劑后其對降解菌生長、細胞表面疏水性及污染物降解效率的影響，探討生物表面活性劑在強化烴類污染物生物降解過程中與微生物的相互作用，為生物表面活性劑在生物修復(fù)中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

紅球菌SY095（Rhodococcussp.）由本實驗室分離鑒定，GenBank登錄號為GU184127[10]。正十六烷（純度≥95%，天津艾勒科技公司）；氯仿、甲醇等無機溶劑（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司）；正十六烷標物（99.9%純度，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，去離子水1 L，初始pH7.0～7.5。

無機鹽培養(yǎng)液（/L）：K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CO（NH2）22.0 g，大豆油2%，初始pH7.5。

正十六烷培養(yǎng)基：將無機鹽培養(yǎng)基中的大豆油換成正十六烷，添加量為0.5%。

1.2 種子液的制備

將SY095接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，D600nm達1.80±0.05。

1.3 生物表面活性劑的分離與提純

按2%接種量將紅球菌SY095轉(zhuǎn)接到無機鹽培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0±0.2，4℃靜置過夜；將酸沉淀后的發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，收集離心管中的懸浮物，用同等體積的氯仿∶甲醇（2∶1）抽提2～3次，合并抽提液，在60℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，最終體積7～10 mL，于70℃烘箱中將有機溶液完全揮發(fā)，得到表面活性劑制品，儲于4℃冰箱中[11]。

1.4 生物表面活性劑乳化增溶實驗

在100 mL含不同濃度表面活性劑的溶液中加入0.5 mL正十六烷，25℃、160 r/min振蕩24 h，靜置24 h，吸取下層水溶液5 mL，用等體積正己烷萃取2～3次，合并有機相濃縮至5 mL，利用氣相色譜法測定正十六烷含量。

1.5 生物表面活性劑強化紅球菌SY095降解正十六烷實驗

在100 mL正十六烷培養(yǎng)基（添加量0.5%）中添加生物表面活性劑，其終濃度分別為0、25、50、75、100、50、200、300 mg/L，接種量為4%，30℃、160 r/min搖床培養(yǎng)4 d，定期測定菌體生物量、細胞表面疏水性和正十六烷的降解率。

1.6 正十六烷測定

正十六烷測定采用安捷倫6890N氣相色譜儀，用標準物質(zhì)鑒定并計算正十六烷的降解率。采用毛細管氣相色譜柱（Phenyl Methyl Siloxane HP-5），載氣為99.99%氮氣，進樣口溫度250℃，分流比30∶1，檢測器溫度300℃，氫氣流量30 mL/ min，空氣流量300 mL/min，進樣量1μL。初始160℃，保留1 min，以20℃/min升溫至260℃，保留6 min[12]。

1.7 細胞表面疏水性的測定

菌體表面疏水性采用BATH（bacterial adhesion to hydrocarbons，細菌對碳氫化合物的黏附）方法測定[13]。取不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液，4℃、6000 r/min離心8 min，收集菌體細胞，用無機鹽培養(yǎng)基洗滌2次，再重懸于其中，菌懸液D400nm約為1.0；取4 mL菌懸液和1 mL正十六烷加入20 mL離心管中，蓋緊蓋子后快速振蕩60 s，室溫放置30 min，吸取底層水相，測其D400nm值；按下式計算表面疏水性A：

其中T0為吸附前菌液的D400nm值，T1為吸附后菌液的D400nm值。每個樣品測3次，結(jié)果取平均值。

1.8 菌體生物量測定

取不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)液5 m L，8000 r/min離心5 min，收集菌體細胞，用去離子水洗滌2次，再重懸于等體積的無機鹽培養(yǎng)基中，測定其D600nm值。

2 結(jié)果

2.1 生物表面活性劑對正十六烷的增溶作用

紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑對長鏈烷烴正十六烷的增溶作用見圖1，可知生物表面活性劑的增溶作用明顯，正十六烷在水相中的溶解度隨著生物表面活性劑濃度的增加而增大。生物表面活性劑的濃度低于臨界膠束濃度值（CMC= 68.3 mg/L）時，正十六烷在水相中的溶解度從0.12增大到59.83 mg/L，這主要由于烷烴與表面活性劑疏水基團相互作用降低油/水界面張力，從而增加烷烴在水相中的溶解度[14]；生物表面活性劑濃度從臨界膠束濃度值提高到300 mg/L時，正十六烷在水相中的溶解度從59.83增加到125.12 mg/L。

2.2 生物表面活性劑作用下正十六烷的生物降解

添加不同濃度生物表面活性劑后紅球菌SY095對正十六烷的降解效果見圖2?？梢钥闯觯c未添加生物表面活性劑的降解體系相比，加入一定量的生物表面活性劑可以大大提高正十六烷的降解效率。培養(yǎng)96 h時，添加生物表面活性劑濃度為25、50、75、100、150、200、300 mg/L，培養(yǎng)液中正十六烷的去除率比未添加生物表面活性劑體系分別增加了8.3%、12.8、15.2%、18.4%、18.2%、18.8%和19.9%。高濃度生物表面活性劑（100～300 mg/L）體系中，正十六烷的降解率顯著提高，24 h正十六烷去除率達30%，72 h降解率都在93%以上。正十六烷降解率的顯著提高，一方面因為生物表面活性劑對正十六烷增溶作用，為菌體和正十六烷的接觸提供有利條件，從而促進正十六烷的降解；另一方面可能是生物表面活性劑和降解菌株SY095之間相互作用，使得微生物細胞表面性質(zhì)發(fā)生改變，更容易攝取難溶疏水性的物質(zhì)，從而促進底物的降解[15]。

圖1 紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑對長鏈烷烴正十六烷的增溶作用

圖2 生物表面活性劑對正十六烷的生物降解的影響

2.3 生物表面活性劑對紅球菌SY095生長的影響

在紅球菌SY095的正十六烷培養(yǎng)基中加入一定量的生物表面活性劑，不同條件下菌株D600nm值的變化見圖3。培養(yǎng)24 h時，紅球菌SY095生長緩慢，處于生長延滯期，不同條件下菌株生物量D600nm值都在0.3左右；24 h后，菌株適應(yīng)了培養(yǎng)基環(huán)境，進入快速生長期，且添加了生物表面活性劑菌株生物量快速增加，其中添加量為300 mg/L菌株培養(yǎng)32 h時D600nm值達0.824，未添加菌株D600nm值僅為0.305，因此生物表面活性劑可以顯著加快菌株的生長，促進菌株快速進入對數(shù)生長期；隨后56 h菌株進入生長穩(wěn)定期和衰亡期。從圖3還可以看出，菌株最大生物量隨培養(yǎng)液中生物表面活性劑濃度的增加而變大，其中添加量為200和300 mg/L最大生物量（D600nm值）分別達到1.988和2.022。

2.4 生物表面活性劑對紅球菌細胞疏水性的影響

圖3 生物表面活性劑對紅球菌SY095生長的影響

圖4 生物表面活性劑對紅球菌SY095菌體細胞表面疏水性的影響

添加不同濃度的生物表面活性劑，菌株細胞疏水性隨時間的變化見圖4?？梢钥闯?，在未添加生物表面活性劑培養(yǎng)基中，菌株SY095表面疏水性隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸增大，從開始的11.2%增加到72 h的42.99%，之后略有下降，這時細胞疏水性增大主要是由于疏水性底物正十六烷的誘導(dǎo)作用，菌體細胞為了適應(yīng)疏水性環(huán)境而改變細胞性質(zhì)[16]。添加了生物表面活性劑后紅球菌SY095在正十六烷培養(yǎng)基中的BATH明顯增大，當添加量為300 mg/L時，菌株在對數(shù)生長期中BATH值高達79.22%，之后略有下降，96 h時仍為51.03%，均高于未添加生物表面活性劑的BATH。生物表面活性劑可以與菌體細胞相互吸附，改變菌體表面的吸附特性，從而改變菌體與疏水性有機物間的親和力，使降解菌株更好地攝取疏水性的底物，加速其降解速率。在菌株生長后期，細胞表面疏水性下降，這可能是因為隨著微生物進入生長衰退期，菌體細胞表面疏水位點減少，同時分泌一些脂肪酸和脂類物質(zhì)，改變自身表面疏水性[17]。

3 討論

生物表面活性劑是由微生物在一定培養(yǎng)條件下代謝分泌的具有表面生物活性的物質(zhì)，具有低毒、易降解等優(yōu)點，可以顯著提高疏水性污染物在水相中的表觀溶解度，增加疏水性有機物與微生物的接觸面積，從而提高污染物的生物可利用性。我們選取紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑，通過增溶實驗和降解實驗，研究該表面活性劑對正十六烷的增溶作用、降解菌生長、菌體細胞表面疏水性及疏水性底物降解效率的影響。

本實驗中紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑對正十六烷的增溶作用明顯，正十六烷在水相中的溶解度隨生物表面活性劑濃度的增加而增大。當濃度較低時，生物表面活性劑主要以單體形式存在，烷烴溶解度增加主要是由于烷烴與生物表面活性劑疏水基團間相互作用；當濃度大于臨界膠束濃度值時，其親水基團向外伸向水相，疏水基團向內(nèi)形成膠束，增溶作用主要是通過膠束將疏水性烷烴包裹在膠束內(nèi)核區(qū)域，使其在水相中的表觀溶解度增加[18]。

微生物菌體表面疏水性強有利于微生物與細胞底物的接觸，增加微生物細胞與疏水性基質(zhì)之間的親和力，提高其降解速率，而在降解體系中加入生物表面活性劑可以使菌體表面疏水性發(fā)生變化。馬霞[12]等研究表明，在石油烴生物降解過程中，鼠李糖脂能夠促進菌株生長，增加菌體的表面疏水性，加快烴類的傳質(zhì)速率，從而加速環(huán)境的生物修復(fù)速度。姜萍萍[14]等發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂可顯著促進降解菌GP3生長，且在降解初期細胞表面疏水性顯著增加，有利于微生物攝取有機底物，加速芘的生物降解。在本研究中，與未添加生物表面活性劑的降解體系相比，加入一定量的生物表面活性劑可以提高正十六烷的降解效率，加快菌株的生長，促進菌株快速進入對數(shù)生長期，且菌株最大生物量隨培養(yǎng)液中生物表面活性劑濃度的增加而變大。同時，培養(yǎng)基中添加了生物表面活性劑后紅球菌SY095在正十六烷培養(yǎng)基中的BATH值明顯增大。因此，紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑可以顯著提高正十六烷表觀溶解度，促進降解菌生長，改變降解菌細胞表面疏水性，使菌體更好攝取疏水性底物，從而提高正十六烷的生物降解效率。

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Effects of Biosurfactant Produced by Rhodococcus SY 095 on the Biodegradation of n-Hexadecane and the Cell Surface Hydrophobicity

ZHANG Xiao-Qing,HAO Jian-An,REN Hua-Feng, SI Xiao-Guang,WANG Jing*,ZHANG Yu-Shan

Institute of Seawater Desalination and Multi-purpose Utilization,SOA,Tianjin 300192,China

*Corresponding author,E-mail:Wang_nana@163.com

Objective:To study the effects of biosurfactant produced byRhodococcusSY095 on the biodegradation efficiency of n-hexadecane,the solubility of n-hexadecane,the growth of bacteria and the cell surface hydrophobicity.Methods:The cell biomass ofRhodococcusSY095,cell surface hydrophobicity and n-hexadecane content in different biosurfactant degradation systems were determ ined.Results:The results showed that the solubility of n-hexadecane was enhanced significantly by biosurfactant.The degradation of n-hexadecane was accelerated with biosurfactant.With 100 mg/L of biosurfactant,the average degradation rate of n-hexadecane in 96 h could reach 93.32%.The biosurfactant could promote the growth ofRhodococcusSY095.Compared with the control group,the biomass ofRhodococcusSY095 increased 2.7 times in 32 h by adding 300 mg/L biosurfactant.The cell surface hydrophobicity ofRhodococcusSY095 was enhanced significantly also by adding biosurfactant.The cell sur-face hydrophobicity reached 66.94%in logarithmic growth phase by adding 25 mg/L biosurfactant,while that the absence of biosurfactant was only 42.99%.Conclusion:The biosurfactants could enhance the cell surfaces hydrophobicity of SY095 and promoted the biodegradation of the n-hexadecane.

biosurfactant;solubility enhancement;biodegradation;growth promotion;cell surface hydrophobicity

Q939.9

A

1009-0002（2017）03-0328-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.017

2016-12-06

海洋公益性行業(yè)科研專項（201305022）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（K-JBYWF-2015-G16，K-JBYWF-2015-T11，K-JBYWF-2016-T9）

張曉青（1983-），女，工程師，（E-mail）radicle@163.com

王靜，（E-mail）Wang_nana@163.com