尹彥超，張曉冬，馬永生，周姍，高智強(qiáng)，胡婷，劉穎

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102

脹果甘草查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及序列分析

尹彥超，張曉冬，馬永生，周姍，高智強(qiáng)，胡婷，劉穎

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102

目的：對(duì)脹果甘草甘草苷生物合成途徑的關(guān)鍵酶查爾酮異構(gòu)酶（CHI）進(jìn)行基因克隆及序列分析。方法：根據(jù)烏拉爾甘草CHI基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以脹果甘草主根總RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增CHI基因cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)果：克隆得到20條脹果甘草CHI基因cDNA序列，開(kāi)放讀框全長(zhǎng)690 bp，編碼229個(gè)氨基酸殘基。20條脹果甘草CHI基因的cDNA序列存在22個(gè)變異位點(diǎn)，一致性為99.54%，可分為6種單倍型；其編碼的氨基酸序列存在14個(gè)變異位點(diǎn)，一致性為98.98%。脹果甘草CHI基因編碼蛋白為穩(wěn)定性親水蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為24.5×103，等電點(diǎn)為5.3～6.2，不含信號(hào)肽，無(wú)跨膜區(qū)，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，保守結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)查耳酮超家族結(jié)構(gòu)域。同源性分析顯示，不同物種間的CHI基因同源性較低。結(jié)論：克隆了脹果甘草CHI基因cDNA序列，為進(jìn)一步研究不同基原甘草中甘草苷生物合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并為優(yōu)質(zhì)甘草的分子選育提供了理論依據(jù)。

脹果甘草；查爾酮異構(gòu)酶；生物信息學(xué)分析

［Key words］Glycyrrhiza inflataBat.;chalcone isomerase;bioinformatic analysis

甘草是我國(guó)最常用的大宗藥材之一，具有補(bǔ)脾益氣、抗炎解毒、鎮(zhèn)咳祛痰、調(diào)和諸藥等作用[1]?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定的甘草基原是豆科植物烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、脹果甘草（G.inflataBat.）或光果甘草（G.glabraL.）的干燥根和根莖[1]。烏拉爾甘草、光果甘草、脹果甘草雖然同為藥典采用的甘草基原植物，但其化學(xué)成分和藥理活性卻相差較大[2-3]。目前關(guān)于甘草的研究多集中于烏拉爾甘草，涉及功能基因克隆[4]、基因多態(tài)性研究[5]、化學(xué)成分分析[6]等方面，而關(guān)于脹果甘草的研究報(bào)道則相對(duì)較少。

甘草的活性成分主要為甘草酸和甘草苷，《中國(guó)藥典》規(guī)定本品按干燥品計(jì)算，含甘草苷（C21H22O9）不得少于0.50%[1]。甘草苷屬于黃酮類化合物，其生物合成途徑受眾多酶的調(diào)控，其中查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）是關(guān)鍵酶之一，催化分子內(nèi)的環(huán)化反應(yīng)[7]，對(duì)甘草苷的合成具有至關(guān)重要的作用。CHI分為2種類型，Ⅰ型CHI只能以查耳酮為底物，催化柚皮素查爾酮合成柚皮素；Ⅱ型CHI既可以查耳酮為底物，也可以6'-脫氧查耳酮為底物[8]，催化查爾酮類的異甘草素合成甘草素，甘草素與α-D-吡喃葡萄糖合成甘草苷（圖1）。因此，對(duì)CHI開(kāi)展相關(guān)研究，可以在一定程度上揭示甘草苷生物合成的分子機(jī)制，從而有望提高栽培甘草中甘草苷的積累水平。

鑒于CHI在黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵地位，目前已從金銀花[9]、水母雪蓮[10]、芍藥[11]等植物中克隆得到其cDNA序列。就甘草而言，3種基原甘草中烏拉爾甘草CHI基因cDNA序列已有報(bào)道[12]，而脹果甘草中該基因尚未完成克隆。因此，我們采用RT-PCR技術(shù)，以脹果甘草主根總RNA為模板克隆CHI基因，并進(jìn)行序列比對(duì)及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究功能基因多態(tài)性對(duì)甘草苷積累的影響及優(yōu)質(zhì)甘草的分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

植物材料取自栽培兩年生的新鮮脹果甘草主根，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD-19T載體、ESPY spin植物RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、M-MLV（Rnase H-）購(gòu)于北京博邁德生物技術(shù)有限公司；LA-TaqDNA聚合酶、Oligo（dT）購(gòu)于TaKaRa公司；引物合成由上海生工生物工程公司（Sangon）完成。微量移液器（Eppendorf）；1-13000型離心機(jī)（Sigma）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；BG-gdsAUTO510型凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）；酶標(biāo)儀（Biotek Epoch）。

1.2 脹果甘草主根總RNA的提取及RT-PCR

取脹果甘草根于液氮中研磨至粉末，用RNA提取試劑盒提取總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性，用酶標(biāo)儀測(cè)定所得RNA的純度和濃度。以脹果甘草總RNA為模板，Oligo（dT）為引物，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 脹果甘草CHI基因擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道的烏拉爾甘草CHI序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)上游引物GF（5'-ATGGC GGGAGCAGCACCAGTA-3'）和下游引物GR（5'-T CAGTTTCCGTTTCCAAT-3'），以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50μL反應(yīng)體系包括模板cDNA 2.0μL、10×緩沖液5.0μL、dNTP（2.5 mmol/L）5.0μL、引物GF和GR（10μmol/L）各2.0μL、LA-TaqDNA聚合酶1.0μL、無(wú)RNase的水33.0μL。反應(yīng)程序：95℃ 2 min；95℃ 20 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。于4℃保存。

1.4 PCR產(chǎn)物膠回收、克隆及序列測(cè)定

經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切下目的片段，膠回收純化后與pMD-19T于16℃連接12 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含50 mg/L氨芐西林（Amp）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，隨機(jī)挑選50個(gè)單菌落接種于含50 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min條件下培養(yǎng) 12～16 h，行菌液PCR，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，驗(yàn)證為陽(yáng)性克隆的用于測(cè)序。測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.5 生物信息學(xué)分析

將得到的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)。用Editseq將所得序列翻譯成氨基酸序列，通過(guò) 在 線 工 具 SignaIP、Prot Scale、Prot Param、SW ISS-Model和SOPMA等分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守結(jié)構(gòu)域及基本理化性質(zhì)，并通過(guò)NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)查找已注冊(cè)的CHI序列，用軟件MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 脹果甘草CHI基因序列分析

圖1 甘草苷合成途徑

共獲得20條長(zhǎng)度約為690 bp的脹果甘草CHI基因cDNA序列（圖2），與目標(biāo)條帶長(zhǎng)度一致。測(cè)序結(jié)果顯示，所得20條cDNA序列長(zhǎng)度均為690 bp。DNAMAN比對(duì)結(jié)果顯示20條cDNA序列中存在22個(gè)變異位點(diǎn)，可分為6種單倍型J1～J6，一致性為99.54%（表1）。將這6種單倍型與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的烏拉爾甘草CHI基因cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其一致性為98.55%～100%，因此可確定獲得的序列為脹果甘草CHI基因cDNA序列。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示存在14個(gè)變異位點(diǎn)，一致性為98.98%（表2）。在GenBank完成所有序列的注冊(cè)，注冊(cè)登錄號(hào)見(jiàn)表3。在兩兩比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)J3與J1、J2、J4、J5、J6之間的一致性分別為99.86%、98.55%、99.13%、99.42%和99.86%，較其他高；J2與J1、J3、J4、J5、J6之間的一致性分別為98.41%、98.55%、97.68%、97.97%和98.41%，較其他低。因此，挑選這2條序列進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

2.2 理化性質(zhì)分析

用ProtParam軟件預(yù)測(cè)6條脹果甘草CHI編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表3。脹果甘草CHI編碼的蛋白由229個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量約24.5×103，等電點(diǎn)為5.3～6.2，不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，表明其為穩(wěn)定蛋白，半衰期為30 h?？偲骄H水性為-0.125～-0.040，均為負(fù)值且介于-2.0～2.0，說(shuō)明脹果甘草CHI為親水性蛋白。

圖2 CHI擴(kuò)增結(jié)果

2.3 脹果甘草CHI的同源性分析

利用DNAMAN將所得6條脹果甘草CHI氨基酸序列與其他植物的該氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明脹果甘草J3與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的烏拉爾甘草一致性最高，為 100%；其次與綠豆（AJZ72654.1）的一致性較高，為76.42%；而與擬南芥（OAP11712.1）的一致性最低，僅為7.48%。J2與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的烏拉爾甘草一致性最高，為97.38%；其次為綠豆（AJZ72654.1），74.67%；與擬南芥（OAP11712.1）的一致性最低，僅為7.14%?？梢?jiàn)CHI在不同物種間的同源性較低。

根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選有代表性的20個(gè)其他物種的CHI序列，利用MEGA5.1軟件，將其與本研究所得脹果甘草CHI氨基酸序列構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖3所示。27條氨基酸序列共分為2大類群，其中6條脹果甘草CHI序列與文獻(xiàn)報(bào)道的烏拉爾甘草聚到一支，且與豆科植物綠豆（AJZ72654.1）在進(jìn)化關(guān)系上最近，與枸杞（AIC33515.1）、郁金香（AGJ50586.1）、紫花苜蓿（AGZ04578.1）等較遠(yuǎn)，與擬南芥（OAP11712.1）、黃芩（AMW 91737.1）等相距更遠(yuǎn)，該結(jié)果與序列分析結(jié)果相符。

2.4 脹果甘草CHI二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用DNAMAN和SOPMA對(duì)J3和J2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4。J3由34.06% α螺旋、21.40%延伸鏈、11.79% β折疊、32.75%不規(guī)則卷曲組成；J2由31.44% α螺旋、20.09%延伸鏈、11.79% β折疊、36.68%不規(guī)則卷曲組成。J3與J2在29～140、175～218位均存在α螺旋，30～34、163～167、222～224位均存在β折疊，123～127、142～145、159～160位為延伸鏈，35～38、88～91、105～107、172～174位為不規(guī)則卷曲，由此可推斷兩者在氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)上相近。

2.5 脹果甘草CHI結(jié)構(gòu)域分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表1 脹果甘草CHI基因cDNA序列變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表

對(duì)J3、J2進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示均包含一個(gè)查爾酮3超家族結(jié)構(gòu)域。采用SWISS-Model分別對(duì)J3和J2進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)同源性建模，結(jié)果如圖5所示，以X-ray為方法，1jx1.1.A為模板建立的J3模型和J2模型立體結(jié)構(gòu)相似。2.6 脹果甘草CHI信號(hào)肽的預(yù)測(cè)及分析

表2 脹果甘草CHI氨基酸序列變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表

用SignalP 4.1 Server對(duì)J3、J2進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6。J3序列中第24位氨基酸殘基具有最高的原始剪切位點(diǎn)分值0.116，第2號(hào)氨基酸殘基具有最高的信號(hào)肽分值0.154，第11號(hào)氨基酸殘基具有最高的綜合剪切位點(diǎn)分值0.119。J2序列中第9位氨基酸殘基具有最高的原始剪切位點(diǎn)分值0.109，第2號(hào)氨基酸殘基具有最高的信號(hào)肽分值0.131，第12號(hào)氨基酸殘基具有最高的綜合剪切位點(diǎn)分值0.106。由此可見(jiàn)，脹果甘草CHI不存在信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，不具有信號(hào)肽。

2.7 脹果甘草CHI跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)

表3 脹果甘草CHI氨基酸序列理化性質(zhì)

圖3 CHI系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖

圖4 脹果甘草CHI二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用TMHMM Serber v.2.0對(duì)脹果甘草CHI氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖7。J3、J2序列均不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，這也與它們的親水性較高相符。由此可推斷脹果甘草查爾酮異構(gòu)酶無(wú)跨膜區(qū)，存在于膜外。

3 討論

近年來(lái)因過(guò)度采挖，已造成野生甘草瀕臨滅絕的現(xiàn)象[13]。目前市售甘草藥材多為栽培甘草，因此對(duì)栽培甘草的合理利用和有效開(kāi)發(fā)尤為重要。本課題組前期研究顯示栽培甘草中甘草苷的含量普遍偏低，難以達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)甘草苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶開(kāi)展相關(guān)研究，有可能揭示甘草苷生物合成的分子機(jī)制，從而提高栽培甘草中甘草苷的累積水平，是中藥現(xiàn)代化的具體表現(xiàn)，也是保護(hù)和發(fā)展中國(guó)傳統(tǒng)道地藥材的基礎(chǔ)性工作。

圖5 脹果甘草CHI三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖6 脹果甘草CHI信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖7 脹果甘草跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

我們用RT-PCR方法克隆了脹果甘草CHI序列，獲得6種單倍型，比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)其cDNA序列雖不完全相同，但是其蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)等差異較小，且均包含一個(gè)查爾酮3超家族結(jié)構(gòu)域，無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)。由此推斷cDNA序列單核苷酸多態(tài)性對(duì)其編碼酶的功能影響較小。分析顯示CHI在不同物種間同源性相對(duì)較低，因此這可能給同源克隆帶來(lái)一定的難度。

CHI廣泛存在于多種植物中，它是黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其表達(dá)量的多少直接影響著金銀花顏色的形成[9]；并在葡萄果皮、種子和果肉發(fā)育過(guò)程中有利于花青素的積累，對(duì)葡萄的質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有重要意義[14]。除此之外，Verhoeyen等通過(guò)異位表達(dá)查爾酮異構(gòu)酶，得到了總黃酮醇含量增加48倍的番茄[15]；Lukaszewicz等將查爾酮合成酶基因?qū)腭R鈴薯塊莖，基因的過(guò)表達(dá)引起了黃酮類化合物的增加，改善了馬鈴薯的抗氧化能力[16]。本研究克隆得到6種脹果甘草CHI單倍型，將有利于進(jìn)一步探討甘草中黃酮類物質(zhì)生物合成的分子調(diào)控機(jī)制以及提高甘草質(zhì)量。

[1]中華人民共和國(guó)藥典Ⅰ部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2015:86-87.

[2]向誠(chéng),喬雪,葉敏,等.利用數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)甘草屬植物化學(xué)成分的分類和分布分析[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(8):1023-1030.

[3]馬君義.國(guó)產(chǎn)四種甘草次生代謝產(chǎn)物的研究[D].蘭州:西北師范大學(xué),2004.

[4]沈湛云,劉春生,王學(xué)勇.甘草β-香樹(shù)酯醇合成酶的編碼區(qū)克隆與序列分析[J].中國(guó)中藥雜志,2009,19:2438-2440.

[5]劉穎,許巧仙,王學(xué)勇,等.甘草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因多態(tài)性與甘草酸含量的相關(guān)性分析[J].中國(guó)中藥雜志,2012,37(24):3789-3792.

[6]王青,苗文娟,向誠(chéng),等.烏拉爾甘草中黃酮類化學(xué)成分的研究[J].中草藥,2014,45(1):31-36.

[7]Jez J M,Bowman M E,Dixon R A,et al.Structure and mechanism of the evolutionarily unique plant enzyme chalcone isomerase[J].Nat Struct Biol,2000,7 (9):786-791.

[8]Shimada N,Aoki T,Sato S,et al.A cluster of genes encodes the two types of chalcone isomerase involved in the biosynthesis of general flavonoids and legumespecific 5-deoxy(iso)flavonoids in Lotus japonicus[J]. Plant Physiol,2003,131(3):941-951.

[9]喬中全.金銀花chs、fls、chi基因全長(zhǎng)克隆及序列分析[D].長(zhǎng)沙:中南林業(yè)科技大學(xué),2012.

[10]瞿文全.水母雪蓮（S.Medusa Maxim）類黃酮合成及抗逆相關(guān)基因克隆與查耳酮異構(gòu)酶（CHI）基因的原核表達(dá)[D].重慶:西南農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

[11]吳彥慶,趙大球,王靜,等.芍藥查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)克隆、密碼子偏好性分析以及蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2016,31(2):71-80.

[12]李建華.烏拉爾甘草黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶研究[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2014.

[13]黃明進(jìn),王文全,魏勝利.我國(guó)甘草藥用植物資源調(diào)查及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J].中國(guó)中藥雜志,2010,35(8):947-952.

[14]周軍,姚泉洪,彭日荷,等.巨峰葡萄查爾酮異構(gòu)酶基因克隆及表達(dá)分析[J].西北植物學(xué)報(bào),2009,29(9):1723-1729.

[15]Verhoeyen M E,Bovy A,Collins G,et al.Increasing antioxidant levels in tomatoes through modification of the flavonoid biosynthetic pathway[J].J Exp Botany, 2002,53(377):2099-2106.

[16]Lukaszewicz M,Matysiak-Kata I,Skala J,et al.Antioxidant capacity manipulation in transgenic potato tuber by changes in phenolic compounds content.[J].J Agric Food Chem,2004,52(6):1526-1533.

Cloning and Sequence Analysis of Chalcone Isomerase Gene from Glycyrrhiza inflata Bat.

YIN Yan-Chao,ZHANG Xiao-Dong,MA Yong-Sheng, ZHOU Shan,GAO Zhi-Qiang,HU Ting,LIU Ying*

School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China

*Corresponding author,E-mail:liuyliwd@.sina.com

Objective:To clone and analyze the chalcone isomerase（CHI）gene fromGlycyrrhiza inflataBat..Methods:Specific primers were designed based on reportedCHIcDNA sequence ofG.uralensis,RT-PCR technique was used to amplifyCHIcDNA sequences ofG.inflata,and which were analyzed by bioinformatics.Results:TwentyCHIcDNA sequences ofG.inflatawith the length of 690 bp were obtained encoding 229 amino acid residues.Twenty-two variable sites were found in these 20 cDNA sequences and 6 haplotypes were determined,with a similarity of 99.54%.Physicochemical property ananlysis shows that theseCHIcoding protiens are all stably hydrophilic protein,with a molecular weigh of 24.5 kD and a isoelectric point between 5.3～6.2.It has no signal peptides or trans membrane domains.Its secondary structure mainly consists of alpha helix and random coil.Also chalcone super family domain is included in the conserved domain.Homology analysis indicates that the homology ofCHIamong different species is low.Conclusion:CHI cDNA sequeces were successfully cloned fromG.inflata.We hope this work will lay a foundation for further researches on the molecular mechanisms of flavonoid biosynthesis in different licorice origins and licorice molecular breeding.

Q943.2

A

1009-0002（2017）03-0274-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.007

2016-11-25

北京中醫(yī)藥大學(xué)杰出青年人才項(xiàng)目（2016JYBXJQ002）

尹彥超（1993-），男，碩士研究生，（E-mail）yinyanc_pharm@sina.com

劉穎，（E-mail）liuyliwd@.sina.com