任銳 戴鵬輝 曹福祥 董旭杰 李萌
(中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,長沙 410004)
珙桐CAC基因的克隆及其作為內(nèi)參基因的評價
任銳 戴鵬輝 曹福祥 董旭杰 李萌
(中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,長沙 410004)
從珙桐(Davidia involucrata Baill.)中克隆到一個編碼網(wǎng)格蛋白銜接蛋白復(fù)合物(Clathrin adaptor complexes,CAC)的基因,命名為DiCAC(GenBank登錄號為KX268525)。該基因開放閱讀框全長1 317 bp,編碼438個氨基酸。同源序列比對與聚類分析表明,該基因與其它15種植物的CAC氨基酸序列的相似度達(dá)到94%以上,其中與葡萄CAC的氨基酸序列同源性最高。為評價該基因作為珙桐內(nèi)參基因的可行性,結(jié)合5個珙桐管家基因(ACT7、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA),采用半定量PCR和實時熒光定量PCR對DiCAC基因在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析,并與常見管家基因的穩(wěn)定性進(jìn)行比較,結(jié)果表明,該基因在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中均為穩(wěn)定表達(dá),且表達(dá)穩(wěn)定性優(yōu)于常見管家基因,可以作為相關(guān)基因表達(dá)研究中的內(nèi)參基因。首次克隆到珙桐CAC基因,并且明確了其作為內(nèi)參基因的可行性,為深入研究珙桐相關(guān)基因的表達(dá)分析提供了候選內(nèi)參基因資源。
DiCAC;內(nèi)參基因;苞片;珙桐
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,基因表達(dá)分析在發(fā)現(xiàn)和預(yù)測新基因及其功能、探究基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等研究中日趨重要。實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的核酸定量技術(shù),具有重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強、高通量等特點,已成為分子生物學(xué)研究中檢測基因表達(dá)水平的一種重要方法[1]。在qPCR分析過程中,RNA的質(zhì)量、cDNA的質(zhì)量與起始濃度、擴(kuò)增效率等都會對結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響,因此,必須選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[2]。理想內(nèi)參基因應(yīng)該在特定試驗條件下的所有細(xì)胞或組織中均相對穩(wěn)定地表達(dá),不會受到任何內(nèi)源性或外源性因素的影響。常用的內(nèi)參基因主要有肌動蛋白基因(ACT)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(EF1α)、α/β微管蛋白基因(TUA/ TUB)、18S/25S核糖體RNA基因(18S/25S rRNA)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)等管家基因。近年來隨著基因芯片技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序等研究的深入,新的內(nèi)參基因也不斷被挖掘,如網(wǎng)格蛋白銜接蛋白復(fù)合物基因(CAC)、SAND蛋白家族基因(SAND)、PPR蛋白家族基因(PPR)、F-box蛋白家族基因(F-box)、ABC轉(zhuǎn)運因子基因等[3-5]。但是,大量研究表明,隨著研究對象的不同或者試驗條件的變化,沒有任何一種內(nèi)參基因的表達(dá)是始終穩(wěn)定的,即內(nèi)參基因的選擇不存在通用性[6]。因此,在研究目標(biāo)基因的表達(dá)情況時,研究者必須首先在具體試驗條件下對內(nèi)參基因進(jìn)行篩選與驗證,然后再選擇合適的內(nèi)參基因用于校準(zhǔn),這是保證qPCR分析結(jié)果準(zhǔn)確性的重要前提。
珙桐(Davidia involucrata Baill.),又名鴿子樹,為珙桐科珙桐屬落葉喬木,是我國特有的單型屬珍稀孑遺植物,屬于國家Ⅰ級保護(hù)植物[7]。在我國,珙桐主要分布于四川、重慶、湖北、貴州、湖南、云南、甘肅等省市。珙桐是著名觀賞樹種,具有一些獨特的生物學(xué)性狀,如圓形的頭狀花序、對生的白色葉狀苞片等。對珙桐獨特的生物學(xué)表型展開研究,從分子生物學(xué)水平上闡述其特異器官發(fā)育的調(diào)控規(guī)律,尋找關(guān)鍵調(diào)控基因,是珙桐分子生物學(xué)研究的重要方向。目前,有關(guān)珙桐中關(guān)鍵基因的克隆,基因的表達(dá)模式分析及功能研究等相對較少,而在已有的少量報道中,均選擇常見管家基因(如ACT、18S rRNA等)作為內(nèi)參基因,但所選用基因是否適合作為該研究中的內(nèi)參基因,尚缺乏一定理論依據(jù)[8,9]。因此,在珙桐分子生物學(xué)研究中,需要發(fā)掘更多具有較高表達(dá)穩(wěn)定性的內(nèi)參基因,這對于提高珙桐基因表達(dá)研究的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。
CAC(Clathrin adaptor complexes), 即 AP2M(Adaptor protein-2 Mu-adaptin),是細(xì)胞中的一類銜接蛋白(Adaptor protein,AP)。銜接蛋白指在細(xì)胞內(nèi)信號傳遞過程中,在蛋白質(zhì)間起連接作用的一類蛋白質(zhì),進(jìn)化上比較保守。植物中共有5種類型的AP復(fù)合體,即AP-1、AP-2、AP-3、AP-4、AP-5,每個AP復(fù)合體均由2個大亞基(α和β)、一個中亞基(μ)和一個小亞基(σ)組成。其中,AP-2復(fù)合體存在于質(zhì)膜上,在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的質(zhì)膜內(nèi)吞過程中發(fā)揮重要作用[10,11]。植物中對CAC基因的研究還不夠深入,有關(guān)其具體生物學(xué)功能的報道也較少。但近年來有研究表明,在一些植物中,CAC可作為特定條件下的內(nèi)參基因應(yīng)用于基因表達(dá)分析中。例如,Czechowski等[3]利用擬南芥Affymetrix ATH1全基因組基因芯片數(shù)據(jù),篩選出了在擬南芥不同組織以及非生物脅迫下均能穩(wěn)定表達(dá)的22個基因,并結(jié)合5個管家基因(ACT2、EF-1α、GAPDH、UBQ10、UBC),對它們的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價,結(jié)果發(fā)現(xiàn),篩選出的新內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性普遍優(yōu)于管家基因,并且新內(nèi)參基因CAC(AT5G46630)具有較高的表達(dá)穩(wěn)定性。隨后,在番茄、蕎麥、竹子、鷹嘴豆、西瓜等植物中的相關(guān)研究也表明,CAC可作為內(nèi)參基因使用[12-16]。
目前,很多植物的基因表達(dá)分析中都選用了CAC作為內(nèi)參基因,而有關(guān)珙桐CAC基因的研究尚未見報道。為此,本研究克隆珙桐CAC基因,并對其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。同時,結(jié)合5個管家基因(ACT7、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA),利用半定量PCR、qPCR以及內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析軟件探討DiCAC在珙桐不同組織的表達(dá)穩(wěn)定性。同時,白色苞片是珙桐代表性狀,苞片的發(fā)育機制研究是本課題組今后的研究重點,因此也對DiCAC在不同發(fā)育階段苞片中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析,旨在為珙桐分子生物學(xué)研究提供新的、穩(wěn)定的內(nèi)參基因資源,為進(jìn)一步研究珙桐的基因表達(dá)模式,揭示珙桐苞片發(fā)育的分子機制奠定理論基礎(chǔ)。
1.1 材料
本研究供試材料為珙桐,采集地位于湖南省張家界市桑植縣八大公山國家級自然保護(hù)區(qū),采集時間為2016年4月中旬至7月下旬。廖春林對采集樣品進(jìn)行了鑒定,確定采集材料均為珙桐樣品,所有采集的珙桐樣品均保存于本實驗室。本研究中,主要選擇保護(hù)區(qū)內(nèi)樹齡20年左右,能穩(wěn)定開花的珙桐植株作為采集對象,分別采集以下兩組樣品,第一組,不同組織樣品,共8種:根、莖、芽、葉片、苞片(中期)、雄蕊、果肉、種子;第二組,不同發(fā)育階段苞片樣品,參照Vekemans等[8]的分類方法具體分為:幼期苞片(綠色)、前期苞片(淺綠色)、中期苞片(純白色)、后期苞片(淺黃色)、晚期苞片(黃色待脫落)。每份樣品包括3個生物學(xué)重復(fù),所有樣品采集后立即置于液氮中速凍保存,然后置于-70℃超低溫冰箱中貯藏備用。
1.2 方法
1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 分別稱取適量凍存珙桐樣品,于盛有液氮的研缽中迅速研磨至粉末,按照E.Z.N.A.TM Plant RNA ProtocolⅡ(Omega)法提取各樣品的總RNA,并采用RQ1 RNase-Free DNase(Promega)去除基因組DNA。隨后,按照5×PrimeScriptRTMaster Mix(PerfeCt Real Time)試劑盒(TaKaRa)操作說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,紫外分光光度計檢測所得cDNA的濃度,并將各樣品的cDNA濃度統(tǒng)一至100 ng/μL,分別用于目標(biāo)基因克隆、半定量PCR和qPCR的表達(dá)分析。
1.2.2 目標(biāo)基因克隆及序列分析 將TAIR(The Arabidopsis Information Resource)數(shù)據(jù)庫中擬南芥CAC基因(登錄號為AT5G46630)的核酸序列與本研究小組前期構(gòu)建的珙桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[17]中的基因序列進(jìn)行本地BLAST比對,獲得一條同源性較高的片段c44712.graph_c0。根據(jù)其ORF序列信息設(shè)計基因特異性擴(kuò)增引物DiCAC-F1(5'-GGAAAGATGCCGGTGGCTGCT-3')和DiCAC-R1(5'-CTAGGACCTAATCTCATAT GAACCA-3')。以珙桐苞片cDNA為模板,PCR擴(kuò)增程序如下:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s,51℃退火45 s,72℃延伸2 min,35個循環(huán);72℃延10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,切膠回收純化,與pMD18-T載體(TaKaRa)連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽性克隆送往鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。
利用ProtParam、ProtScale、Psort等在線軟件對該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行組成成分、理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位預(yù)測等初步分析;利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列的比對及同源性分析;利用MEGA 5.0軟件Neighbor joining(NJ)算法進(jìn)行聚類分析。
1.2.3 目標(biāo)基因及5種管家基因作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價 從珙桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得c44712. graph_c0與5個管家基因(ACT7、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA)的序列信息,根據(jù)qPCR引物設(shè)計原則,通過網(wǎng)站IDTdna(http://eu.idtdna.com/pri merquest)設(shè)計各內(nèi)參基因的qPCR引物(表1),引物序列由上海生工公司合成。qPCR反應(yīng)體系為10 μL,包括SYBR Green Master Mix(High ROX)(Biotool)5 μL、2 μmol/L Forward Primer 2 μL、2 μmol/L Reverse Primer 2 μL、100 ng/μL cDNA 1 μL;反應(yīng)程序為:95℃ 5 min,95℃ 15 s,60℃ 40 s,40 cycles。
將所得qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,利用在線分析軟件ReFinder(http://fulxie.0fees.us/?type=reference&i=1)分別對此6個內(nèi)參基因在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價。ReFinder整合了4種常用于內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價的方法:即geNorm、Normfinder、BestKeeper和ΔCt值分析法[18-21]。ReFinder程序首先分別用上述 4種方法對所有內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價并給出排名,然后計算各基因由不同方法所得的排名的幾何平均值,以此作為綜合評價指數(shù),指數(shù)數(shù)值越小,表明基因表達(dá)越穩(wěn)定[22]。
1.2.4 目標(biāo)基因表達(dá)分析 在珙桐不同組織中,以EF1a(ReFinder軟件分析結(jié)果中EF1a的表達(dá)穩(wěn)定性綜合排名位于最末)作為對照,進(jìn)行DiCAC的半定量PCR及qPCR表達(dá)分析;在不同發(fā)育階段苞片中,以GAPDH(ReFinder軟件分析結(jié)果中GAPDH的表達(dá)穩(wěn)定性綜合排名位于最末)作為對照,進(jìn)行DiCAC的半定量PCR及qPCR表達(dá)分析。qPCR表達(dá)分析計算公式為:Q(相對表達(dá)量)=2ΔCt,ΔCt=Ct(葉芽)-Ct(其它組織)或ΔCt=Ct(幼期苞片)-Ct(其它苞片),應(yīng)用SPSS 17.0軟件對基因的相對表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析。半定量PCR的基因引物序列及擴(kuò)增程序,見表2。
表1 內(nèi)參基因的qPCR引物序列及擴(kuò)增特性
表2 基因的半定量PCR引物序列及擴(kuò)增程序
圖1 DiCAC基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖
2.1 珙桐DiCAC基因全長cDNA克隆與序列分析
以珙桐葉片cDNA為模板,對珙桐CAC基因的ORF序列進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)在接近1 500 bp處有一條清晰亮帶(圖1)。經(jīng)測序,該序列長度為1 317 bp,編碼438個氨基酸,編碼產(chǎn)物與擬南芥CAC基因同源性達(dá)94%,確認(rèn)其為一個珙桐的CAC基因,將其命名為DiCAC,已在GenBank上注冊,登錄號為KX268525。
對DiCAC編碼的氨基酸序列進(jìn)行初步的理化性質(zhì)分析。該氨基酸的相對分子量大小約為49.20 kD,理論等電點為9.34。氨基酸組成中,含量最多的3種氨基酸依次為纈氨酸(10.3%)、亮氨酸(8.2%)、賴氨酸(8.0%),且堿性氨基酸(賴氨酸8.0%,精氨酸5.3%、組氨酸0.2%)含量略多于酸性氨基酸(天冬氨酸3.9%、谷氨酸6.2%)。總平均親水系數(shù)為-0.039,其中,第23位的酪氨酸親水性最強,第70位的異亮氨酸疏水性最強。亞細(xì)胞定位預(yù)測其有56.5%的幾率定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。
2.2 珙桐DiCAC基因的同源性分析與聚類分析
將DiCAC基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast X同源性比對分析,結(jié)果表明,DiCAC氨基酸序列與葡萄(Vitis vinifera)、棗(Ziziphus jujuba Mill.)、甜橙(Citrus sinensis)、可可(Theobroma cacao)、蓖麻(Ricinus communis)、 蓮(Nelumbo nucifera) 的CAC氨基酸序列相似度較高,同源性達(dá)到97%,其次,與胡楊(Populus euphratica)、無油樟(Amborella trichopoda)、 蘋 果(Malus x domestica)、 煙 草(Nicotiana tabacum Linn.)、大豆(Glycine max)的同源性達(dá)到96%,與巨桉(Eucalyptus grandis)、番茄(Solanum lycopersicum)的同源性達(dá)到96%,與擬南芥(Arabidopsis thaliana)的同源性達(dá)到94%。說明本研究中克隆到的基因為珙桐中CAC基因,且該基因在木本植物中較為保守。
將DiCAC氨基酸序列與篩選出的同源性較高的10種植物CAC氨基酸序列進(jìn)行多重比較,結(jié)果(圖2)表明,不同植物的CAC氨基酸序列只在個別位置有突變發(fā)生,其中,珙桐DiCAC基因與其它10種植物CAC基因編碼的氨基酸共有8個位點的差異,分別是37位的M(甲硫氨酸)/I(異亮氨酸)、38位的H(組氨酸)/N(天冬酰胺)、80位的C(半胱氨酸)/S(絲氨酸)、308位的V(纈氨酸)/I(異亮氨酸)、388位的T(蘇氨酸)/N(天冬酰胺)0、389位的R(精氨酸)/K(賴氨酸)、431位的A(丙氨酸)/G(甘氨酸)、438位的C(半胱氨酸)/S(絲氨酸)。
為了進(jìn)一步探討珙桐DiCAC基因與其它植物CAC基因之間的進(jìn)化關(guān)系,選取一致性較高的16種植物的CAC基因的編碼產(chǎn)物氨基酸序列進(jìn)行聚類分析,結(jié)果(圖3)表明,DiCAC與葡萄(Vitis vinifera)CAC蛋白的親緣關(guān)系最近,其次與可可(Theobroma cacao)CAC蛋白具有相對較近的親緣關(guān)系,而與巨桉(Eucalyptus grandis)、煙草(Nicotiana tabacum Linn.)、 番 茄(Solanum lycopersicum) 等其它植物CAC蛋白組成的小進(jìn)化群體則親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
2.3 珙桐DiCAC基因及5種管家基因的相對表達(dá)豐度分析
表1中各基因引物的擴(kuò)增效率大于94%,相關(guān)系數(shù)R2>0.98,可知各基因引物的擴(kuò)增效率良好,能用于qPCR分析?;虻腃t值與表達(dá)豐度成反比,Ct值越小,基因的表達(dá)豐度越高,反之亦然。首先通過qPCR檢測6個內(nèi)參基因在珙桐樣品中的的Ct值,然后對它們的表達(dá)豐度進(jìn)行比較。結(jié)果表明,在不同組織中,6個基因當(dāng)中18S rRNA的Ct值在12-24之間,表達(dá)豐度最高,CAC的Ct值在26-30之間,表達(dá)豐度最低(圖4-A);在不同發(fā)育階段的苞片中,6個基因當(dāng)中18S rRNA的Ct值在12-18之間,表達(dá)豐度最高,β-TUB的Ct值在28-32之間,表達(dá)豐度最低,CAC的Ct值在27-29之間,表達(dá)豐度僅略高于β-TUB(圖4-B)。
此外,通過比較發(fā)現(xiàn),在珙桐兩組樣品中,CAC的Ct值在不同樣品間的變化范圍均相對較小,數(shù)據(jù)較為集中,尤其是在不同發(fā)育階段的苞片樣品中,Ct值的波動范圍更小;而5個管家基因的Ct值在不同樣品間變化范圍相對較大,數(shù)據(jù)較為分散。初步判斷可知,珙桐CAC基因在不同組織與不同發(fā)育階段苞片中的的表達(dá)均較為穩(wěn)定(圖4)。
2.4 珙桐DiCAC基因及5種管家基因作為內(nèi)參基因
的穩(wěn)定性評價
利用ReFinder軟件,對6個內(nèi)參基因在珙桐不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價,結(jié)果顯示(表3),在ΔCt值分析法與NormFinder算法結(jié)果中,穩(wěn)定性排名第一的均為ACT7,排名第六的均為EF1a;在BestKeeper與Genorm算法結(jié)果中,穩(wěn)定性排名第一的均為CAC,排名第六的分別為18S rRNA和EF1a;不同算法結(jié)果中,6個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名并不完全一致,經(jīng)采用幾何平均值法綜合分析后,基因的表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為:CAC>ACT7>β-TUB>18S rRNA>GAPDH>EF1a。
利用ReFinder軟件,對6個內(nèi)參基因在珙桐不同發(fā)育階段苞片中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價,結(jié)果顯示(表4),除在ΔCt值分析法算法結(jié)果中穩(wěn)定性排名第一的為ACT7外,在其余的BestKeeper、NormFinder、Genorm 3種算法結(jié)果中,穩(wěn)定性排名第一的均為CAC;另外,在ΔCt值分析法、BestKeeper、NormFinder、Genorm 4種算法結(jié)果中,穩(wěn)定性排名第六的均為GAPDH;同樣,4種算法結(jié)果中,6個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名并完全一致,經(jīng)采用幾何平均值法綜合分析后,基因的表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為:CAC>ACT7>18S rRNA> EF1a>β-TUB>GAPDH。對6個內(nèi)參基因分別在珙桐兩組樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性綜合排名進(jìn)行比較,分析可知,在此兩組樣品中,基因表達(dá)穩(wěn)定性排名居于首位的均為CAC,而穩(wěn)定性排名最末位的為不同基因,在不同組織中為EF1a,在不同發(fā)育階段苞片中為GAPDH。
圖2 珙桐CAC氨基酸序列與其它植物CAC氨基酸序列的多重比對分析
圖3 珙桐CAC氨基酸序列與其它植物CAC氨基酸序列的聚類分析
圖4 6個內(nèi)參基因在珙桐不同樣品中的Ct值分布
2.5 珙桐DiCAC基因表達(dá)分析
CAC和EF1a基因在洪洞不同組織中的半定量PCR電泳結(jié)果表明(圖5):對照基因EF1a在珙桐莖、芽、苞片(中期)、種子中的表達(dá)量較高,而在根、葉片、雄蕊、果肉中的表達(dá)量較低;不同于EF1a,DiCAC在8個組織中的表達(dá)量基本一致。在qPCR中,以芽的表達(dá)量為1計算,相對定量結(jié)果表明:對照基因EF1a在珙桐莖、苞片、種子中的表達(dá)量較高,2.5左右,芽和葉片中次之,而在根、雄蕊、果肉中表達(dá)量較低,0.5左右;相比于EF1a,DiCAC在珙桐各組織中的表達(dá)量基本一致,均為1左右,差異不顯著。
DiCAC和GAPDH基因在珙桐不同發(fā)育階段苞片中半定量PCR和qPCR表達(dá)分析。半定量PCR電泳結(jié)果表明(圖6):對照基因GAPDH在發(fā)育幼期、前期、中期的苞片中表達(dá)量較高,而在發(fā)育后期、晚期的苞片中表達(dá)量較低;與GAPDH不同,DiCAC在各發(fā)育階段的苞片中表達(dá)量無明顯差異。在qPCR中,以芽的表達(dá)量為1計算,相對定量結(jié)果表明:GAPDH在發(fā)育幼期的苞片中表達(dá)量較高,此后,隨著苞片發(fā)育不斷成熟,表達(dá)量逐漸降低,晚期苞片中表達(dá)量約降至0.1;不同于GAPDH,DiCAC在不同發(fā)育階段苞片中的表達(dá)量基本保持一致,均在1左右。綜上可知,DiCAC在珙桐不同組織和不同發(fā)育階段苞片中均呈穩(wěn)定表達(dá)模式。
表3 ReFinder軟件分析珙桐不同組織中6個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性
表4 ReFinder軟件分析珙桐不同發(fā)育階段苞片中6個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性
圖5 CAC和EF1a在珙桐不同組織中的表達(dá)模式
圖6 DiCAC和GAPDH在珙桐不同發(fā)育階段苞片中的表達(dá)模式
CAC蛋白參與植物中許多重要的生命活動,其中,最主要的功能即是在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的質(zhì)膜內(nèi)吞過程中負(fù)責(zé)貨物蛋白的分揀、網(wǎng)絡(luò)蛋白和其他輔助蛋白的招募等,此外,也參與細(xì)胞生長發(fā)育、細(xì)胞信號傳導(dǎo)以及應(yīng)對外界環(huán)境的刺激等生命活動過程[23,24]。近年來的一些研究表明,CAC氨基酸序列高度保守,且表達(dá)量在不同細(xì)胞或組織中變化較小,可以作為某些植物基因表達(dá)分析中的內(nèi)參基因。例如,CAC在擬南芥、西紅柿與蕎麥的各組織器官、竹子的不同發(fā)育時期、西瓜果實發(fā)育的不同階段、鷹嘴豆非生物脅迫處理下表達(dá)都很穩(wěn)定,可作為內(nèi)參基因用于對目標(biāo)基因進(jìn)行校準(zhǔn)[3,12-16]。但目前有關(guān)珙桐CAC基因的研究尚未見報道。
本研究從珙桐中克隆到一個CAC基因,利用生物信息學(xué)手段分析了該基因氨基酸序列的組成成分以及一些理化性質(zhì),將其與擬南芥、葡萄、大豆、桃、芹菜等其它植物的CAC氨基酸序列特征進(jìn)行比較[25],結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同植物來源CAC氨基酸序列的組成成分及各類理化性質(zhì)較為相似,如氨基酸殘基數(shù)均為438個,相對分子質(zhì)量為49.20-49.40 kD,等電點為9.20-9.40,堿性氨基酸含量略多于酸性氨基酸,蛋白質(zhì)疏水性較強等。進(jìn)一步將珙桐DiCAC基因與葡萄、棗、胡楊、巨桉、擬南芥等其它植物CAC基因進(jìn)行同源性分析與聚類分析,結(jié)果表明,珙桐DiCAC基因編碼的氨基酸序列與其它植物CAC氨基酸序列雖有個別位點的差異,但整體上氨基酸序列相似度達(dá)到了94% 以上,可見珙桐DiCAC基因與其它植物,尤其是木本植物CAC基因的同源性較高。其中,與葡萄CAC氨基酸序列相似度為97%,同源性最高,親緣關(guān)系最近。綜上所述,基因序列和結(jié)構(gòu)較高的相似性說明本研究中克隆到的珙桐DiCAC基因準(zhǔn)確可靠。同時,不同植物的CAC基因編碼的氨基酸序列具有高度同源性,進(jìn)一步表明植物CAC基因高度保守,這與它參與植物的多種重要生命活動密切相關(guān)。
研究表明,不同物種間同源內(nèi)參基因的表達(dá)存在差異,即在某物種中表達(dá)穩(wěn)定性高的內(nèi)參基因在另一物種中的表達(dá)穩(wěn)定性并不一定高,甚至可能較差。例如,CAC基因在擬南芥與番茄的各組織中表達(dá)穩(wěn)定,可以作為內(nèi)參基因,但其在側(cè)柏、葡萄、柚木各組織中的表達(dá)穩(wěn)定性卻較差,不適合作為內(nèi)參基因[3,12,26-28]。因此,雖然不同植物間CAC基因具有較高的同源性,并且有報道表明CAC可作為擬南芥、番茄等植物中的內(nèi)參基因,但是,并不能就此認(rèn)為DiCAC同樣適合在珙桐中作為內(nèi)參基因使用。為此,本研究通過對DiCAC基因在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中的表達(dá)特性進(jìn)行分析,以判斷DiCAC作為內(nèi)參基因的可行性。在珙桐兩組樣品中,結(jié)合5個常用管家基因ACT7、EF1a、GAPDH、 β-TUB、18S rRNA,運用多種方法對包括DiCAC在內(nèi)的6個基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價。經(jīng)分析可知,雖然由于各方法的運算原理和判斷標(biāo)準(zhǔn)不完全相同,導(dǎo)致4種分析方法中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名存在一定差異,但是,整體排名結(jié)果基本一致,最終,綜合排名結(jié)果表明,DiCAC在珙桐不同組織與不同發(fā)育階段苞片中的表達(dá)穩(wěn)定性排名均居于首位,這說明相對于其它5個管家基因,DiCAC在珙桐不同樣品間表達(dá)更為穩(wěn)定。為了進(jìn)一步檢驗DiCAC的表達(dá)穩(wěn)定性,本研究結(jié)合半定量PCR與qPCR兩種方法對DiCAC分別在珙桐兩組樣品中的表達(dá)量進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DiCAC在兩組樣品中的表達(dá)量均基本一致,相反,分別作為對照的EF1a與GAPDH的表達(dá)量卻波動較大,此結(jié)果與ReFinder程序的分析結(jié)果基本吻合。因此,推斷DiCAC在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中均呈組成型表達(dá),作為此特定條件下的內(nèi)參基因是可行的。此外,在基因表達(dá)分析中,理想的內(nèi)參基因不僅表現(xiàn)為表達(dá)水平穩(wěn)定,而且要求其穩(wěn)定的表達(dá)量與目標(biāo)基因的表達(dá)量相近[29]。本研究發(fā)現(xiàn),DiCAC在珙桐不同組織與不同發(fā)育階段苞片中的表達(dá)豐度均較低,因此,推斷其更適合用于對表達(dá)豐度較低的目標(biāo)基因進(jìn)行校準(zhǔn)。
綜上所述,本研究首次克隆了珙桐CAC基因,并且對其在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中作為內(nèi)參基因的可行性進(jìn)行了評價。DiCAC的克隆不僅有效填補了珙桐中CAC基因研究的空白,豐富了植物CAC基因核酸數(shù)據(jù)庫,而且為深入研究珙桐相關(guān)基因的表達(dá)分析提供了參照序列和參考依據(jù),這將有助于提高基因表達(dá)分析結(jié)果的精確性。但是,DiCAC作為內(nèi)參基因是否同樣適用于珙桐的其它試驗條件中還有待于進(jìn)一步研究。
本研究從珙桐中克隆到一個編碼網(wǎng)格蛋白銜接蛋白復(fù)合物的基因DiCAC(GenBank登錄號為KX268525),該基因開放閱讀框全長1 317 bp,編碼438個氨基酸,與其他植物的CAC氨基酸序列相似度達(dá)到94% 以上,其中與葡萄CAC氨基酸序列的同源性最高。半定量PCR與實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明,DiCAC在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中表達(dá)均相對穩(wěn)定,且表達(dá)穩(wěn)定性優(yōu)于常見管家基因,可以作為珙桐相關(guān)基因表達(dá)研究中的內(nèi)參基因。
[1]Bustin SA, Benes V, Nolan T, et al. Quantitative real-time RT-PCR a perspective[J]. J Mol Endocrinol, 2015, 34(3):597-601.
[2]VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis[J]. Biotechniques, 2008, 44(5):619.
[3]Czechowski T, Stitt M, Altmann T, et al. Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis[J]. Plant Physiol, 2005, 139(1):5-17.
[4]Libault M, Thibivilliers S, Bilgin DD, et al. Identification of four soybean reference genes for gene expression normalization[J]. The Plant Genome, 2008, 1(1):44-54.
[5]Yang H, Liu J, Huang S, et al. Selection and evaluation of novel reference genes for quantitative reverse transcription PCR based on genome and transcriptome data in Brassica napus L. [J]. Gene, 2014, 538(1):113-122.
[6]袁偉, 萬紅建, 楊悅儉. 植物實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的特點及選擇[J]. 植物學(xué)報, 2012, 4:427-436.
[7]中國植被編委會中國植被[M]. 北京:科學(xué)出版社, 1980:298-299.
[8]Vekemans D, Viaene T, Caris P, et al. Transference of function shapes organ identity in the dove tree inflorescence[J]. New Phytol, 2012, 193(1):216-228.
[9]Lei N, Peng S, Niu B, et al. Molecular cloning and characterization of a novel microsomal oleate desaturase gene DiFAD2 from Davidia involucrata Baill. [J]. Biol Plantarum, 2010, 54(1):41-46.
[10]Motley AM, Berg N, Taylor MJ, et al. Functional analysis of AP-2 α and μ2 subunits[J]. Molecular Biology of the Cell, 2006, 17(12):5298-5308.
[11]Jackson LP, Kelly BT, McCoy AJ, et al. A large-scale conformational change couples membrane recruitment to cargo binding in the AP2 clathrin adaptor complex[J]. Cell, 2010, 141(7):1220-1229.
[12]Rodriguez EM, Borges AA, Borges-Perez A, et al. Selection of internal control genes for quantitative real-time RT-PCR studies during tomato development process[J]. BMC Plant Biol, 2008, 8(1):131.
[13]Demidenko NV, Logacheva MD, Penin AA. Selection and validation of reference genes for quantitative real-time PCR in buckwheat(Fagopyrum esculentum)based on transcriptome sequence data[J]. PLoS One, 2011, 6(5):e19434.
[14]Fan C, Ma J, Guo Q, et al. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in bamboo(Phyllostachys edulis)[J]. PLoS One, 2013, 8(2):e56573.
[15]Reddy DS, Bhatnagar-Mathur P, Reddy PS, et al. Identification and validation of reference genes and their impact on normalized gene expression studies across cultivated and wild cicer species[J]. PLoS One, 2016, 11(2):e0148451.
[16]Kong Q, Yuan J, Gao L, et al. Evaluation of appropriate reference genes for gene expression normalization during watermelon fruit development[J]. PLoS one, 2015, 10(6):e0130865.
[17]Li M, Dong XJ, Peng JQ, et al. De novo transcriptome sequencing and gene expression analysis reveal potential mechanisms of seed abortion in dove tree(Davidia involucrata Baill. )[J]. BMC Plant Biol, 2016, 16:82.
[18]Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biol, 2002, 3(7):RESEARCH0034.
[19]Andersen CL, Jensen JL, ?rntoft TF. Normalization of realtime quantitative reverse transcription-PCR data:a modelbased variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Res, 2004, 64(15):5245-5250.
[20]Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, et al. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity:BestKeeper Excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnol Lett, 2004, 26(6):509-515.
[21]Silver N, Best S, Jiang J, et al. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR[J]. BMC Mol Biol, 2006, 7(1):33.
[22] Chen D, Pan X, Xiao P, et al. Evaluation and identification of reliable reference genes for pharmacogenomics, toxicogenomics and small RNA expression analysis[J]. J Cell Physiol, 2011, 226(10):2469-2477.
[23]Lacruz RS, Brookes SJ, Wen X, et al. Adaptor protein complex2-mediated, clathrin-dependent endocytosis, and related gene activities, are a prominent feature during maturation stage amelogenesis[J]. Journal of Bone and Mineral Research, 2013, 28(3):672-687.
[24]Di Rubbo S, Irani NG, Kim SY, et al. The clathrin adaptor complex AP-2 mediates endocytosis of brassinosteroid insensitive1 in Arabidopsis[J]. The Plant Cell, 2013, 25(8):2986-2997.
[25]王廣龍, 王楓, 徐志勝, 等. 芹菜銜接蛋白基因AgMu2的克隆與表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報, 2014, 7:1369-1378.
[26]Chang E, Shi S, Liu J, et al. Selection of reference genes for quantitative gene expression studies in Platycladus orientalis(Cupressaceae)using real-time PCR[J]. PLoS One, 2012, 7(3):e33278.
[27]Reid KE, Olsson N, Schlosser J, et al. An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development[J]. BMC Plant Biology, 2006, 6:27.
[28]Galeano E, Vasconcelos TS, Ramiro DA, et al. Identification and validation of quantitative real-time reverse transcription PCR reference genes for gene expression analysis in teak(Tectona grandis L. f. )[J]. BMC Research Notes, 2014, 7:464.
[29]Gimeno J, Eattock N, Van Deynze A, et al. Selection and validation of reference genes for gene expression analysis in switchgrass(Panicum virgatum)using quantitative real-time RT-PCR[J]. PLoS One, 2014, 9(3):e91474.
(責(zé)任編輯 馬鑫)
Cloning of a CAC Gene in Dove Tree(Davidia involucrata Baill.)and Evaluating its Potential as a Novel Reference Gene
REN Rui DAI Peng-hui CAO Fu-xiang DONG Xu-jie LI Meng
(College of Life Science and Technology,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004)
In this research,a gene named as DiCAC(GenBank accession number KX268525),encoding the clathrin adaptor complexes(CAC),has been cloned from dove tree(Davidia involucrata Baill.). The sequence of DiCAC includes a ORF(open reading frame)of 1317 bp,which encodes a protein with 438 amino acids. Homologous alignment and cluster analysis show that DiCAC shared over 94% amino acid sequence identity with CAC genes in other 15 plants,and it has the highest amino acid homology with grape(Vitis vinifera)CAC gene. To evaluate the feasibility of using DiCAC as a reference gene in dove tree,combined with five housekeeping genes of dove tree(ACT7,EF1a,GAPDH,β-TUB and 18S rRNA),we analyzed the expression stability of DiCAC in different tissues and in bracts of different developmental stages. Furthermore,expression analysis of DiCAC detected by semi-quantitative PCR and qPCR showed that the expression levels of DiCAC are stable in both different tissues and bracts of different developmental stages. Remarkably,the expression of DiCAC showed more stability than the expression of common housekeeping genes. Therefore,it could be used as a reference gene of related gene expression research in dove tree. In this study,we have cloned the CAC gene from dove tree firstly and have confirmed the feasibility of its utilization as a reference gene. Our finding provides a novel candidate reference gene resources for the further research gene expression analysis in dove tree.
DiCAC;reference gene;bract;Dove tree(Davidia involucrata Baill.)
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.015
2016-09-12
中南林業(yè)科技大學(xué)博士后科研基金項目(0490016),中南林業(yè)科技大學(xué)青年基金項目(QJ201512)
任銳,女,碩士研究生,研究方向:分子生物學(xué)與基因工程;E-mail:18734891238@163.com
李萌,男,博士,研究方向:珙桐分子生物學(xué);E-mail:limeng0422@foxmail.com