楊 茜 蔣永康 周晟博 王 斌

Ⅱ型巨指癥神經(jīng)脂肪浸潤(rùn)的病理改變

楊 茜 蔣永康 周晟博 王 斌

目的研究Ⅱ型巨指癥患者增粗神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)與功能蛋白表達(dá)。方法以多指正常結(jié)構(gòu)指神經(jīng)為對(duì)照，電鏡下觀察Ⅱ型巨指癥患者增粗神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)；免疫熒光染色評(píng)價(jià)S100、LN和H3K27me3的表達(dá)水平。結(jié)果在巨指癥增粗神經(jīng)中，有髓神經(jīng)纖維數(shù)目顯著減少，部分有髓纖維的髓鞘板層結(jié)構(gòu)皺縮、破壞，施萬細(xì)胞的數(shù)量無明顯改變。在巨指和正常對(duì)照的神經(jīng)纖維中，S100的表達(dá)沒有顯著差異；LN在正常指神經(jīng)中，呈現(xiàn)彌散表達(dá)或低表達(dá)，而在部分巨指增粗神經(jīng)中為點(diǎn)狀陽性表達(dá)；H3K27me3在巨指增粗神經(jīng)組織和正常指神經(jīng)組織中均為陽性表達(dá)。結(jié)論Ⅱ型巨指癥神經(jīng)纖維瘤病變?yōu)榱夹栽錾?，部分髓鞘損害；機(jī)體可以功能代償。因此，臨床需根據(jù)患者神經(jīng)的損傷與代償情況，選擇Ⅱ型巨指癥神經(jīng)的保留或切除。

巨指癥電鏡免疫熒光

先天性巨指（趾）癥可單一指（趾）發(fā)病，也可累及多指（趾），可同時(shí)有并指（趾）和斜指（趾）畸形[1]。Flatt將先天性巨指癥分為4型，Ⅰ型為脂肪增生及脂肪纖維瘤型；Ⅱ型為脂肪增生伴神經(jīng)纖維瘤型，常合并神經(jīng)增粗，伴或不伴骨骼增生；Ⅲ型為脂肪增生伴骨肥大型，骨異常增生常造成骨及鄰近關(guān)節(jié)的畸形；Ⅳ型為偏身肢體肥大型[2]（圖1）。

圖1 Ⅱ型巨指癥中脂肪浸潤(rùn)的增粗神經(jīng)Fig.1 The enlarged nerve with adipose infiltration in typeⅡmacroldactyly

臨床對(duì)于Ⅱ型巨指的治療，主要以糾正形態(tài)異常以及截指等術(shù)式為主[3]，而對(duì)于神經(jīng)功能方面的考慮較少。但對(duì)于患者而言，指神經(jīng)功能是否存在和術(shù)后的有效保留十分重要，尤其是兒童。目前，由于缺乏對(duì)增粗神經(jīng)的相關(guān)基礎(chǔ)研究，尤其是微觀形態(tài)學(xué)觀察，及其功能蛋白表達(dá)的了解，故很難確定術(shù)中需要部分保留還是完整切除增粗的神經(jīng)。因此，我們觀察Ⅱ型巨指病理性增粗神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的改變，同時(shí)比較其與正常指神經(jīng)在S100、LN和H3K27me3等表達(dá)的差異，為Ⅱ型巨指癥神經(jīng)的功能評(píng)價(jià)和手術(shù)改進(jìn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 患者資料

2015年1月至2016年1月，我們收集了9位Ⅱ型巨指癥患兒的12個(gè)神經(jīng)樣品，并以3個(gè)復(fù)拇畸形患者切除指中的神經(jīng)組織為對(duì)照?；颊吣挲g為0.5～15歲（平均2.75歲）。術(shù)前我們測(cè)量了患者患指和對(duì)側(cè)健指的靜態(tài)兩點(diǎn)辨別覺，即2-SPD（部分患兒年齡過小無法依從）。本研究獲患者及其父母知情同意，經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（表1）。將獲取的神經(jīng)組織分為兩部分，分別用于電子顯微鏡檢查和免疫熒光染色。

表1 患者信息與主觀感覺功能評(píng)價(jià)Table1 Patient information and subjective sensory

1.2 主要試劑與儀器

anti-S100、anti-H3K27me3（Abcam，英國），Cy3 AffiniPure通用山羊抗小鼠IgG（EarthOx Life Sciences，美國），DAPI（Invitrogen，美國）。

Eclipse 90i光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本），電子顯微鏡（Philips CM-120，荷蘭），Shandon Finesse 325手動(dòng)旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（Thermo Shandon，英國），Eclipse 90i倒置熒光顯微鏡（Nikon，日本）。

1.3 方法

1.3.1 超微結(jié)構(gòu)觀察

將巨指增粗神經(jīng)組織和正常指神經(jīng)對(duì)照組織在2.5%中性戊二醛中固定2 h，PBS洗滌后，將樣品于4.0℃下1.0%四氧化鋨中固定2 h，在30%、50%、70%乙醇中逐級(jí)脫水，每次10 min，置于環(huán)氧丙烷中10 min，并在含有3.0%乙酸雙氧鈾的70%乙醇中干燥。將環(huán)氧丙烷用環(huán)氧樹脂逐級(jí)置換直至純樹脂，37℃聚合過夜，60℃干燥48 h。樹脂包埋，2.0 mm厚度切片，甲苯胺藍(lán)染色，Eclipse 90i光學(xué)顯微鏡定向，然后用乙酸雙氧鈾染色超薄切片（100 nm），并在80 KV下電鏡觀察。

1.3.2 免疫熒光染色

4.0 %多聚甲醛浸泡1 h，OCT下低溫包埋，Shandon Finesse 325手動(dòng)旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切割成5 mm厚度用于免疫熒光染色。在使用微波修復(fù)抗原后，將切片于37℃下在3.0%BSA中封閉30 min，加入一抗，4.0℃濕盒中溫育過夜，PBS洗滌15～20 min。免疫熒光染色的一抗為anti-S100（1∶200，ab4066）和anti-H3K27me3（1∶200，ab6174）。加入二抗，在37℃黑暗下孵育50 min。二抗為Cy3 AffiniPure通用山羊抗小鼠IgG（1∶200，E031610）。DAPI（1∶500）用于核染色，并在Eclipse 90i倒置熒光顯微鏡下觀察（Cy3紅色激發(fā)波長(zhǎng)510～560 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm）。

2 結(jié)果

2.1 Ⅱ型巨指（趾）癥神經(jīng)組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變

與正常指神經(jīng)相比，巨指神經(jīng)HE染色顯示神經(jīng)束增粗，局部有明顯脂滴浸潤(rùn)，神經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)完整，無異形細(xì)胞（圖2）。電鏡下，有髓神經(jīng)纖維在正常指神經(jīng)組織中集中分布，與正常指神經(jīng)相比，乙酸雙氧鈾/檸檬酸鉛染色切片顯示巨指癥神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維數(shù)目顯著減少，一些有髓纖維的髓鞘板層結(jié)構(gòu)皺縮、破壞。此外，施萬細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)無明顯改變（圖3）。

圖2 指神經(jīng)HE染色Fig.2 HE Staining of digital nerves

圖3 指神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)（標(biāo)尺：A、B為2 μm；C、D為5 μm）Fig.3 Ultra-structural of digital nerves (scale of A,B:2 μm;scale of C,D:5 μm)

2.2 病理增粗神經(jīng)的免疫熒光染色

巨指神經(jīng)組織和正常指神經(jīng)組織均顯示S100陽性染色。在兩種神經(jīng)中，S100的表達(dá)沒有顯著差異（圖4A-D）。LN在正常指神經(jīng)中呈現(xiàn)為稍均質(zhì)的彌散表達(dá)或低表達(dá)，而在部分巨指增粗神經(jīng)樣本中，LN為點(diǎn)狀陽性表達(dá)（圖4E-H）。此外，H3K27me3在巨指增粗神經(jīng)和正常指神經(jīng)組織中均陽性表達(dá)。

圖4 Ⅱ型巨指癥神經(jīng)功能蛋白的表達(dá)（標(biāo)尺：100 μm）Fig.4 Functional protein expression of enlarged nerves in typeⅡmacrodactyly(Scale:100 μm)

3 討論

對(duì)于Ⅱ型巨指癥，是否全部切除增粗的神經(jīng)是困擾整形外科和手外科的難題[3-5]。這主要是由于缺乏對(duì)Ⅱ型巨指癥神經(jīng)脂肪浸潤(rùn)病理改變的認(rèn)識(shí)。而手的神經(jīng)感覺功能對(duì)于患者而言十分重要，尤其是兒童。此外，先天性巨指癥是一類與PIK3CA體細(xì)胞突變相關(guān)的增生性疾病。目前發(fā)現(xiàn)，PIK3CA在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)高突變率，以p.H1047R最為多見，被認(rèn)為是一種癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。因此，不少學(xué)者認(rèn)為Ⅱ型巨指神經(jīng)纖維瘤存在惡變的可能性[6-8]。

已有的文獻(xiàn)報(bào)道均認(rèn)為，Ⅱ型巨指增粗的神經(jīng)表現(xiàn)為纖維脂肪錯(cuò)構(gòu)瘤樣改變[9-10]，神經(jīng)被增厚的神經(jīng)內(nèi)膜結(jié)締組織分隔，神經(jīng)組織周圍脂肪浸潤(rùn)。本研究發(fā)現(xiàn)，相較正常指神經(jīng)，Ⅱ型巨指增粗的神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為有髓神經(jīng)減少和髓鞘損傷（圖2A-B）。在9 700倍視野中，可見部分有髓神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)破壞，板層結(jié)構(gòu)皺縮，神經(jīng)絲消失。我們發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者受累部位的2PD等感覺功能評(píng)價(jià)指標(biāo)明顯下降，體現(xiàn)了神經(jīng)形態(tài)改變與功能影響的一致性。

S100錨定于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的鈣結(jié)合蛋白，主要在周圍神經(jīng)中的施萬細(xì)胞（Schwann cell）中表達(dá)[10]。Kini等[11]報(bào)道，在巨指神經(jīng)束的施旺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)S100的強(qiáng)陽性表達(dá)。Plaza等[9]認(rèn)為，S100在施萬細(xì)胞中為陽性表達(dá)，而在神經(jīng)束膜上無表達(dá)。我們的結(jié)果顯示，S100在巨指增粗神經(jīng)中陽性表達(dá)，但與正常指神經(jīng)相比，兩種神經(jīng)之間的熒光強(qiáng)度沒有顯著差異。電鏡結(jié)果亦證實(shí)，巨指癥增粗神經(jīng)束中的施萬細(xì)胞數(shù)量與正常指神經(jīng)相比無明顯差異，我們推斷，在巨指病理性增粗神經(jīng)中施旺細(xì)胞的比例沒有顯著變化。

目前認(rèn)為，LN與神經(jīng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、分化及腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。許多研究都表明LN是機(jī)體中一種重要的糖蛋白組分。LN是1個(gè)長(zhǎng)臂和3個(gè)短臂組成的大分子量糖蛋白，是各種組織基底膜的重要組成部分，由α、β和γ3個(gè)鏈組成。在胚胎和新生期，LN在周圍神經(jīng)內(nèi)膜管的內(nèi)表面有較多表達(dá)，靠其濃度梯度引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)纖維生長(zhǎng)方向，成年期表達(dá)較少[12-13]。研究認(rèn)為，坐骨神經(jīng)損傷后，LN的表達(dá)重新增多可能與SC的增殖并大量分泌LN從而使其發(fā)揮神經(jīng)導(dǎo)向和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用有關(guān)[14-15]。在巨指癥增粗神經(jīng)中，我們同樣發(fā)現(xiàn)了LN的再聚集和高表達(dá)，提示該部位神經(jīng)損傷后可能存在修復(fù)機(jī)制。在部分患者中我們發(fā)現(xiàn)，其肢體巨大，術(shù)中同樣觀察到神經(jīng)粗大，而術(shù)前2PD指標(biāo)的下降程度與疾病嚴(yán)重程度不一致，間接說明了巨指癥患者神經(jīng)損傷后機(jī)體啟動(dòng)了某種修復(fù)機(jī)制，以代償這種功能下降。

H3K27（H3K27me3）的三甲基化與基因抑制相關(guān)。作為一個(gè)重要的表觀遺傳修飾，H3K27me3和其他甲基化修飾，包括H3K4me3，共定位于一些基因組區(qū)域，調(diào)節(jié)細(xì)胞表型[16]。惡性周圍神經(jīng)鞘瘤（MPNST）中，H3K27me3的失表達(dá)有高度特異性[17]。此外，在MPNST患者中，H3K27me3的失表達(dá)可致其生存率明顯下降[18]。而在巨指癥增粗神經(jīng)組織中，H3K27me3與正常指神經(jīng)呈現(xiàn)同樣的高表達(dá)水平，提示Ⅱ型巨指癥中的神經(jīng)纖維瘤病變?yōu)榱夹栽錾?/p>

4 總結(jié)

綜上所述，在Ⅱ型巨指癥中，增粗的巨指神經(jīng)部分髓鞘損害，但機(jī)體可能存在某種修復(fù)機(jī)制以代償神經(jīng)損傷。此外，Ⅱ型巨指癥中的神經(jīng)纖維瘤病變?yōu)榱夹栽錾?。因此，?duì)于Ⅱ型巨指癥患者，其增粗的神經(jīng)是全部切除、部分切除或保留，應(yīng)根據(jù)術(shù)前客觀評(píng)價(jià)和神經(jīng)代償情況決定。

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Pathologic Characters of the Nerve with Adipose Infiltration in TypeⅡMacrodactylyYANG Xi,JIANG Yongkang,

ZHOU Shengbo,WANG Bin．Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Correspondingauthor:WANGBin(E-mail: wangbinl766@163.com).

ObjectiveTo explore the ultra-structural changes and functional protein expression of enlarged nerves in patients with typeⅡmacrodactyly.MethodsThe ultra-structure of the enlarged nerves in typeⅡmacrodactyly patients was observed under electron microscope.The expression of S100,LN and H3K27me3 were evaluated by immunefluorescence staining.Normal digital nerves from polydactyly patients were used as control.ResultsThe number of myelinated fibers was significantly decreased,and some myelinated lamellar structures were shrunk and destroyed.The number and morphology of Schwann cells did not change significantly.There was no significant difference in the expression of S100 between the macrodactyly group and control group.LN was low expressed in the normal digital nerve,and in the enlarged nerve samples,LN showed a stronger expression.In addition,the expression of H3K27me3 in both enlarged nerve tissue and normal nerve tissue were positive.ConclusionThe neurofibromatosis of typeⅡmacrodactyly is benign hyperplasia.In patients with typeⅡmacrodactyly,the sheath of the enlarged nerves was damaged.However,LN positive staining indicates a repair mechanism to compensate for nerve injury.Therefore,the neurosurgical procedures should be determined according to the neurological damage and compensatory situation in patients in typeⅡmacrodactyly.

Macrodactyly;Electron microscopy;Immunofluorescence

R682.1+5

A

1673－0364（2017）02－0073－04

2017年1月8日；

2017年2月14日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.02.004

國家自然科學(xué)基金（81271725，81571930）：上海市重中之重臨床醫(yī)學(xué)中心項(xiàng)目。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

王斌（E-mail：wangbinl766@163.com）。