陳寶伶

[摘要] 目的 探討彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）Bcl-2蛋白的表達(dá)，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和微血管密度（microvessel density，MVD）的相關(guān)性，研究彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤Bcl-2蛋白與血管新生的關(guān)系。 方法 采用免疫組織化學(xué)染色方法（EnVison）檢測彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者和對照組淋巴結(jié)組織中VEGF、Bcl-2、MVD表達(dá)情況。 結(jié)果 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者Bcl-2蛋白、MVD、VEGF 陽性表達(dá)均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。對三者進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析，結(jié)果顯示MVD與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，Bcl-2蛋白陽性表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，Bcl-2蛋白陽性表達(dá)與MVD表達(dá)呈正相關(guān)。 結(jié)論 VEGF的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖能力及侵襲能力，可促進(jìn)Bcl-2蛋白高表達(dá)，同時加上本身促血管生成的作用，可降低彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞凋亡，從而增加彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的惡性程度，既而增加了彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的治療難度。

[關(guān)鍵詞] 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤；血管內(nèi)皮生長因子；血管新生；B細(xì)胞淋巴因子2蛋白；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號] R733.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）36-0032-05

[Abstract] Objectives To investigate the relationship among the expression of Bcl-2 protein， VEGF and MVD and discuss the relationship between angiogenesis and Bcl-2 in diffuse large B cell lymphoma. Methods Immunohistochemical assay（EnVison） was performed to test the VEGF， Bcl-2 and microvessel density in diffuse large B cell lymphoma and control group. Results The expression of Bcl-2， MVD and VEGF in diffuse large B cell lymphoma was significantly higher than control group （P<0.01）. VEGF expression was correlated with MVD in diffuse large B cell lymphoma. Bcl-2 expression was correlated with VEGF in diffuse large B cell lymphoma， Bcl-2 expression was correlated with MVD in diffuse large B cell lymphoma. Conclusion High expression of VEGF can improve the proliferation and invasion ability of tumor cell. VEGF can improve the expression of Bcl-2， lower diffuse large B cell lymphoma cell′s death， and increase malignant extent of diffuse large B cell lymphoma， VEGF plays an important role in angiogenesis， then can increase angiogenesis and remedial difficulty of diffuse large B cell lymphoma.

[Key words] Diffuse large B cell lymphoma； Vascular endothelial growth factor（VEGF）； Angiogenesis； B cell lymphoma 2 protein； Immunohistochemical assay

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常見的一類侵襲性淋巴瘤[1]。目前發(fā)現(xiàn)在淋巴瘤、骨髓瘤及急性白血病等患者的骨髓中存在不同程度的血管新生（Angiogenesis），血管新生可能參與了腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程[2]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管新生中最主要的調(diào)控因子，可誘導(dǎo)大部分惡性腫瘤的血管新生，刺激腫瘤細(xì)胞的生長[3]。B細(xì)胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一。在細(xì)胞凋亡過程中及腫瘤多重耐藥形成中均起著重要的作用。

隨著對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤研究的深入發(fā)展，目前對其病理診斷、治療和殘留病灶的診斷評價等諸多方面均有了較大的發(fā)展，但仍有部分患者療效較差，因此為了更好地預(yù)測患者在治療過程中病情的發(fā)展及制定個體化治療方案，本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)回顧性分析彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤血管新生與Bcl-2蛋白的表達(dá)及其之間的聯(lián)系，為臨床上對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的診斷治療及預(yù)后提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2009年9月～2014年9月我院患者淋巴結(jié)標(biāo)本經(jīng)病理組織學(xué)明確診斷的初治的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者35例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO（2008）關(guān)于造血與淋巴組織腫瘤分類[4]進(jìn)行，男18例，女17例，年齡12～67歲，平均45歲。原發(fā)灶均位于淋巴結(jié)內(nèi)，以頸部為主。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②取材良好，無污染；③淋巴結(jié)蠟塊完整，可重復(fù)切片；④切片后應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法染色效果好的淋巴結(jié)組織樣本。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)（例如非霍奇金淋巴瘤分型）；②取材差，淋巴結(jié)組織少；③淋巴結(jié)蠟塊不完整，不能切片或切片后，貼片不理想。④染色效果差，免疫組化過程中出現(xiàn)掉片、脫片。

在同一時間段收集35例良性淋巴結(jié)反應(yīng)性增生的患者淋巴結(jié)標(biāo)本作對照觀察（因反復(fù)咳嗽，頸部包塊疼痛等原因就診的患者），男17例，女18例，年齡14～69歲，平均44歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①因反復(fù)咳嗽，頸部包塊疼痛等原因就診的患者，經(jīng)淋巴結(jié)涂片病理活檢不符合彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的淋巴結(jié)；②取材良好，無污染；③淋巴結(jié)蠟塊完整，可重復(fù)切片；④切片后應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法染色效果好的淋巴結(jié)組織樣本。排除標(biāo)準(zhǔn)：因有文獻(xiàn)報道腎素血管緊張素系統(tǒng)的表達(dá)可促進(jìn)血管新生，可能與VEGF生成水平有關(guān)，故對照組所有患者排除以下情況：①排除高血壓、糖尿病、心力衰竭、嚴(yán)重的肝腎疾病等與腎素血管緊張素（RAS）有關(guān)的疾病，無浮腫、脫水。②排除服用ACEI（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑）、ARB（血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑）類藥或停用1周以內(nèi)的患者，服用可能影響RAS藥物（兩性霉素B、β受體阻滯劑）的患者；②取材差，淋巴結(jié)組織少；③淋巴結(jié)蠟塊不完整，不能切片或切片后，貼片不理想。④染色效果差，免疫組化過程中出現(xiàn)掉片，脫片。

全部標(biāo)本均為常規(guī)用10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的歸檔蠟塊。連續(xù)4 μm切片，分別行免疫組化染色。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑 兔抗人VEGF多克隆抗體；PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒；兔抗人FⅢ因子多克隆抗體；鼠抗人Bcl-2單克隆抗體，均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 免疫組化染色方法 ①石蠟切片至水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。②進(jìn)行高壓熱修復(fù)抗原，20 min后冷卻至室溫。③3% H2O2室溫避光孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗，2 min×3次。④分別滴加適量的兔抗人VEGF多克隆抗體、兔抗人FⅧ因子多克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體工作液，37℃孵育2 h，PBS沖洗，2 min×3次。⑤滴加聚合酶輔助劑于37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次。⑥滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔多聚體試劑于37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次。⑦PBS沖洗，2 min×3次。⑧加DAB顯色劑顯色；⑨自來水充分沖洗、蘇木精襯染、脫水透明、中性樹脂封片。均以胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕黃色細(xì)顆粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)0.01 mmol/LPBS代替一抗作為陰性對照；省略一抗為空白對照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

VEGF、Bcl-2陽性染色定位于細(xì)胞漿，大多呈彌漫分布，呈棕黃色顆粒，隨機(jī)選擇10個高倍視野，取其平均值計算陽性細(xì)胞數(shù)。FⅧ因子的染色結(jié)果用于計數(shù)微血管密度（microvessel density，MVD）。以微血管計數(shù)代表血管新生，先用低倍（×100）鏡觀察，尋找微血管最多的熱點(diǎn)區(qū)域，然后用高倍鏡（×400）計數(shù)5個視野，求其平均值作為MVD。微血管可為單個或一簇棕色的細(xì)胞，可有或無管腔。凡血管直徑大于8個紅細(xì)胞或血管壁帶有明顯肌層及纖維硬化，炎癥及壞死區(qū)的微血管均不能計入總數(shù)[5]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有資料均用SPSS19.0 for windows統(tǒng)計學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料組間比較采用t 檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，Bcl-2、微血管密度與血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)采用直線相關(guān)分析，即Pearson法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組與對照組Bcl-2、VEGF及MVD陽性率的測定

2.1.1 Bcl-2蛋白陽性率測定 Bcl-2蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組為（78.88±4.15）%，對照組為（14.52±3.43）%，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組明顯高于對照組（P<0.01），見封三圖1～4。

2.1.2 VEGF陽性率的測定 VEGF表達(dá)于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組為（56.88±3.15）%，對照組為（11.53±2.03）%，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組明顯高于對照組（P<0.01），見封三圖5～8。

2.1.3 MVD的測定 在免疫組織化學(xué)的結(jié)果中，可見淋巴結(jié)中微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿被染成棕黃色，多數(shù)血管具有明顯的管腔， 部分為無管腔的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)塊和單個內(nèi)皮細(xì)胞。MVD 結(jié)果顯示，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組為（20.83±4.37）/×400倍視野，對照組為（5.84±1.25）/×400倍視野，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組明顯高于對照組（P<0.01），見封三圖9～12。

2.2 Bcl-2 陽性率測定、MVD、VEGF含量相關(guān)比較

在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組，MVD與VEGF呈正相關(guān)（r=0.745，P<0.01），Bcl-2蛋白陽性率與VEGF呈正相關(guān)（r=0.762，P<0.01），Bcl-2 蛋白陽性率與 MVD 呈正相關(guān)（r=0.831，P<0.01）。

2.3免疫組化結(jié)果

3 討論

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤占臨床所有B細(xì)胞淋巴瘤的50%左右，占成人非霍奇金淋巴瘤（non Hodgkin's lymphomas，NHL）的30%～40%，是NHL中最常見的一個類型[6，7]。它的治療歷經(jīng)了幾十年的轉(zhuǎn)變，從單一放療到目前的放、化療相結(jié)合方案，但部分患兒治療后緩解情況仍不理想。因此尋找合適的標(biāo)志物進(jìn)行合理分析和預(yù)后評估，對臨床治療加以指導(dǎo)，具有重要意義。

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤在臨床表現(xiàn)、組織形態(tài)、預(yù)后等多方面有很大異質(zhì)性及侵襲性，屬中、高度惡性腫瘤[8]。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤可見于各個不同年齡階段，具有隨年齡的增長而發(fā)病率逐漸升高的趨勢，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)男性略高于女性。DLBCL可以是原發(fā)，也可以是由其他類型的侵襲性淋巴瘤如邊緣區(qū)淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤（follicular lymphomas，F(xiàn)Ls）或白血病（如慢性淋巴細(xì)胞性白血?。┺D(zhuǎn)化而來[9]。DLBCL是以無痛性、進(jìn)行性淋巴結(jié)腫大（最常見為頸部淋巴結(jié)、鎖骨上淋巴結(jié)和腋窩淋巴結(jié)）為首要臨床表現(xiàn)，當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)癥狀后，有些已經(jīng)到了晚期，例如發(fā)生于胸、腹腔臟器（肝臟、脾臟、胃腸道、甲狀腺、扁桃體等）的腫大淋巴結(jié)壓迫臟器而出現(xiàn)聲音嘶啞、吞咽困難、呼吸困難等相應(yīng)癥狀時，晚期患者還可出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、盜汗、消瘦等全身癥狀。該型淋巴瘤臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，病情進(jìn)展迅速且缺乏規(guī)律，同時容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故預(yù)后較差[10]。

目前研究結(jié)果表明Bcl-2蛋白在臨床分期和免疫類型中可以獨(dú)立作為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后因子[11-12]。Bcl-2基因是一種原癌基因，能抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白是Bcl-2致癌基因的產(chǎn)物，它既參與抑制細(xì)胞凋亡，也參與細(xì)胞增生的調(diào)控過程，是重要的細(xì)胞凋亡基因及調(diào)節(jié)蛋白，對于延長細(xì)胞壽命起重要作用。本實驗研究顯示Bcl-2陽性表達(dá)顯著高于對照組。進(jìn)一步證實了基因的紊亂在DLBCL的發(fā)病中起重要作用。Bcl-2基因在腫瘤中可過度表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡可能與以下幾個方面有關(guān)：①Bcl-2蛋白可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管中Ca2+的釋放，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而抑制凋亡[13]；②H2O2在Bcl-2半胱氨酸氧化作用中作為一個潛在的因素直接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[14]；也有學(xué)者認(rèn)為Bcl-2可通過抗氧化劑或抑制氧自由基的產(chǎn)生而發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡的功能[15]；③Bax系Bcl-2家族中最具代表性的促細(xì)胞凋亡蛋白，當(dāng)細(xì)胞中Bcl-2增多時，則易與Bax形成異源二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡，Bax可對Bcl-2表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，其表達(dá)水平增加可拮抗Bcl-2的作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]，相反則抑制細(xì)胞凋亡；④目前研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2半胱氨酸可通過ERK信號對體外細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，在免疫沉淀作用和共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)Bcl-2與胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2形成Bcl-2-ERK復(fù)合物而抑制細(xì)胞凋亡，這種相互作用是由Bcl-2半胱氨酸調(diào)節(jié)的。但因在DLBCL的分型中表達(dá)情況不同，故DLBCL患者可出現(xiàn)不同的臨床表現(xiàn)，從而在發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因異常表達(dá)時，可提示Bcl-2基因表達(dá)可以用來作為DLBCL的不良臨床過程、療效差的指標(biāo)。同樣國外大量研究顯示，MYC和Bcl-2高表達(dá)，提示彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后較差[17-18]。

腫瘤的發(fā)生需要血管形成，血管形成在腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移方面均起著重要的作用。而腫瘤血管的新生是一個十分復(fù)雜的過程，Sharma S等[19]指出MVD最重要的價值在于能夠反映一些實體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲，并且是預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)和生存的一個重要指標(biāo)。目前用來判斷預(yù)測 DLBCL緩解情況的結(jié)果表明DLBCL與新生血管之間存在密切的關(guān)系。血管新生在腫瘤的發(fā)病過程中起重要作用。但卻是一個涉及多種細(xì)胞多種分子的復(fù)雜過程。血管新生存在多種的病理生理過程，在惡性腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。腫瘤的侵襲播散與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和腫瘤的血管生成密切相關(guān)。本實驗也發(fā)現(xiàn)DLBCL患者的淋巴結(jié)病理組織切片中腫瘤細(xì)胞均大量增多，病理切片中有核細(xì)胞數(shù)及微血管數(shù)增生活躍，盡管增生程度有所不同，但均高于對照組。血管新生受多種因子調(diào)控，其中功能最強(qiáng)、特異性最高的是血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），它能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和血管構(gòu)建、遷移，增加血管通透性[20]。除決定腫瘤血管生成外，VEGF還具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠降低機(jī)體內(nèi)的免疫監(jiān)視功能，從而促進(jìn)免疫逃逸[21，22]。研究[23]證實：高度惡性的腫瘤細(xì)胞中多存在VEGF高表達(dá)和自分泌機(jī)制，即腫瘤組織分泌VEGF，而VEGF又通過促進(jìn)腫瘤組織新生血管的生成，加速腫瘤生長。結(jié)內(nèi)惡性淋巴瘤的部分研究[24]顯示了惡性淋巴瘤細(xì)胞中VEGF對推測預(yù)后有意義。但目前PGI-DLBCL與VEGF相關(guān)性的研究較少。鏡下觀察結(jié)果顯示：VEGF既表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，也表達(dá)于其周圍組織，說明腫瘤及其周圍細(xì)胞均能分泌VEGF[25]，考慮隨著腫瘤生長活躍，腫瘤內(nèi)血管顯著增生，血管新生腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)和物質(zhì)代謝依賴于微血管，而MVD是反映血管增生及代謝活躍的重要指標(biāo)。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)，并用FⅧ因子標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，對MVD進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組均明顯高于對照組，而且VEGF和MVD存在正相關(guān)，這與國內(nèi)外多數(shù)學(xué)者報道相一致，表明血管新生在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生過程中具有重要作用，血管新生程度高，則疾病進(jìn)展快，預(yù)后相對較差，與繼往研究[26]結(jié)果相仿。以上結(jié)果表明DLBCL與新生血管之間存在密切關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者Bcl-2蛋白、MVD、VEGF 陽性表達(dá)均明顯高于對照組，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。且結(jié)果MVD與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，Bcl-2蛋白陽性表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，Bcl-2蛋白陽性表達(dá)與MVD表達(dá)呈正相關(guān)。通過對這三者進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析，臨床中我們也發(fā)現(xiàn)在治療Bcl-2陽性的DLBCL患者時，化療后病情會反復(fù)，考慮應(yīng)給予更加強(qiáng)烈的化療方案，以取得更高的緩解率。Pidgeon CP等[27]發(fā)現(xiàn)，VEGF的表達(dá)促進(jìn)了癌細(xì)胞中Bcl-2的高表達(dá)，而抗VEGF抗體抑制了Bcl-2的高表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中，VEGF的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖能力及侵襲能力，VEGF的高表達(dá)，可促進(jìn)Bcl-2蛋白高表達(dá)，同時加上本身促血管生成的作用，可降低彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞凋亡，從而增加彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的惡性程度，既而增加了彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的治療難度。

綜上所述，本研究認(rèn)為，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的不同分型中，促血管新生的調(diào)節(jié)因子的分泌水平不同，但發(fā)現(xiàn)淋巴瘤中仍有較多血管新生，因本實驗樣本含量少，尚有待于更多的樣本去研究。

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（收稿日期：2016-08-23）