鄭 蕊 趙仕芳 朱月倩 周廣東

大孔GT/PCL電紡材料作為軟骨組織工程支架的可行性研究

鄭 蕊 趙仕芳 朱月倩 周廣東

目的探討大孔徑GT/PCL電紡材料作為軟骨組織工程支架的可行性。方法取豬耳郭軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞。大孔徑GT/PCL電紡納米材料設(shè)為實驗組，無紡布GT/PCL電紡納米材料設(shè)為對照組，對二者的形貌特征和孔隙率進(jìn)行觀察比較，在二維平面比較二者與軟骨細(xì)胞的黏附率和細(xì)胞增殖能力，并在三維空間比較軟骨細(xì)胞的浸潤情況。結(jié)果掃描電鏡顯示，實驗組材料孔徑明顯大于對照組，孔隙率測試數(shù)據(jù)也支持該結(jié)果；二維平面上，兩組材料對軟骨細(xì)胞的黏附和增殖能力無顯著性差異，SEM顯示實驗組軟骨細(xì)胞可長入材料內(nèi)部；三維空間中，軟骨細(xì)胞在實驗組的浸潤深度明顯大于對照組。結(jié)論大孔GT/PCL電紡材料不影響軟骨細(xì)胞的黏附與增殖，明顯利于軟骨細(xì)胞的長入和浸潤，在軟骨組織工程的應(yīng)用上具有良好的前景。

大孔電紡材料軟骨組織工程孔隙率

納米纖維電紡材料作為一種新型材料，已廣泛應(yīng)用于多種組織工程的支架構(gòu)建[1-3]。常用無紡布電紡納米材料纖維直徑小、排列密集，模仿了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞黏附[4]；但是，因其密集的纖維排列和極小的孔徑，限制了細(xì)胞長入和營養(yǎng)滲透。

大孔徑電紡納米材料在電紡纖維的基礎(chǔ)上，極大地擴(kuò)大了材料的孔徑范圍，成為解決這一問題的有效途徑。本研究中使用的大孔徑GT/PCL電紡納米材料，是絕緣模板靜電紡制備的新型大孔徑電紡材料，制作簡單、圖案精美、孔徑范圍大[5]。

為了證實這種新型大孔徑電紡材料在組織工程軟骨中的應(yīng)用可能，我們以GT/PCL無紡布電紡膜片為對照，比較兩者在軟骨組織構(gòu)建中的相關(guān)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生雜交豬（上海甲干生物科技有限公司），雌雄不限，體質(zhì)量2～5 Kg。實驗過程均依照動物實驗保護(hù)指南進(jìn)行。

1.2 實驗試劑和儀器

胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Worthington公司，美國）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Hyclone公司，美國）；無紡布GT/PCL電紡膜、大孔GT/PCL電紡膜（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，GT∶PCL＝70∶30）。

真空干燥箱（上海一恒科技有限公司，中國）；掃描電子顯微鏡（JEOL公司，日本）；熒光正置顯微鏡（Nikon公司，日本）；酶標(biāo)儀（Thermo，美國）。

1.3 細(xì)胞獲取

取豬耳郭軟骨，洗凈，切成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入5倍于組織體積的0.25%膠原酶，搖床消化過夜，次日，用75 μm孔徑的濾網(wǎng)濾過后離心。細(xì)胞沉淀PBS漂洗2遍，以含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，按2×106個/皿（直徑10 cm培養(yǎng)皿）密度接種，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞生長達(dá)90%融合時傳代[6]，取第二代軟骨細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4 孔隙率測試

取干燥的大孔GT/PCL支架和無紡GT/PCL支架，分別設(shè)為實驗組和對照組，制備成直徑15 mm的小圓片，用分析天平稱量得其干重（W），并用螺旋測微器測量得其厚度（T）。通過PCL和明膠在復(fù)合支架中的質(zhì)量比，計算得出支架的平均密度Δ為0.7823 g/cm3,其結(jié)果由公式①計算得出；支架的表觀密度Δ1（g/cm3）由公式②計算得出；支架的空隙率K（%）由公式③計算得出。

其中ΔPCL為PCL的密度1.021 g/cm3,ΔGT為明膠的密度0.68 g/cm3。

其中W為支架的干重，T為復(fù)合支架的厚度，R為支架的直徑。

其中Δ1為支架的表觀密度，Δ為支架的平均密度。

1.5 細(xì)胞黏附與增殖實驗

細(xì)胞黏附實驗：采用細(xì)胞計數(shù)的方法。在24孔板上以2.0×105個/孔的細(xì)胞密度，將軟骨細(xì)胞接種于GT/PCL納米纖維電紡膜表面，6片/組，24 h后，吸取上清，用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，每孔計數(shù)3次，根據(jù)公式計算黏附率。黏附率＝(接種細(xì)胞-未黏附細(xì)胞-流失細(xì)胞)/(接種細(xì)胞-流失細(xì)胞)，計算出兩組GT/ PCL納米纖維電紡膜與軟骨細(xì)胞的黏附率[3]。

細(xì)胞增殖實驗：采用CCK-8法，取大孔GT/PCL材料和無紡布GT/PCL材料（0.5 mm×15 mm）放入24孔板中，75%乙醇浸泡30 min，PBS沖洗3次，晾干，在其上接種軟骨細(xì)胞，密度為2.0×104個/孔，選取第1、3、5、7、9、11天進(jìn)行檢測[7]。樣本數(shù)量為6個標(biāo)本/組·時間點。

1.6 掃描電鏡觀察

單純材料：制備的GT/PCL大孔材料和無紡布材料放于真空干燥箱中干燥，用剪刀將其剪切成小片，導(dǎo)電膠固定，噴金，在10 KV的加速電壓下，掃描電鏡觀察靜電紡納米纖維的形貌[3]。每個試樣取三個平行樣品。

細(xì)胞-材料復(fù)合物：消化收集軟骨細(xì)胞，將直徑15 mm的GT/PCL納米纖維電紡膜放入24孔板培養(yǎng)皿內(nèi)，以2.0×105個/孔的細(xì)胞密度接種軟骨細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，復(fù)合物取出后2.5%戊二醛固定，掃描電鏡觀察。

1.7 三維細(xì)胞材料復(fù)合物構(gòu)建

將大孔圖案化納米纖維膜層層疊加至0.5 mm厚度，構(gòu)建出3D大孔支架；另將無紡布納米纖維膜層層疊加至0.5 mm厚度，構(gòu)建出3D無紡布支架。真空凍干消毒[2]。取軟骨細(xì)胞按照50.0×106cells/mL密度接種于上述三維支架上，體外培養(yǎng)，24 h后取材，-80℃保存。

1.8免疫熒光檢測

取細(xì)胞材料復(fù)合物，冰凍切片，DAPI染色劑染細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞在材料中的浸潤狀況。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 材料形貌觀察

SEM顯示實驗組電紡纖維選擇性沉積，在空洞部分沉積較少，形成規(guī)律的大孔結(jié)構(gòu)（圖1A），纖維稀疏，孔徑明顯變大（圖1C）。對照組電紡纖維分布均勻，層層疊加（圖1B、D），孔徑小于10 μm。

圖1 掃描電鏡下不同材料的形貌特征Fig.1 SEM image showing the nanofibrous morphology of the scaffolds

2.2 孔隙率測試

納米纖維支架的孔隙率對于營養(yǎng)物質(zhì)的交換、廢物排出，以及細(xì)胞的長入至關(guān)重要。孔隙率測試顯示，大孔材料的孔隙率高于無紡布材料，兩者有顯著性差異（圖2）。

圖2 不同電紡材料的孔隙率（*：P＜0.05）Fig.2 The porosity of different scaffolds(*:P＜0.05)

2.3 軟骨細(xì)胞與材料黏附率與細(xì)胞增長曲線

細(xì)胞材料黏附率顯示，實驗組和對照組在軟骨細(xì)胞黏附方面無明顯差異（圖3A）。細(xì)胞增長曲線顯示，軟骨細(xì)胞在兩組材料上均生長良好，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（圖3B），這可能跟材料本身明膠含量較高，利于細(xì)胞黏附與增殖有關(guān)。

圖3 軟骨細(xì)胞與不同材料的黏附率和細(xì)胞增殖曲線Fig.3 Adhesion rate and proliferation curves of chondrocytes with different scaffolds

2.4 電鏡下細(xì)胞材料黏附情況

軟骨細(xì)胞接種于材料表面7 d后進(jìn)行SEM檢測，結(jié)果顯示，兩組材料表面細(xì)胞均伸展良好，顯示出良好的細(xì)胞相容性；實驗組軟骨細(xì)胞明顯進(jìn)入大孔材料內(nèi)部（圖4A），而對照組細(xì)胞黏附于材料表面，無法深入內(nèi)部（圖4B）。

圖4 掃描電鏡下軟骨細(xì)胞在不同材料表面生長的形貌（標(biāo)尺為10 μm）Fig.4 SEM image showing the cell morphology on different scaffolds(scale bars:10 μm)

圖5 細(xì)胞在不同三維支架材料中的浸潤情況（標(biāo)尺為100 μm）Fig.5 The cellular infiltration on the different 3D materials (scale bars:100 μm)

2.5三維支架細(xì)胞滲透情況檢測

細(xì)胞材料復(fù)合物體外培養(yǎng)24 h后進(jìn)行免疫熒光檢測，結(jié)果顯示，實驗組軟骨細(xì)胞進(jìn)入三維支架的深度明顯高于對照組（圖5A、B），且大孔支架顯示出良好的均質(zhì)性。無紡布材料相對更容易分層。

3 討論

材料的孔徑大小、形態(tài)和孔隙率是組織評價組織工程支架的重要指標(biāo)，在組織構(gòu)建中，這些參數(shù)極大地影響細(xì)胞的黏附、伸展以及營養(yǎng)的滲透。

電紡納米材料由于具有和天然基質(zhì)相似的微觀結(jié)構(gòu)而被廣泛應(yīng)用于多種組織的構(gòu)建，如皮膚、軟骨、神經(jīng)等[1－2，8]。但是，靜電無紡布膜極細(xì)的纖維和較小的孔徑也引發(fā)一些問題。據(jù)文獻(xiàn)報道，只有小的納米粒子（＜300 nm）可以穿過靜電紡無紡布膜，而大于1 μm的顆粒則被截留[9]。已知多數(shù)動物細(xì)胞的直徑在10～100 μm。因此，傳統(tǒng)的靜電無紡布膜片極大限制了細(xì)胞的長入和營養(yǎng)滲透，不利于三維組織的構(gòu)建。

本研究所使用的圖案化大孔電紡材料很好地彌補(bǔ)了這一不足。近年來，多種方法被用于擴(kuò)大電紡材料的孔徑，如粒子致孔法、激光刻蝕法、超聲法，以及多種接收裝置改進(jìn)的辦法[10-13]，但這些方法都有各自的局限，如：支架機(jī)械性能差；支架的孔徑小或孔不連通；孔徑過大，導(dǎo)致了很多細(xì)胞堆積在一個孔中，無法發(fā)揮納米纖維優(yōu)勢等。本研究中所使用的絕緣模板靜電紡制備的圖案化材料，通過改進(jìn)接收裝置，發(fā)明了一種簡便有效的規(guī)律性大孔納米纖維材料制備方法[5]，首次發(fā)現(xiàn)不導(dǎo)電模板也可以精確地控制纖維的沉積和圖案結(jié)構(gòu)的形成，填補(bǔ)了圖案化纖維領(lǐng)域的空白，具有操作簡便、時間短、成本低的優(yōu)點。

研究結(jié)果顯示，通過絕緣模板靜電紡的方法制備的電紡材料孔徑和孔隙率明顯大于傳統(tǒng)的電紡無紡布材料，且孔徑分布規(guī)律；細(xì)胞黏附和細(xì)胞增殖曲線顯示，大孔材料具有和無紡布材料類似的細(xì)胞相容性，說明孔徑的增大沒有影響電紡納米材料的細(xì)胞黏附能力；且實驗組軟骨細(xì)胞明顯長入材料內(nèi)部，而對照組細(xì)胞僅黏附于材料表面，說明孔徑的擴(kuò)大明顯利于細(xì)胞在材料中的浸潤；細(xì)胞材料復(fù)合物的免疫熒光檢測也顯示出同樣的趨勢，大孔材料組的細(xì)胞長入材料的深度明顯高于無紡布材料組。這些結(jié)果提示我們，無論是在平面材料還是三維材料支架中，電紡纖維孔徑的擴(kuò)大明顯促進(jìn)了軟骨細(xì)胞在支架材料中的滲透。未來，我們還將對大孔材料在長時間軟骨三維構(gòu)建中的作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究首次對絕緣模板靜電紡制備的圖案化大孔材料，進(jìn)行細(xì)胞和組織學(xué)檢測，證實其在增加材料孔徑的基礎(chǔ)上，仍然具有良好的細(xì)胞相容性，利于軟骨細(xì)胞的生長和營養(yǎng)滲透，具有良好的應(yīng)用前景。

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The Feasibility of the Macroporous GT/PCL Electrospun Material as Scaffold for Cartilage Tissue Engineering

ZEHNG Rui1,3,4,ZHAO Shifang2，ZHU Yueqian3,4,ZHOU Guangdong3，4.1 Department of Dermatology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 College of Chemistry, Chemical Engineering＆Biotechnology，Donghua University,Shanghai 201620，China;3 Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;4 National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China. Corresponding author:ZHOU Guangdong(E-mail:Guangdongzhou@126.com).

ObjectiveTo investigate the feasibility of the macroporous gelatin/polycaprolactone(GT/PCL)electrospun material as scaffold for cartilage tissue engineering.MethodsThe auricular chondrocytes of porcine were harvested as seed cells.Two kinds of electrospun membrane were prepared and compared：the macroporous membranes(experimental group) and the non-woven membranes(control group)as scaffolds.The structure and porosity of the two materials were observed. Adhesion and proliferation of chondrocytes on the two membranes were examined in two-dimensional level(2D).And the depth of cellular infiltration were observed in three-dimensional level(3D).ResultsScanning electron microscope(SEM) results suggested that the pore size of the experimental group was significantly bigger than the control group,and the data of porosity supported this result.In 2D level,there was no significant difference in adhesion and proliferation of chondrocytes between the two groups.However,SEM showed that chondrocytes grew into the interior of the macroporous material.In 3D level,the infiltration depth of chondrocytes in the experimental group was significantly greater than that in the control group. ConclusionThe macroporous GT/PCL membranes do not affect the adhesion and proliferation of chondrocytes,and it is beneficial to the growth and infiltration of chondrocytes.It could be a promising scaffold for cartilage tissue engineering.

Macroporous electrospun material;Tissue engineering;Porosity

R318.08

A

1673－0364（2017）02－0066－04

2017年2月5日；

2017年3月17日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.02.002

國家自然科學(xué)基金（81401532）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20160350）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院皮膚科（鄭蕊）；201620上海市東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院（趙仕芳）；200011上海市上海市組織工程研究重點實驗室（鄭蕊，朱月倩，周廣東）；200241上海市組織工程國家工程中心（鄭蕊，朱月倩，周廣東）。

周廣東（E-mail：guangdongzhou@126.com）。