張嵩柳溪林李萌常江高世奇胡盼柳增善

（1. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究所教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130062；2. 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春 130033）

重組毒素rCCK96-104PE38 靶向結(jié)腸癌生物特性研究

張嵩1柳溪林2李萌1常江1高世奇1胡盼1柳增善1

（1. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究所教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130062；2. 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春 130033）

旨在原核表達(dá)并純化新型重組毒素rCCK96-104PE38，驗(yàn)證其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的靶向殺傷作用。使用基因擴(kuò)增技術(shù)將反向編譯的膽囊收縮素CCK96-104與綠膿桿菌外毒素PE38融合，構(gòu)建原核表達(dá)載體。利用Ni-NTA親和層析進(jìn)行純化。通過(guò)結(jié)腸癌細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn)以及結(jié)腸癌裸鼠模型的治療驗(yàn)證rCCK96-104PE38的抗腫瘤能力。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的rCCK96-104PE38序列正確，成功利用pET-28a原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)。純化后的重組蛋白能夠在體外誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，并能抑制裸鼠模型體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)。成功制備高純度、無(wú)標(biāo)簽的rCCK96-104PE38重組免疫毒素，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抑制結(jié)腸癌的能力。

重組毒素；結(jié)腸癌；膽囊收縮素；綠膿桿菌外毒素

結(jié)腸癌是人類(lèi)高發(fā)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)，全球每年患結(jié)腸癌的病例超過(guò)100萬(wàn)人［1］。目前，結(jié)腸癌的治療手段以手術(shù)治療為主，輔以化療、放療等治療手段，針對(duì)結(jié)腸癌的常用抗腫瘤藥物包括5-Fu（5-氟尿嘧啶）、伊立替康、奧沙利鉑、卡培他濱等［2］，但術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)，且副作用不容忽視。近年來(lái)，基因治療藥物、免疫治療藥物等靶向治療藥物得到了快速發(fā)展［3］，為結(jié)腸癌的治療開(kāi)辟了新途徑。

分子靶向治療是以腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)的分子作為靶位，選擇針對(duì)性的阻斷劑，能夠作用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的信號(hào)傳導(dǎo)通路或誘導(dǎo)免疫因子識(shí)別并消滅腫瘤細(xì)胞等途徑，從而使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)變慢或者發(fā)展停止［4，5］。研究發(fā)現(xiàn)，在胃腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，膽囊收縮素2型受體（CCK2R）在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正常細(xì)胞，在部分結(jié)腸癌、大腸癌、胃癌細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)更加突出［6-9］，是結(jié)直腸癌診斷和治療的理想靶點(diǎn)。

本研究根據(jù)結(jié)腸癌與正常組織表面CCK2R數(shù)量與親和力的巨大差異，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建新型重組毒素rCCK96-104PE38，即截取全長(zhǎng)CCK的第96-104號(hào)氨基酸，反向重組后作為導(dǎo)向單元與具有高效細(xì)胞毒性的PE38（綠膿桿菌外毒素）結(jié)合，獲得可以靶向高效殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的分子藥物，并通過(guò)結(jié)腸癌體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)探索其靶向特性，為臨床前試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I和BamH I、低分子量蛋白Marker、DL2000核酸Marker、pMD-18T Kit、T4連接酶均購(gòu)自日本TaKaRa公司；膠回收Kit、質(zhì)粒小提Kit購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；卡那霉素、氨芐青霉素、IPTG購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；Ni-NTA親和層析介質(zhì)、Tricorn 10/150玻璃柱購(gòu)自瑞典GE公司；rTEV酶購(gòu)自北京索萊寶公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；熒光染料Dylight 488，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自上海艾博抗公司；PE38單克隆抗體3B9為本實(shí)驗(yàn)室制備；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞、裸鼠 pET-28a質(zhì)粒購(gòu)自德國(guó)Novagen公司；pET-rG17PE38重組質(zhì)粒、感受態(tài)BL21（DE3）PLysS、感受態(tài)DH5α、人肝細(xì)胞LO2、大腸癌細(xì)胞系SW116、結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT8、SW620、SW480均為本實(shí)驗(yàn)室保存，裸鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 rCCK96-104PE38原核表達(dá)菌株的構(gòu)建

1.2.1.1 引物 以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存到pET-rG17PE38為模板，利用PCR方法將反向的CCK96-104片段基因與PE38基因進(jìn)行融合，并引入了rTEV酶特異性切割位點(diǎn)，人工合成引物為：其中，下劃線(xiàn)分別為Nhe I和BamH I酶切位點(diǎn)。

1.2.1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物與pET-28a質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，然后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定雙酶切效果，并使用膠回收試劑盒回收目的基因和載體片段，使用T4連接酶水浴16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）PLysS感受態(tài)細(xì)胞中。

1.2.2 重組毒素 rCCK96-104PE38的表達(dá)與鑒定

1.2.2.1 低溫誘導(dǎo)表達(dá) 將重組菌按1∶100的比例接入LB培養(yǎng)基（Kana 50 ng/mL）中，于37℃ 7，1.5 h后，將培養(yǎng)箱溫度降至16℃ 6將培養(yǎng)箱溫度IPTG至終濃度0.1 mmol/L，搖培18 h。

1.2.2.2 Western blot 鑒定 將表達(dá)的rCCK96-104PE38重組蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳，再通過(guò)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜后，先后加入PE38的單克隆抗體3B9（本實(shí)驗(yàn)室制備），和HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色呈像。

1.2.3 重組毒素 rCCK96-104PE38的純化

1.2.3.1 Ni-NTA親和層析 使用?KTA蛋白純化儀進(jìn)行純化。首先用5-10個(gè)柱體積的Ni-NTA親和層析平衡緩沖液Buffer A（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，10%甘油，pH7.0）充分平衡Ni-NTA親和層析柱；將超聲上清注入緩慢注入層析柱，再用洗脫緩沖液Buffer B（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，10%甘油，pH7.0）調(diào)節(jié)混合液咪唑濃度按梯度洗脫下目的蛋白。

1.2.3.2 rTEV酶切除組氨酸標(biāo)簽 加入rTEV酶對(duì)組氨酸標(biāo)簽切割，再通過(guò)Ni-NTA親和層析獲得切割標(biāo)簽后的目的蛋白。

1.2.4 重組毒素rCCK96-104PE38體外抑瘤實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 rCCK96-104PE38體外腫瘤細(xì)胞殺傷活性檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞以及人肝細(xì)胞LO2分別經(jīng)胰酶消化后，以5×103個(gè)細(xì)胞/孔鋪在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后加入終濃度為2 000 ng/mL的rCCK96-104PE38，用CCK-8試劑盒測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)重組毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率。

1.2.4.2 受體免疫熒光檢測(cè) 在培養(yǎng)好的HCT116細(xì)胞中加入4%多聚甲醛固定30 min；5%胎牛血清封閉30 min；加入終濃度為2 000 ng/mL rCCK96-104PE38KDEL重組蛋白，37℃孵育10 min，再先后孵育PE38單抗和熒光二抗，通過(guò)熒光顯微鏡觀察。

1.2.4.3 腫瘤抑制率測(cè)定 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人正常肝細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、HCT8、SW620、胃癌細(xì)胞系BGC823、黑色素瘤B16、宮頸癌細(xì)胞系HeLa中，加入不同濃度的rCCK96-104PE38重組蛋白，孵育48 h后，使用CCK-8試劑盒測(cè)定腫瘤抑制率及IC50值。

1.2.5 重組毒素rCCK96-104PE38動(dòng)物體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 免疫缺陷鼠腫瘤模型的建立 取1×107個(gè)HCT116細(xì)胞溶于200 μL生理鹽水中，用注射器注入裸鼠右前肢腋下。7 d后觀察小鼠注射部位是否出現(xiàn)腫塊。

1.2.5.2 rCCK96-104PE38治療腫瘤模型 選取腫瘤體積達(dá)到50-100 mm3的腫瘤模型小鼠30只，平均分成6組，G1組：每日每只注射200 μL生理鹽水；G2組：每日每只注射5 mg/kg rCCK96-104PE38；G3組：每日每只注射10 mg/kg rCCK96-104PE38；G4組：每日每只注射20 mg/kg rCCK96-104PE38；G5組：每日每只注射10 mg/kg奧沙利鉑；G6組：每日每只注射10 mg/kg奧沙利鉑和10 mg/kg rCCK96-104PE38。注射方式為尾靜脈注射，連續(xù)注射14 d，治療結(jié)束后將小鼠處死，記錄瘤重、瘤體積，體重等指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 rCCK96-104PE38重組毒素的表達(dá)與鑒定結(jié)果

如圖1所示，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分析，誘導(dǎo)后的重組菌株在40 kD附近表達(dá)重組蛋白，與設(shè)計(jì)的rCCK96-104PE38大小相符。Western blot結(jié)果表明，該重組蛋白能與PE38抗體特異性結(jié)合。

圖1 重組蛋白rCCK96-104PE38的SDS-PAGE重組蛋白表達(dá)（A）與Western-blot鑒定結(jié)果（B）

2.2 Ni-NTA親和層析純化結(jié)果

經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果（圖2）顯示，在300-450 mmol/L咪唑濃度下，重組蛋白rCCK96-104PE38被洗脫下來(lái)。

圖2 Ni-NTA金屬螯合親和層析純化（梯度洗脫）

2.3 腫瘤抑制曲線(xiàn)

如圖3所示，在培養(yǎng)基中加入rCCK96-104PE38后，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116迅速凋亡，其致凋亡速率與PE毒素相近，而對(duì)人正常肝細(xì)胞沒(méi)有顯著影響；而PE毒素不僅能殺死腫瘤細(xì)胞，也能夠致死正常的肝細(xì)胞，顯示出對(duì)真核細(xì)胞的廣譜殺傷性。

圖3 抑制曲線(xiàn)

2.4 rCCK96-104PE38在靶細(xì)胞上的定位

通過(guò)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)rCCK96-104PE38重組蛋白能夠特異性的吸附在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116表面，而在肝細(xì)胞LO2上檢測(cè)不到強(qiáng)的綠色熒光；PE毒素在HCT116及LO2細(xì)胞上均有結(jié)合，見(jiàn)圖4。

2.5 rCCK96-104PE38對(duì)不同細(xì)胞的抑制效果

通過(guò)CCK8法測(cè)定不同濃度的重組蛋白對(duì)不同細(xì)胞的抑制率，并使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算獲得相應(yīng)的IC50值（半抑制濃度）。如表1所示，rCCK96-104PE38對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系的抑制效果最好，對(duì)胃癌細(xì)胞BGC823也有一定的作用，而對(duì)黑色素瘤B16、宮頸癌HeLa、人肝臟細(xì)胞LO2均沒(méi)有顯著抑制效果，與預(yù)期相符。

圖4 間接免疫熒光檢測(cè)rCCK96-104PE38在靶細(xì)胞上的定位

表1 rCCK96-104PE38對(duì)不同細(xì)胞殺傷效果（IC50）

2.6 毒性測(cè)試

裸鼠模型在單次注射30 mg/kg時(shí)即出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，當(dāng)劑量增加到60 mg/kg時(shí)有小鼠出現(xiàn)死亡（表2）。

表2 rCCK96-104PE38的急性毒力測(cè)試

2.7 體內(nèi)抑瘤效果

以不同劑量的重組毒素和常規(guī)藥物對(duì)結(jié)腸癌裸鼠模型進(jìn)行治療發(fā)現(xiàn)，20 mg/kg的rCCK96-104PE38能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，與常規(guī)化療藥物奧沙利鉑聯(lián)合給藥的抑瘤效果最好，見(jiàn)圖5。

圖5 體內(nèi)抑瘤效果

3 討論

重組免疫毒素是一種融合了靶向分子和毒素的人造蛋白，根據(jù)靶向分子的不同主要分為兩類(lèi)，一類(lèi)是融合了靶向某種特異性受體的天然配體，一類(lèi)是融合的抗體或單鏈抗體［10，11］，本研究的rCCK96-104PE38重組免疫毒素就屬于第一類(lèi)重組免疫毒素，具有特異性靶向殺傷結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的能力。

PE毒素，即綠膿桿菌外毒素，由638個(gè)氨基酸構(gòu)成的一個(gè)單鏈多肽，屬于雙組分AB毒素家族［12］。PE毒素的優(yōu)勢(shì)在于，普通人體內(nèi)沒(méi)有PE毒素的預(yù)存抗體，而且PE毒素不僅毒性強(qiáng)，而且毒性機(jī)理研究已經(jīng)很清楚，便于進(jìn)行編輯改造及活性表達(dá)［12，13］。通過(guò)將PE分子非特異結(jié)構(gòu)域1-252位和365-380位的氨基酸殘基去除，得到了38 kD大小的PE38，具有更低的免疫原性，同時(shí)，將PE38羧基端的REDLK突變?yōu)镵DEL，能夠使細(xì)胞毒性提升6-10倍［14，15］。

膽囊收縮素（CCK）是由十二指腸和近端盲腸的I型腸內(nèi)分泌細(xì)胞和大腦神經(jīng)元合成分泌，其主要生理功能是刺激胰腺分泌、膽囊收縮、抑制胃酸分泌，產(chǎn)生飽腹感等［16］。CCK發(fā)揮作用均與CCK2R（膽囊收縮素2型受體）相關(guān)，而CCK2R在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，因此可以將CCK作為重組免疫毒素特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的識(shí)別元件［17］。CCK在人體內(nèi)以多種長(zhǎng)短不同的分子形式存在，均為含115個(gè)氨基酸的CCK原加工剪切形成的多肽［18］，本研究最終選擇了能發(fā)揮CCK2R親和作用的第96-104位的Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly九個(gè)氨基酸作為重組毒素的導(dǎo)向元件。

在測(cè)定rCCK96-104PE38重組免疫毒素對(duì)不同細(xì)胞的抑制效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC823也有明顯的致凋亡作用，原因是CCK2R不僅在結(jié)腸癌細(xì)胞上高表達(dá)，在部分胃癌細(xì)胞、部分胰腺癌中也高表達(dá)［19-21］，進(jìn)一步證實(shí)了rCCK96-104PE38是通對(duì)CCK2R進(jìn)行定位并發(fā)揮細(xì)胞毒作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建rCCK96-104PE38的原核表達(dá)載體，低溫誘導(dǎo)表達(dá)出可溶性重組毒素蛋白，并通過(guò)Western blotting驗(yàn)證。重組蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析純化。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和結(jié)腸癌裸鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，rCCK96-104PE38具有靶向殺傷結(jié)腸癌的功能。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Characterization of Recombinant Toxin rCCK96-104PE38 Targeting Colon Cancer

ZHANG Song1LIU Xi-lin2LI Meng1CHANG Jiang1GAO Shi-qi1HU Pan1LIU Zeng-shan1
（1. Key Laboratory of Zoonosis，Research Ministry of Education，College of Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062；2. China-Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun 130033）

This work aims to conduct the prokaryotic expression and purification of a novel recombinant toxin rCCK96-104PE38，and to verify the targeted killing effect on colon cancer cells. A reversed cholecystokinin（rCCK96-104）was conjunct to pseudomonas exotoxin（PE38）by gene amplified technology to construct a prokaryotic expression vector. Ni-NTA affinity chromatograph was used for purification. The anti-tumor ability of rCCK96-104PE38 was verified by in vitro cytotoxicity of colon cancer cells and vivo experiment with nude mice model. Results showed that the amplified gene of rCCK96-104PE38 was in correct sequence as designed，i.e.，the active expression was successfully achieved using prokaryotic expression system of pET-28a. The purified recombinant protein induced the apoptosis of colon cancer cells in vitro，and inhibited the tumor growth in nude mice model. Conclusively，it was successful to produce the recombinant toxin rCCK96-104PE38 in high purity and with no tags，the vitro and vivo experiments confirmed that it had inhibitory ability on colon cancer.

recombinant toxin；colon cancer；cholecystokinin；pseudomonas exotoxin

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.032

2016-12-21

國(guó)家青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81401953），中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014M561303），中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助項(xiàng)目（2015T80312），吉林省青年基金項(xiàng)目（20160520162JH），教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（20120061110078），吉林省科學(xué)技術(shù)廳計(jì)劃項(xiàng)目（20120966）

張嵩，男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物性食品安全；E-mail：442557139@qq.com

柳增善，男，教授，研究方向：動(dòng)物性食品安全，E-mail：zsliu1959@sohu.com；胡盼，女，講師，研究方向：動(dòng)物性食品安全，E-mail：hupan84@163.com