周文菲 白娟 龔春梅

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，楊凌 712100）

活性氧介導(dǎo)的植物蛋白質(zhì)氧化修飾研究進(jìn)展

周文菲 白娟 龔春梅

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，楊凌 712100）

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是機(jī)體蛋白發(fā)揮各種功能的重要先行步驟。逆境脅迫下活性氧可對(duì)氧化還原敏感的蛋白質(zhì)進(jìn)行可逆和不可逆的氧化修飾。可逆氧化修飾對(duì)逆境下植物生物功能的正常發(fā)揮乃至適應(yīng)都至關(guān)重要，目前對(duì)活性氧調(diào)節(jié)植物蛋白質(zhì)的可逆氧化修飾研究取得了相應(yīng)進(jìn)展。綜述了植物蛋白質(zhì)氧化修飾的方式位點(diǎn)及參與蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)理，旨在闡明蛋白質(zhì)可逆氧化修飾對(duì)植物抵御逆境造成的氧化脅迫的重大意義，同時(shí)概括對(duì)蛋白質(zhì)可逆氧化修飾研究的有效方法。當(dāng)前可以通過特定位點(diǎn)的突變實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法確定有無可逆氧化修飾并測定氧化修飾程度；未來以期通過綜合實(shí)驗(yàn)控制參與反應(yīng)的蛋白質(zhì)來解析其還原及再生機(jī)理。

活性氧；蛋白質(zhì)；翻譯后修飾；甲硫氨酸；半胱氨酸

蛋白質(zhì)作為基因功能執(zhí)行者，有必要通過蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（post-translational modification，PTM）形成結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、功能更多樣的能夠更精準(zhǔn)更專一發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)。PTM就是通過給一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基加上修飾基團(tuán)對(duì)翻譯后的蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)加工的過程，改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和活性狀態(tài)，亞細(xì)胞定位、折疊及其穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)互作［1，2］。常見的PTM有磷酸化修飾、甲基化修飾和泛素化修飾等。蛋白質(zhì)通過磷酸化與去磷酸化，調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和細(xì)胞周期等諸多生命過程，是生物體內(nèi)最重要的共價(jià)修飾方式之一。人類超過50%的蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾，有100 000個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)［3］。組蛋白的甲基化修飾既可抑制也可增強(qiáng)基因表達(dá)，是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式［4］。泛素化是細(xì)胞蛋白質(zhì)在發(fā)揮降解功能中非常重要的翻譯后修飾，重要性亦堪比磷酸化。這類修飾在動(dòng)物和人體的研究較多且進(jìn)展較快。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是化學(xué)性質(zhì)活潑、氧化能力很強(qiáng)的含氧代謝產(chǎn)物，在植物體內(nèi)具有雙重功能，即可通過氧化生物大分子等方式損害植物正常的生命活動(dòng)，也可發(fā)揮如信號(hào)傳遞等生理功能［5］。隨著對(duì)ROS作為信號(hào)分子研究的深入發(fā)現(xiàn)，其可在植物細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，作為第二信使介導(dǎo)多種信號(hào)通路，與蛋白巰基狀態(tài)、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、多種抗氧化酶類和激素及轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)，對(duì)激素或者環(huán)境脅迫做出多種應(yīng)答［5］。ROS對(duì)蛋白質(zhì)的這種翻譯后修飾，可以通過氧化產(chǎn)生羰基化蛋白等不可逆氧化修飾破壞蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)而危害植物體的正常生命活動(dòng)，也可以通過自身的調(diào)節(jié)機(jī)制來適應(yīng)這種氧化脅迫，特別是通過蛋白質(zhì)的可逆氧化修飾實(shí)現(xiàn)適應(yīng)?？梢娭参镌诃h(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化中通過ROS促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化還原修飾，達(dá)到既有效降低氧化脅迫，又保護(hù)蛋白的目的。但是目前對(duì)植物蛋白質(zhì)氧化修飾的研究還處于初始階段，有關(guān)具體修飾位點(diǎn)的研究也不多見。鑒于蛋白質(zhì)的PTM，特別是可逆氧化修飾對(duì)逆境下植物生物功能的正常發(fā)揮乃至適應(yīng)和存活都至關(guān)重要，ROS調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的可逆氧化修飾研究越來越受到人們的重視，在機(jī)理和研究手段上都取得了一定進(jìn)展。各種常見的ROS有H2O2、O2-和1O2、·OH等，它們的半衰期分別以毫秒、微秒、納秒來計(jì)量，且O2-、1O2和·OH的氧化活性強(qiáng)于H2O2［6］，所以H2O2相對(duì)更為穩(wěn)定；相較于另外3種ROS，H2O2可穿梭過膜，其作用范圍更廣。這些ROS都可對(duì)氨基酸進(jìn)行氧化修飾，但鑒于H2O2的穩(wěn)定性和可跨膜性，目前植物蛋白質(zhì)氧化修飾的研究主要集中在H2O2造成的氧化修飾上［7-10］。有人以野生型擬南芥為對(duì)照組，過氧化氫酶（catalase，CAT）突變型為脅迫處理組，利用蛋白質(zhì)組對(duì)植物甲硫氨酸亞砜（met sulfoxide，Met-SO）的動(dòng)態(tài)進(jìn)行觀察進(jìn)而分析甲硫氨酸（methionine，Met）的氧化程度［11］。本文根據(jù)近年來國內(nèi)外主要相關(guān)研究進(jìn)展，就ROS對(duì)植物蛋白質(zhì)氧化修飾的方式位點(diǎn)以及可逆氧化修飾的調(diào)節(jié)機(jī)理及對(duì)植物抗逆的重要意義進(jìn)行綜述，著重探討ROS對(duì)植物蛋白質(zhì)可逆氧化修飾的機(jī)理、在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及研究方法。

1 植物蛋白質(zhì)氧化修飾的方式和位點(diǎn)

1.1 ROS對(duì)植物蛋白質(zhì)氧化修飾的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)理

正常情況下植物細(xì)胞與胞外環(huán)境相比，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境主要靠GSH和硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）的半胱氨酸（cysteine，Cys）構(gòu)成巰基氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)將其維持在強(qiáng)還原狀態(tài)［12］，不會(huì)受到氧化脅迫。而且植物也會(huì)利用酶促與非酶促的抗氧化系統(tǒng)［13］來清除一定量的ROS，但在干旱等脅迫條件下過量ROS的產(chǎn)生，使植物細(xì)胞處于氧化脅迫狀態(tài)，很多生物分子如糖類、不飽和脂類、蛋白質(zhì)和核酸等都成為ROS攻擊的目標(biāo)，引發(fā)膜脂過氧化、蛋白質(zhì)氧化、核酸損傷和酶失活，甚至導(dǎo)致許多生物大分子尤其是蛋白質(zhì)被氧化而失去功能，并激活程序性細(xì)胞死亡。相較于脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和脂類，蛋白質(zhì)的氧化更普遍，占68%［14］，特別是含硫氨基酸如Met與Cys殘基最容易遭到破壞而導(dǎo)致蛋白質(zhì)相關(guān)屬性變化和功能失常，可能都是因這兩種氨基酸殘基被氧化所致。

ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）促進(jìn)可逆的氧化還原PTM的發(fā)生，包括Cys、酪氨酸（tyrosine，Tyr）的亞硝基化，Cys、Met的氧化［15，16］。這種ROS對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行的可逆氧化修飾，既保護(hù)了蛋白質(zhì)不受損傷，在條件合適時(shí)繼續(xù)發(fā)揮生理功能；又起到抗氧化劑的作用，降低了ROS對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷［17］。

1.2 ROS對(duì)蛋白質(zhì)氧化修飾的方式和位點(diǎn)

蛋白質(zhì)分子中起關(guān)鍵作用的氨基酸成分對(duì)ROS損害特別敏感，因而ROS以多種方式直接或間接地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行攻擊從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)修飾。直接修飾包括氨基酸殘基的氧化、含硫基團(tuán)的氧化和二硫鍵形成以及谷胱甘肽化等；間接修飾主要是指蛋白與脂肪酸過氧化裂解產(chǎn)物結(jié)合形成羰基化蛋白。不同的ROS對(duì)特定氨基酸側(cè)鏈有特殊影響，以芳香氨基酸和含硫氨基酸最為突出。大多數(shù)蛋白質(zhì)的氧化作用是不可逆的，經(jīng)常與蛋白質(zhì)功能的永久喪失相關(guān)，可以導(dǎo)致?lián)p害蛋白質(zhì)的消除或積累；只有一些含硫氨基酸的蛋白質(zhì)氧化是可逆的［5］，如Cys、Met的氧化，可以起到保護(hù)Cys避免發(fā)生不可逆氧化修飾和調(diào)節(jié)蛋白功能的雙重作用［18］。目前ROS對(duì)植物蛋白質(zhì)氨基酸可逆氧化修飾的研究主要集中在Met和Cys上，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)并梳理了ROS對(duì)Cys和Met的氧化修飾，如圖1［19］。除此之外，Cys的亞硝基化和谷胱甘肽化也是常見的氧化修飾方式。

圖1 ROS對(duì)甲硫氨酸和半胱氨酸的可逆氧化修飾

1.2.1 芳香族氨基酸的不可逆氧化修飾起著抗氧化和信號(hào)傳遞的作用 芳香族氨基酸是最容易被氧化損傷的氨基酸［20］，如Tyr很容易發(fā)生苯環(huán)間交聯(lián)形成二酪氨基酸或其酚環(huán)的3位上加1個(gè)硝基（-NO2）形成硝化氨基酸，而被作為蛋白質(zhì)氧化損傷的指標(biāo)［21］；ROS對(duì)色氨酸（tryptophan，Trp）殘基的氧化修飾是不可逆的非隨機(jī)過程［14］，近年來也有文獻(xiàn)說明Trp的氧化修飾是可逆的［16］，所以厘清其中的抗氧化機(jī)制非常重要。芳香族氨基酸（Trp和Tyr）被氧化后，疏水性發(fā)生改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；Tyr磷酸化在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上起著重要的作用；在ROS參與下，Tyr很容易發(fā)生苯環(huán)間交聯(lián)而形成二酪氨基酸，可被作為蛋白質(zhì)氧化損傷的指標(biāo)［21］。芳香族氨基酸的氧化產(chǎn)物在酸水解環(huán)境中也很穩(wěn)定，通常作為蛋白質(zhì)氧化的生物標(biāo)志物，如Moller以Trp作為蛋白質(zhì)標(biāo)志物研究了蛋白質(zhì)組的氧化［14］。Tyr氧化修飾可以作為脅迫條件下的生物標(biāo)志，Aulak等［22］和Kanski等［23］采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和串聯(lián)液相色譜四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-liquid chromatography quadrupole，LCLCQ）等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)硝化Tyr進(jìn)行了研究。Tyr的硝基化氧化修飾和Met殘基可逆氧化修飾一樣具有抗氧化劑的功能。

1.2.2 ROS對(duì)某些蛋白質(zhì)的不可逆羰基化修飾 蛋白質(zhì)的羰基化修飾主要包括特定位點(diǎn)氨基酸的修飾、肽鏈斷裂、交聯(lián)和聚合、電荷改變以及對(duì)蛋白水解作用的敏感度增加，從而使蛋白結(jié)構(gòu)改變、功能失常和降解。羰基化的主要方式有：ROS介導(dǎo)的賴氨酸（lysine，Lys）、脯氨酸（proline，Pro）、精氨酸（arginine，Arg）和蘇氨酸（threonine，Thr）殘基的氧化［16］；脂質(zhì)過氧化裂解產(chǎn)物（主要為活性醛類如4-羥基烯醛）與蛋白質(zhì)氨基酸殘基（組氨酸（histidine，His）、Cys、Lys）的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生米歇爾加成（michaeI addition）和/或希夫堿（schiff base）反應(yīng)［5］；Lys等的糖基化［24］。由于蛋白質(zhì)羰基化不能被細(xì)胞中的酶系統(tǒng)修復(fù)，這些作用對(duì)蛋白質(zhì)造成的損傷也是一個(gè)不可逆過程。環(huán)境脅迫下植物組織羰基化蛋白含量增多，已被廣泛用作檢測蛋白質(zhì)氧化損傷的標(biāo)志。

1.2.3 ROS對(duì)Met的可逆氧化修飾

1.2.3.1 ROS對(duì)Met可逆氧化修飾過程 Met是生物體必需氨基酸之一，無論游離態(tài)還是暴露在蛋白質(zhì)表面的Met都極易被ROS氧化形成Met-SO、更強(qiáng)的氧化劑還可將Met-SO進(jìn)一步氧化成甲硫氨酸砜（methionine sulfone，Met-SO2）導(dǎo)致氨基酸結(jié)構(gòu)改變和蛋白質(zhì)功能受損［25］。Met-SO可以被生物體內(nèi)Met亞砜還原酶（methionine sulfoxide reductase，Msr）家族逆轉(zhuǎn)［26］，還原亞砜結(jié)構(gòu)并恢復(fù)受損蛋白質(zhì)的活性，以抵御逆境造成的各種氧化脅迫［27］，保證機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)；然而Met-SO2不能被Msr系統(tǒng)還原，屬于不可逆的氧化修飾。

1.2.3.2 Msr在Met可逆氧化修飾中的作用 根據(jù)多篇文獻(xiàn)總結(jié)并繪制Msr在蛋白質(zhì)可逆氧化修飾過程中的作用機(jī)制如圖2［17，25，28］。Msr參與被氧化破壞的蛋白質(zhì)或多肽中Met的修復(fù)過程［26，28］，可以使氧化的Met-SO還原為Met，進(jìn)而恢復(fù)蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象與功能，為該還原過程提供還原力的主要為Trx［29］，其次是谷氧還蛋白（glutaredoxin，Grx）以及抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（ascorbate-glutathione cycle，AsA-GSH cycle）系統(tǒng)中的GSH或還原型輔酶 Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等［17］。Met-SO具有手性，以對(duì)映異構(gòu)體（Met-S-SO與Met-R-SO）形式混合存在。Msr的催化過程需要Cys殘基的參與，當(dāng)用絲氨酸（serine， Ser）取代其上的Cys時(shí)，Msr的活性完全被抑制，但是當(dāng)Cys上的硫元素被硒元素取代時(shí)可以保持Msr的酶活性［30-32］。Msr有MsrA和MsrB兩種類型，它們催化不同異構(gòu)體的Met-SO還原為Met，從而恢復(fù)蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象與功能［27］。Msr催化游離及多肽鏈中Met-SO的還原類型有3種，分別為：1-Cys-Msr、2-Cys-Msr、3-Cys-Msr［28］，其中以2-Cys-Msr的應(yīng)用最為普遍。2-Cys-Msr含有兩個(gè)Cys殘基，其中一個(gè)為催化Cys殘基；另一個(gè)為循環(huán)Cys殘基。2-Cys-Msr的催化機(jī)制具體如下：首先，催化Cys殘基對(duì)Met-SO的硫原子進(jìn)行親核攻擊，產(chǎn)生Msr-MetSO復(fù)合體；其次，由Msr上的循環(huán)Cys殘基對(duì)此復(fù)合物的硫原子進(jìn)行親核攻擊，產(chǎn)生含分子內(nèi)二硫鍵的Msr、Met和水分子；最后，由還原劑Trx實(shí)現(xiàn)Msr的還原再生，整個(gè)循環(huán)結(jié)束。

圖2 Trx、Srx、Msr等在蛋白質(zhì)可逆氧化修飾過程中發(fā)揮作用的機(jī)理及再生機(jī)制

1.2.4 ROS對(duì)Cys的可逆氧化修飾

1.2.4.1 ROS對(duì)Cys的巰基亞硝基化修飾 Stamler［33］首先提出了蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾，認(rèn)為一氧化氮（nitric oxide，NO）作用于蛋白質(zhì)疏水區(qū)的Cys巰基使之由-SH變成-SNO。根據(jù)作用于巰基的程度又可將亞硝基化分為兩種：一種是蛋白質(zhì)巰基被NO直接亞硝基化作用；另一種是由低分子質(zhì)量巰基亞硝基化化合物向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)亞硝基化作用［34］。作用位點(diǎn)多在蛋白質(zhì)Cys上，又分單亞硝基化修飾和多亞硝基化修飾［35-37］。此種修飾包括亞硝基化和去亞硝基化，是一種可逆修飾。蛋白質(zhì)巰基亞硝基化產(chǎn)物一旦形成后比較穩(wěn)定，能活化鈣離子通道［38］。

1.2.4.2 ROS對(duì)Cys的谷胱甘肽化修飾 谷胱甘肽化（glutathionylation）即GSH在谷氧還蛋白酶（glutaredoxin protease，GrxP）的催化下與蛋白質(zhì)的Cys形成二硫鍵，該過程是可逆的［1］。GSH修飾對(duì)酶活性造成的影響可以由還原劑逆轉(zhuǎn)，而氧化作用則會(huì)導(dǎo)致氧化還原酶的不可逆失活［39］。目前可以采用與S-亞硝酰化相似的分析方法，在生物素標(biāo)記蛋白富集前對(duì)蛋白進(jìn)行酶解，富集谷胱甘肽化肽段，從而鑒定到發(fā)生修飾的位點(diǎn)［40］。氧化應(yīng)激過程和正常生理狀態(tài)下都可發(fā)生谷胱甘肽化與去谷胱甘肽化，谷胱甘肽化是由Grx、Trx和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）等催化產(chǎn)生的，其中Grx催化活性及特異性最強(qiáng)［41］。

1.2.4.3 ROS對(duì)Cys的可逆氧化修飾及各種氧化還原蛋白的作用 Cys的可逆氧化還原作用機(jī)制如圖2所示，Cys在氧化條件下可形成二硫鍵、亞氧硫基（-SOH）、亞硫酸基（-SO2H）、硫酸基（-SO3H），其中硫酸基是Cys的不可逆氧化形式，可能與生物活性的喪失有關(guān)；另外3種均為可逆過程，其可逆過程主要依賴3種氧還蛋白：Trx、硫氧還蛋白（sulfiredoxin，Srx）和Grx。值得注意的是，Trx、Grx、Srx的靶目標(biāo)是氧化修飾后的Cys殘基，過氧化物氧化還原酶（peroxiredoxin，Prx）也是Cys氧化修飾經(jīng)常出現(xiàn)的氧還蛋白［42］，雖然其作用底物主要是過氧化物酶，但也有研究發(fā)現(xiàn)Prx也可以參與可逆反應(yīng)，催化Cys-SO2H的可逆氧化［43］，因此本文將Prx列入蛋白質(zhì)中Cys殘基可逆氧化修飾的氧化還原蛋白中。Trx與Srx的中文翻譯名字相同，均為硫氧還蛋白［44，45］，但就兩者依賴的再生機(jī)制不同可以看出，Trx是依賴NADPH還原的硫氧還蛋白，Srx是依賴腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）再生的硫氧還蛋白。硫氧還蛋白系統(tǒng)（thioredoxin system，Trxs）和谷氧還蛋白系統(tǒng)（glutaredoxin system，Grxs）是目前已知的胞內(nèi)負(fù)責(zé)還原二硫化物的主要系統(tǒng)。Trx和Grx上都含有Cys殘基，其上的2個(gè)Cys殘基可通過轉(zhuǎn)移2個(gè)電子和2個(gè)質(zhì)子可逆地形成二硫化合物，使巰基和二硫化合物相互轉(zhuǎn)換，為一系列生理反應(yīng)提供氧化還原對(duì)能可逆地催化許多氧化還原反應(yīng)。Trxs是由Trx、NADPH和硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TR）3部分組成的，還原態(tài)的Trx通過巰基供氫使其它含有二硫鍵的蛋白被還原；氧化態(tài)的Trx被NADPH還原，繼續(xù)發(fā)揮作用。該系統(tǒng)能夠穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及信號(hào)傳導(dǎo)過程來保護(hù)細(xì)胞［46］。通常在Trxs中電子傳遞路徑為：NADPH→TR→Trx→含二硫鍵的靶蛋白。Grxs包括NADPH、GSH、谷胱甘肽還原酶（glutaredoxin reductase，GR）和Grx。Grx系統(tǒng)中，電子傳遞路徑為：NADPH→GR→GSH→Grx→含二硫鍵的靶蛋白。

Srx是一類多功能酸性蛋白［12］，在實(shí)現(xiàn)Cys亞磺酸的還原中起著重要的作用，其作用機(jī)理主要是：（1）ATP與亞磺酸反應(yīng)并使亞磺酸磷酸化；（2）Srx與磷酸化產(chǎn)物作用生成中間復(fù)合體；（3）利用Trx/GSH等還原上述中間產(chǎn)物，生成次磺酸，Srx的還原是在Srx的特異性誘導(dǎo)劑的作用下實(shí)現(xiàn)的；（4）次磺酸通過形成二硫鍵被Trx/GSH等進(jìn)一步還原為Cys。其電子傳遞路徑如下式所述：Cys-SO2H（+ATP）→ Cys-SO2-PO32-（+Srx）→ Cys-SO-S-Srx（+Trx/GSH）→ Cys-SOH。

總而言之，目前對(duì)這些氧化還原蛋白Trx、Grx、Srx和Prx的研究各有側(cè)重，四者的關(guān)系應(yīng)是各行其道，互相輔助。ROS脅迫下，Prx發(fā)揮清除ROS的功能，Srx在還原亞磺酸時(shí)需要Trx輔助，Trx與Grx需要共同的還原力NADPH。由此可見，Cys的可逆氧化修飾中各種氧化還原蛋白有兩種類型（圖2），一種是直接參與氧化型Cys殘基還原過程的氧還蛋白類，如Trx、Grx和Srx等；另一種是間接參與氧化型Cys還原過程的氧還蛋白還原酶類，如GR和TR。

1.2.5 ROS對(duì)Cys的不可逆氧化修飾 Cys在氧化條件下可形成二硫鍵、亞氧硫基（-SOH）、亞硫酸基（-SO2H）、硫酸基（-SO3H），其中亞硫酸基和硫酸基是Cys的不可逆氧化形式，可能與生物活性的喪失有關(guān)［47］。為了系統(tǒng)地研究細(xì)胞的氧化還原調(diào)節(jié)，Yano等［48］采用硫醇特異的熒光標(biāo)記，并結(jié)合兩種類型的雙向電泳非還原雙向電泳（non-reducing reducing two-dimensional electrophoresis）和等電聚焦十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（isoelectric focusing Sodium dodecyl salt-polyacrylamide gel electrophoresis，IEF SDS-PAGE），成功鑒定到花生中受Trx調(diào)控的20多個(gè)蛋白。Lee等［47］對(duì)一種含有二硫鍵的植物蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究，采用硫醇親和色譜方法富集目的蛋白，共鑒定到65個(gè)公認(rèn)的含二硫鍵的蛋白質(zhì)。Moan等［49］則采用雙標(biāo)記法對(duì)啤酒酵母中的硫醇氧化蛋白進(jìn)行富集和定量，質(zhì)譜鑒定到64個(gè)蛋白質(zhì)。這些都是ROS對(duì)Cys進(jìn)行了不可逆氧化修飾的佐證。

2 植物蛋白質(zhì)可逆氧化修飾的意義和方法

2.1 植物蛋白質(zhì)可逆氧化修飾提高植物抗逆性

植物蛋白質(zhì)的可逆氧化修飾主要發(fā)生在含硫氨基酸（Met、Cys）上，ROS可促進(jìn)含硫氨基酸殘基的氧化，主要依賴Trx、Grx、Prx、Srx、Msr等酶類［26，46，50］產(chǎn)生相應(yīng)的氧化產(chǎn)物。

2.1.1 Met殘基的可逆氧化修飾起著抗氧化劑和信號(hào)傳遞的作用 ROS脅迫下，Met殘基可以直接消耗氧化劑，調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)進(jìn)行，起抗氧化劑作用［51］。Valley等［52］提出了Met-芳香族氨基酸模型：Met在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成中位于易于被氧化的芳香族氨基酸如Trp、Tyr和苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）等氨基酸的周圍，并營造出疏水環(huán)境穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，在ROS的脅迫下，可以通過犧牲Met實(shí)現(xiàn)對(duì)芳香族氨基酸的保護(hù)，從而實(shí)現(xiàn)其抗氧化的功能。在α2巨球蛋白（α2macroglobulin，A2M）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）［51］和熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）［53］等蛋白質(zhì)中證明存在這種結(jié)構(gòu)并發(fā)揮抗氧化功能［51］。Msr在Met可逆氧化修飾中起著重要作用，部分Msr基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Msr在植物抗性方面的表現(xiàn)，進(jìn)一步證明了Met的抗氧化作用［54，55］。

ROS脅迫下，Met也可通過與Met-SO的可逆氧化還原過程調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。Met殘基位于Ser/Thr磷酸化位點(diǎn)附近，起著疏水識(shí)別作用，它的氧化與還原參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［56］。Tarafdar等［57］研究證明MsrA可以促進(jìn)Met與Met-SO之間的可逆氧化還原反應(yīng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞氧化還原的調(diào)節(jié)。Met殘基在被氧化后會(huì)致使蛋白質(zhì)相關(guān)屬性如結(jié)構(gòu)和疏水性等方面發(fā)生變化，抑制激酶的識(shí)別和磷酸化從而將氧化信號(hào)傳遞到目標(biāo)蛋白上，調(diào)節(jié)激酶的活性，從而將氧化脅迫信號(hào)與蛋白質(zhì)磷酸化偶聯(lián)起來［28，31，58］。Met氧化后可以改變鉀離子通道的功能。Met殘基被氧化后會(huì)使鉀離子通道的通道蛋白失活，這一過程可以被Msr逆轉(zhuǎn)恢復(fù)［59］。Met殘基氧化后會(huì)使依賴Ca2+/鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）的蛋白激酶 2（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）的酶活性上調(diào)，該活性也可被Msr逆轉(zhuǎn)恢復(fù)；CaM與鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin-binding protein，CaMBP）的親和力下降［27，60］。

2.1.2 Cys殘基的氧化修飾起著抗氧化和信號(hào)傳遞的作用 Met的抗氧化機(jī)制即為位于易于氧化的氨基酸周圍保護(hù)它們，自身的可逆從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)氧化能力的抵抗；Cys的抗氧化機(jī)理即為參與可逆氧化氨基酸的還原過程，保護(hù)可逆氨基酸的正常可逆，自己對(duì)其他可逆氨基酸的恢復(fù)過程從而實(shí)現(xiàn)對(duì)氧化脅迫的抵抗能力。如Met的可逆還原主要依賴Msr的作用，Msr的作用機(jī)制需要依賴Cys殘基的輔助；Cys的可逆還原依賴Trx、Srx以及Prx的作用，這3種氧還蛋白均含有Cys［42，44，61，62］殘基，作用機(jī)制同樣也需要Cys殘基的輔助作用。

Cys殘基的可逆氧化修飾在植物中也起著信號(hào)傳遞控制開關(guān)的作用和控制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性的作用［63］，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）級(jí)聯(lián)信號(hào)在植物信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要的作用，ROS通過氧化蛋白質(zhì)Tyr磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）上的Cys殘基使其失活，進(jìn)而將氧化還原信號(hào)傳遞到MAPKs并使其活化［64］。

2.2 基于蛋白質(zhì)組學(xué)的氧化修飾研究方法

2.2.1 一般蛋白質(zhì)氧化修飾研究方法 蛋白質(zhì)組學(xué)通過研究整體蛋白質(zhì)活動(dòng)來揭示生命運(yùn)動(dòng)規(guī)律，是解析功能基因組表達(dá)的必要手段［65］。存在的問題主要有兩個(gè)：即PTM蛋白的富集分離問題和二級(jí)質(zhì)譜的裂解效率問題。目前廣泛使用的肽段裂解技術(shù)包括碰撞誘導(dǎo)解離（collision induced dissociation，CID）和源后衰變（post-source decay，PSD）兩種［1］。蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的主要手段是使用色譜或者凝膠方式進(jìn)行富集，使用質(zhì)譜或者凝膠方式進(jìn)行分析檢測。PTM蛋白質(zhì)具有不均一性及相對(duì)豐度低的特性，對(duì)PTM蛋白質(zhì)進(jìn)行富集分離十分必要。色譜分離的原理有3類：依據(jù)分子量差異進(jìn)行色譜分離；依據(jù)蛋白質(zhì)的親疏水性進(jìn)行反相色譜分離富集過程中；依據(jù)電荷差異進(jìn)行色譜分離。一些常見的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法如圖3。一些非蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法也可應(yīng)用于PTM研究中，圖3列出了3種常用的方法。隨著蛋白質(zhì)組表達(dá)譜研究技術(shù)的日益成熟和規(guī)?；琍TM蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)展。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái)側(cè)重在磷酸化、泛素化和乙?；揎椀难芯?，同時(shí)為蛋白質(zhì)可逆氧化修飾的研究提供了重要的思路和手段，可逆蛋白質(zhì)氧化修飾方興未艾。

圖3 蛋白質(zhì)研究一般方法與蛋白質(zhì)組方法的比較

2.2.2 可逆氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法 考慮生物體的代謝變化常常是由于修飾程度的改變引起的，因而定量研究PTM尤為重要。定量研究的方法主要是基于凝膠的定量蛋白質(zhì)組學(xué)和基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)?；谀z的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的核心在染色上，鑒于雙向電泳染全蛋白，染料與蛋白質(zhì)疏水作用結(jié)合和膠上差示電泳技術(shù)（differential ingel electrophoresis，DIGE）熒光染料，只標(biāo)記Lys的染色原理，不適用于蛋白質(zhì)可逆氧化修飾的研究?；谫|(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)又分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量。相對(duì)定量的方法包括用同位素標(biāo)記肽段氨基酸的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)，因?qū)Φ鞍踪|(zhì)的選擇性很低，標(biāo)記所有的氨基末端，前提是將可逆修飾的蛋白質(zhì)用合適的方法分離出來，再用iTRAQ技術(shù)來分析是可行的；同位素編碼的親和標(biāo)簽（isotope coded affinity tags，ICAT）技術(shù)也利用同位素標(biāo)記氨基酸，ICAT技術(shù)本身標(biāo)記的就是Cys，所以可以用來研究可逆氧化修飾蛋白質(zhì)，但是ICAT技術(shù)不能用來研究不可逆的氧化修飾，原因是Cys的大基團(tuán)特性使ICAT修飾有困難；因此發(fā)展出絕對(duì)定量的三重四級(jí)桿質(zhì)多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）技術(shù)，用烷基化試劑標(biāo)記Cys，烷基化修飾蛋白質(zhì)，還原后再修飾，做質(zhì)譜，同時(shí)結(jié)合親和層析，此法可用于Cys可逆和不可逆氧化修飾的研究中。細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記（stable isotope labeling with amino acids in cell cultures，SILAC）技術(shù)采用體內(nèi)同位素標(biāo)記，比較依賴細(xì)胞的培養(yǎng)，在植物中應(yīng)用不多；因此進(jìn)行體內(nèi)同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的依賴性很強(qiáng)，不太適宜在植物上應(yīng)用。由此可知，將一般蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)直接應(yīng)用于可逆氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究上有一定的局限性，應(yīng)該結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的原理和科研目的，發(fā)展出適于Met、Cys等可逆氧化修飾及硝化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)。

Met氧化生成Met亞砜后分子量增加16 Da，可以據(jù)此特性進(jìn)行色譜分離［65］；Met氧化后從疏水性的Met變?yōu)橛H水性強(qiáng)的Met-SO［66］，利用此特性可使用對(duì)角線色譜法（combined fractional diagonal chromatography，COFRADIC）對(duì)氧化型氨基酸殘基進(jìn)行富集［67］；利用Msr對(duì)Met亞砜的親和性也可達(dá)到對(duì)Met可逆氧化修飾的研究目的［67］。由于不同研究對(duì)象其氨基酸特性不同，有時(shí)需要進(jìn)行一定的標(biāo)記或者修飾便于目標(biāo)蛋白的富集。半胱氨酸的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)即是如此。目前應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定半胱氨酸殘基的可逆氧化修飾時(shí)，MRM方法應(yīng)用的最多，常使用N-乙酰基馬來酰亞胺（N-acetyl-Maleimide，NEM）等烷化劑對(duì)自由巰基進(jìn)行保護(hù)，再利用還原劑如二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）等對(duì)氧化型半胱氨酸殘基進(jìn)行還原，以及利用熒光試劑等便于富集分離，再結(jié)合質(zhì)譜檢測手段進(jìn)行鑒定及定量［47-49，68］。Yano等［48］采用硫醇特異的熒光標(biāo)記，并結(jié)合兩種類型的雙向電泳（non-reducing/reducing 2-DE和IEF/SDS-PAGE），成功鑒定到花生中受硫氧還蛋白調(diào)控的20多個(gè)蛋白［1，48］。Lee等［47］對(duì)擬南芥含有二硫鍵的蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究，采用硫醇親和色譜富集目的蛋白，共鑒定到65個(gè)公認(rèn)的含二硫鍵的蛋白［1，47］。Moan等［49］采用雙標(biāo)記的方法對(duì)啤酒酵母中的硫醇氧化蛋白分別進(jìn)行富集和定量，總共鑒定出64個(gè)蛋白質(zhì)［1，49］。

硝基化氧化修飾與谷胱甘肽化修飾也是一種可逆氧化修飾。Jaffrey等［69］和Hao等［70］對(duì)硝基化氧化修飾研究技術(shù)進(jìn)行了提出和發(fā)展，完善了S-亞硝?；鞍踪|(zhì)的研究策略，大概包括以下步驟［71］：（1）封閉所有自由巰基，選擇性還原 S—NO鍵；（2）引入生物素標(biāo)簽；（3）通過抗生物素蛋白富集目標(biāo)蛋白質(zhì)；（4）結(jié)合一維或二維凝膠電泳技術(shù)、液相色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)等手段進(jìn)行亞硝?；鞍踪|(zhì)的鑒定。與S-亞硝?；嗨疲入赘孰幕揎椀牡鞍踪|(zhì)可以采用相似的研究手段，蛋白酶解后用生物素標(biāo)記蛋白從而完成谷胱甘肽化肽段的富集［1，40］。Cheng等［72］用生物素標(biāo)記谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶后采用一種類似免疫印跡的方法檢測谷胱甘肽化蛋白［1，72］；Klatt等［73］借助S-亞硝化谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）是GS-供體，可以與蛋白質(zhì)形成雜和的二硫鍵的特性，把GSNO與瓊脂糖凝膠相結(jié)合，通過GSNO柱來富集目標(biāo)蛋白質(zhì)［1，73］。

3 展望

植物蛋白質(zhì)氧化修飾中，蛋白質(zhì)可逆氧化修飾對(duì)植物抵御逆境造成的氧化脅迫意義重大，對(duì)它的研究分三個(gè)層面，一是通過特定位點(diǎn)的突變實(shí)驗(yàn)來確定有無可逆氧化調(diào)控作用；二是利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法測定氧化修飾的程度；三是利用綜合實(shí)驗(yàn)通過控制氧化還原的蛋白酶等的氧化還原特性來解析還原機(jī)理及再生機(jī)理。

基于蛋白質(zhì)可逆氧化的研究前景，認(rèn)為在Trp的可逆氧化機(jī)理上值得挖掘；在Srx的再生機(jī)理上值得深究；對(duì)光合相關(guān)蛋白的可逆氧化還原的研究值得關(guān)注，特別是蛋白質(zhì)可逆氧化修飾中還原性蛋白的再生與光合作用相偶聯(lián)，它們與ROS的復(fù)雜關(guān)系值得系統(tǒng)研究。

［1］劉金鳳, 王京蘭, 錢小紅, 等. 翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)策略［J］. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2007, 23（2）：93-100.

［2］Mann M, Jensen ON. Proteomic analysis of post-translational modifications［J］. Nature Biotechnology, 2003, 21（3）：255-261.

［3］Kalume DE, Molina H, Pandey A. Tackling the phosphoproteome：tools and strategies［J］. Current Opinion in Chemical Biology, 2003, 7（1）：64-69.

［4］宋博研, 朱衛(wèi)國. 組蛋白甲基化修飾效應(yīng)分子的研究進(jìn)展［J］.遺傳, 2011, 33（4）：285-292.

［5］M?ller IM, Jensen PE, Hansson A. Oxidative modifications to cellular components in plants［J］. Annual Review of Plant Biology, 2007, 58：459-481.

［6］丁海東, 劉慧, 朱曉紅, 等. 植物細(xì)胞蛋白質(zhì)氧化及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27（33）：187-193.

［7］Waszczak C, Akter S, Eeckhout D, et al. Sulfenome mining in Arabidopsis thaliana［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111（31）：11545-11550.

［8］Ghesquière B, Gevaert K. Proteomics methods to study methionine oxidation［J］. Mass Spectrometry Reviews, 2014, 33（2）：147-156.

［9］Gupta V, Carroll KS. Sulfenic acid chemistry, detection and cellular lifetime［J］. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-General Subjects, 2014, 1840（2）：847-875.

［10］Pan J, Carroll KS. Chemical biology approaches to study protein cysteine sulfenylation［J］. Biopolymers, 2014, 101（2）：165-172.

［11］ Jacques S, Ghesquière B, De Bock PJ, et al. Protein methionine sulfoxide dynamics in Arabidopsis thaliana under oxidative stress［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2015, 14（5）：1217-1229.

［12］張佳娣. 活性氧的信號(hào)傳導(dǎo)途徑［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38（16）：8283-8285.

［13］Noctor G, Mhamdi A, Foyer CH. Oxidative stress and antioxidative systems：recipes for successful data collection and interpretation［J］. Plant, Cell & Environment, 2016, 66（10）：1140-1160.

［14］Rinalducci S, Murgiano L, Zolla L. Redox proteomics：basic principles and future perspectives for the detection of protein oxidation in plants［J］. Journal of Experimental Botany, 2008, 59（14）：3781-3801.

［15］Navrot N, Finnie C, Svensson B, et al. Plant redox proteomics［J］. Journal of Proteomics, 2011, 74（8）：1450-1462.

［16］付強(qiáng), 鄒頡, 趙杰宏, 等. 植物氧化還原蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41（12）：17-20.

［17］Weissbach H, Resnick L, Brot N. Methionine sulfoxide reductases：history and cellular role in protecting against oxidative damage［J］. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Proteins and Proteomics, 2005, 1703（2）：203-212.

［18］Ghezzi P, Bonetto V. Redox proteomics：identification of oxidatively modified proteins［J］. Proteomics, 2003, 3（7）：1145-1153.

［19］Couturier J, Chibani K, Jacquot JP, et al. Cysteine-based redox regulation and signaling in plants［J］. Frontiers in Plant Science, 2013, 4：105.

［20］Liebster J, Kopoldova J. The radication chemistry of amino acids［J］. Advances in Radiation Biology, 2013, 1：157.

［21］李冰冰, 趙倩, 張龍富. 活性氧與蛋白質(zhì)氧化損傷［J］. 平頂山工學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 14（5）：16-17.

［22］Aulak KS, Miyagi M, Yan L, et al. Proteomic method identifies proteins nitrated in vivo during inflammatory challenge［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001, 98（21）：12056-12061.

［23］Kanski J, Hong SJ, Sch?neich C. Proteomic analysis of protein nitration in aging skeletal muscle and identification of nitrotyrosinecontaining sequences in vivo by nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry［J］. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280（25）：24261-24266.

［24］Friso G, van Wijk KJ. Posttranslational protein modifications in plant metabolism［J］. Plant Physiology, 2015, 169（3）：1469-1487.

［25］Rao RSP, M?ller IM, Thelen JJ, et al. Convergent signaling pathways--interaction between methionine oxidation and serine/threonine/tyrosine O-phosphorylation［J］. Cell Stress & Chaperones, 2015, 20（1）：15-21.

［26］ 黃舒, 李剛, 朱建堂, 等. 植物Msr（methionine sulfoxide reductase）基因家族的研究進(jìn)展［J］. 生命的化學(xué), 2015, 35（3）：313-319.

［27］王海波, 鄒竹榮, 龔明. 小桐子甲硫氨酸亞砜還原酶A的基因克隆及生物信息學(xué)分析［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2015, 34（4）：821-829.

［28］Drazic A, Winter J. The physiological role of reversible methionineoxidation［J］. Biochimica et Biophysica Acta, 2014, 1844（8）：1367-1382.

［29］Muthuramalingam M, Matros A, Scheibe R, et al. The hydrogen peroxide-sensitive proteome of the chloroplast in vitro and in vivo［J］. Frontiers in Plant Science, 2013, 4：54.

［30］Kim HY, Fomenko DE, Yoon YE, et al. Catalytic advantages provided by selenocysteine in methionine-S-sulfoxide reductases［J］. Biochemistry, 2006, 45（46）：13697-13704.

［31］Tarrago L, Laugier E, Rey P. Protein-repairing methionine sulfoxide reductases in photosynthetic organisms：gene organization, reduction mechanisms, and physiological roles［J］. Molecular Plant, 2009, 2（2）：202-217.

［32］Lee BC, Dikiy A, Kim HY, et al. Functions and evolution of selenoprotein methionine sulfoxide reductases［J］. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-General Subjects, 2009, 1790（11）：1471-1477.

［33］Stamler JS. Redox signaling：nitrosylation and related target interactions of nitric oxide［J］. Cell, 1994, 78（6）：931-936.

［34］Perissinotti LL, Turjanski AG, Estrin DA, et al. Transnitrosation of nitrosothiols：characterization of an elusive intermediate［J］. Journal of the American Chemical Society, 2005, 127（2）：486-487.

［35］陳暢, 黃波, 韓佩韋, 等. 蛋白質(zhì)巰基亞硝基化——一種典型氧化還原依賴的蛋白質(zhì)翻譯后修飾［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2006, 33（7）：609-615.

［36］黃楚森, 朱維平, 徐玉芳, 等. 蛋白質(zhì)巰基及其氧化性修飾的化學(xué)檢測方法［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47（3）：280-290.

［37］黃波, 陳暢. 一氧化氮的功能及其作用機(jī)制（Ⅱ）——蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾［J］. 生物物理學(xué)報(bào), 2012, 28（4）：268-277.

［38］Xu L, Eu JP, Meissner G, et al. Activation of the cardiac calcium release channel（ryanodine receptor）by poly-S-nitrosylation［J］. Science, 1998, 279（5348）：234-237.

［39］梁穎, 李玉花. 植物中磷酸甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）在氧化脅迫下的生理功能［J］. 植物生理學(xué)通訊, 2009, 45（10）：1027-1032.

［40］Hamnell-Pamment Y, Lind C, Palmberg C, et al. Determination of site-specificity of S-glutathionylated cellular proteins［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 332（2）：362-369.

［41］鄒朝霞, 周宏博, 高旭. 谷胱甘肽化修飾與氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［J］. 生命的化學(xué), 2007, 27（5）：410-413.

［42］Sevilla F, Camejo D, Ortiz-Espín A, et al. The thioredoxin/ peroxiredoxin/sulfiredoxin system：current overview on its redox function in plants and regulation by reactive oxygen and nitrogen species［J］. Journal of Experimental Botany, 2015, 66（10）：2945-2955.

［43］Biteau B, Labarre J, Toledano MB. ATP-dependent reduction of cysteine-sulphinic acid by S. cerevisiae sulphiredoxin［J］. Nature, 2003, 425（6961）：980-984.

［44］李奎, 白潔. 硫氧還蛋白的共價(jià)修飾［J］. 生命的化學(xué), 2010, 30（1）：54-58.

［45］王珊, 王輝, 陳小燕. 硫氧還蛋白-過氧化物氧還蛋白與過氧化氫構(gòu)成環(huán)路參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［J］. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2015, 31（4）：360-366.

［46］鄭瓊, 馬旭俊, 楊傳平. 硫氧還蛋白（Trx）的研究進(jìn)展［J］.分子植物育種, 2006, 4（6S）：78-82.

［47］Lee K, Lee J, Kim Y, et al. Defining the plant disulfide proteome［J］. Electrophoresis, 2004, 25（3）：532-541.

［48］Yano H, Wong JH, Lee YM, et al. A strategy for the identification of proteins targeted by thioredoxin［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001, 98（8）：4794-4799.

［49］Le Moan N, Clement G, Le Maout S, et al. The Saccharomyces cerevisiae proteome of oxidized protein thiols contrasted functions for the thioredoxin and glutathione pathways［J］. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281（15）：10420-10430.

［50］Allen EMG, Mieyal JJ. Protein-thiol oxidation and cell death：regulatory role of glutaredoxins［J］. Antioxidants & Redox Signaling, 2012, 17（12）：1748-1763.

［51］Kim G, Weiss SJ, Levine RL. Methionine oxidation and reduction in proteins［J］. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-General Subjects, 2014, 1840（2）：901-905.

［52］Valley CC, Cembran A, Perlmutter JD, et al. The methioninearomatic motif plays a unique role in stabilizing protein structure［J］. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287（42）：34979-34991.

［53］Gustavsson N, Kokke B, H?rndahl U, et al. A peptide methionine sulfoxide reductase highly expressed in photosynthetic tissue in Arabidopsis thaliana can protect the chaperone-like activity of a chloroplast-localized small heat shock protein［J］. The PlantJournal, 2002, 29（5）：545-553.

［54］Bechtold U, Murphy DJ, Mullineaux PM. Arabidopsis peptide methionine sulfoxide reductase2 prevents cellular oxidative damage in long nights［J］. The Plant Cell, 2004, 16（4）：908-919.

［55］Li CW, Lee SH, Chieh PS, et al. Arabidopsis root-abundant cytosolic methionine sulfoxide reductase B genes MsrB7 and MsrB8 are involved in tolerance to oxidtive stress［J］. Plant and Cell Physiology, 2012, 53（10）：1707-1719.

［56］ Hrabak EM, Chan CWM, Gribskov M, et al. The Arabidopsis CDPKSnRK superfamily of protein kinases［J］. Plant Physiology, 2003, 132（2）：666-680.

［57］ Tarafdar S, Rusan NM, Levine RL. Site specific oxidation of calmodulin by methionine sulfoxide reductase a in Drosophila［J］. The FASEB Journal, 2016, 30（1 Supplement）：652-654.

［58］ Hardin SC, Larue CT, Oh MH, et al. Coupling oxidative signals to protein phosphorylation via methionine oxidation in Arabidopsis［J］. Biochemical Journal, 2009, 422（2）：305-312.

［59］Ciorba MA, Heinemann SH, Weissbach H, et al. Regulation of voltage-dependent K+channels by methionine oxidation：effect of nitric oxide and vitamin C［J］. FEBS Letters, 1999, 442（1）：48-52.

［60］Erickson JR, Mei-Ling AJ, Guan X, et al. A dynamic pathway for calcium-independent activation of CaMKII by methionine oxidation［J］. Cell, 2008, 133（3）：462-474.

［61］Liu XP, Liu XY, Zhang J, et al. Molecular and functional characterization of sulfiredoxin homologs from higher plants［J］. Cell Research, 2006, 16（3）：287-296.

［62］Cerveau D, Ouahrani D, Marok MA, et al. Physiological relevance of plant 2-Cys peroxiredoxin overoxidation level and oligomerization status［J］. Plant, Cell & Environment, 2016, 39（1）：103-119.

［63］Waszczak C, Akter S, Jacques S, et al. Oxidative post-translational modifications of cysteine residues in plant signal transduction［J］. Journal of Experimental Botany, 2015, 66（10）：2923-2934.

［64］Gupta R, Luan S. Redox control of protein tyrosine phosphatases and mitogen-activated protein kinases in plants［J］. Plant Physiology, 2003, 132（3）：1149-1152.

［65］Jacques S, Ghesquire B, Van Breusegem F, et al. Plant proteins under oxidative attack［J］. Proteomics, 2013, 13（6）：932-940.

［66］Walton A, Tsiatsiani L, Jacques S, et al. Diagonal chromatography to study plant protein modifications［J］. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Proteins and Proteomics, 2016, 1864（8）：945-951.

［67］Gevaert K, Van Damme J, Goethals M, et al. Chromatographic isolation of methionine-containing peptides for gel-free proteome analysis：identification of more than 800 Escherichia coli proteins［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2002, 1（11）：896-903.

［68］MacCoss MJ, McDonald WH, Saraf A, et al. Shotgun identification of protein modifications from protein complexes and lens tissue［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99（12）：7900-7905.

［69］Jaffrey SR, Erdjument-Bromage H, Ferris CD, et al. Protein S-nitrosylation：a physiological signal for neuronal nitric oxide［J］. Nature Cell Biology, 2001, 3（2）：193-197.

［70］Hao G, Derakhshan B, Shi L, et al. SNOSID, a proteomic method for identification of cysteine S-nitrosylation sites in complex protein mixtures［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, 103（4）：1012-1017.

［71］Rhee KY, Erdjument-Bromage H, Tempst P, et al. S-nitroso proteome of Mycobacterium tuberculosis：Enzymes of intermediary metabolism and antioxidant defense［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2005, 102（2）：467-472.

［72］Cheng G, Ikeda Y, Iuchi Y, et al. Detection of S-glutathionylated proteins by glutathione S-transferase overlay［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2005, 435（1）：42-49.

［73］Klatt P, Molina EP, Pérez-Sala D, et al. Novel application of S-nitrosoglutathione-Sepharose to identify proteins that are potential targets for S-nitrosoglutathione-induced mixed-disulphide formation［J］. Biochemical Journal, 2000, 349（2）：567-578.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on the Oxidative Modification of Plant Proteins Mediated by Reactive Oxygen Species

ZHOU Wen-fei BAI Juan GONG Chun-mei
（College of Life Sciences，Northwest A&F University，Yangling 712100）

Post-translational modification of protein is an important process for precursor protein to its carrying-out function. Some redoxsensitive proteins can be modified reversibly or irreversibly by reactive oxygen species in stress conditions. At present，research on oxidative modification of plants is still in the initial stage. With growing demand on plant developing the ability to defense the harsh environment，more attentions have been focused on the reversible oxidative modification of proteins caused by reactive oxygen species，and some corresponding progresses have been finished in its mechanism and research methods. This review describes the way and sites of oxidative modification of plant proteins and regulation mechanism of various oxidoreductase，aiming at illuminating the significance of reversible oxidative modification in the oxidative stress resulted from defensing the stress to plant. The review also summarizes the effective methods for studying the reversible oxidative modification of proteins. Currently，via mutations of specific sites and proteomics it is feasible to determine whether or not there are reversible oxidative modifications and in which extent the oxidative modification is. Moreover，in future，it is aimed to dissect the reduction and regeneration mechanism by comprehensive experiments to control the proteins involved in reactions.

reactive oxygen species；proteins；post-translational modification；methionine；cysteine

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.002

2016-09-16

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31370599）

周文菲，女，碩士研究生，研究方向：植物逆境生理學(xué)；E-mail：2464731587@qq.com

龔春梅，女，博士，副教授，研究方向：植物逆境生理與分子生物學(xué)；E-mail：gcm228@ nwsuaf.edu.cn