鄧明武 張溢晨 李 東 于子優(yōu) 王祥盛 張文杰

藏紅花素對光老化皮膚成纖維細(xì)胞的影響

鄧明武 張溢晨 李 東 于子優(yōu) 王祥盛 張文杰

目的探討藏紅花素對光老化皮膚成纖維細(xì)胞的影響，期望從細(xì)胞水平闡明藏紅花素抗皮膚光老化的作用與機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法①分離培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，以不同濃度藏紅花素（0、50、100、200 μM）處理皮膚成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，應(yīng)用CCK－8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況。②以不同劑量紫外線（25、50、100 mJ/cm2）照射皮膚成纖維細(xì)胞，72 h后應(yīng)用CCK－8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況。③以不同濃度藏紅花素（0、12.5、25、50、100 μM）處理皮膚成纖維細(xì)胞24 h，紫外線（100 mJ/cm2）照射后即刻，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇含量；照射后48 h后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；照射后72 h后，應(yīng)用CCK－8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，并提取細(xì)胞RNA，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞Ⅰ型膠原的表達(dá)。結(jié)果①低濃度藏紅花素（50、100 μM）對皮膚成纖維細(xì)胞增殖無顯著影響，高濃度藏紅花素（200 μM）可促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖。②紫外線照射可顯著抑制皮膚成纖維細(xì)胞增殖，并呈量效依賴關(guān)系。③紫外線照射提高細(xì)胞活性氧簇產(chǎn)生、抑制細(xì)胞增殖、抑制Ⅰ型膠原的表達(dá)，藏紅花素（12.5、25、50、100 μM）能減少紫外線照射引起的細(xì)胞活性氧簇產(chǎn)生，恢復(fù)細(xì)胞周期和Ⅰ型膠原的合成能力。結(jié)論藏紅花素通過減少細(xì)胞活性氧簇，產(chǎn)生抵抗紫外線照射的作用，恢復(fù)皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和膠原合成能力，起到抗光老化作用。

皮膚光老化藏紅花素抗氧化

皮膚光老化（Photoaging）是由于皮膚長期受到日光照射所引起的損害，表現(xiàn)為皮膚粗糙、增厚、深而粗的皺紋，局部有過度的色素沉著或毛細(xì)血管擴(kuò)張等，其病理機(jī)制主要包括紫外線抑制皮膚成纖維細(xì)胞增殖和膠原分泌，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶合成而導(dǎo)致膠原降解等[1]。改善皮膚光老化的方法有很多，包括藥物治療、外科治療、注射性治療等[2]，其中抗衰老化妝品的應(yīng)用較為普及。

藏紅花（番紅花，Crocus sativus L.），是一種鳶尾科番紅花屬的多年生花卉，含胡蘿卜素類化合物，主要成分為藏紅花素（Crocin）和藏紅花酸（Crocitin）[3]。藏紅花具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老和美容養(yǎng)顏的功效，其作用機(jī)理的亞久主要集中于藏紅花素，重點(diǎn)在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等方面，而在抗皮膚衰老方面缺乏相關(guān)研究[3-4]。基于光老化過程中的病理變化，研究藏紅花素對皮膚成纖維細(xì)胞的影響，有望從細(xì)胞水平闡明藏紅花素抗皮膚光老化的作用與機(jī)理，為推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

主要試劑包括：藏紅花素、Propidium iodide、FITC-Phalloidin（美國Sigma公司），胎牛血清（美國HYCLONE公司），高糖DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國Gibco公司），維生素C（上海伯奧生物科技公司），Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶（美國Invitrogen公司），Rosiglitazone粉劑（美國Abcam公司），CCK-8試劑盒（美國Beyotime公司），β-半乳糖苷酶染色試劑盒（美國CST公司），ROS檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司）。

主要儀器包括：UVB燈管TL20W 01-RS（荷蘭Philips公司），紫外光能量測試儀（中國臺灣Lutron公司），共聚焦熒光顯微鏡（德國Lecia公司），倒置顯微鏡及攝像系統(tǒng)（日本Olympus公司），全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），流式細(xì)胞檢測儀（美國Beckman Coulter公司），熒光定量PCR儀（美國Agilent Technologies公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

正常人皮膚組織來自我院泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)廢棄組織，獲患者知情同意。將切取的正常皮膚組織用0.25%氯霉素和生理鹽水沖洗3遍，去除皮下結(jié)締組織；將皮膚剪成小塊，加入0.3%（w/v）的中性蛋白酶，4℃消化過夜；次日分離表皮真皮，將真皮成分剪成糊狀，加入0.3%Ⅳ型膠原酶，37℃搖床中消化3 h后，200目篩網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS振蕩混勻，1 500 r/min離心5 min，以洗去膠原酶，棄上清，加DMEM制成細(xì)胞混懸液，接種于含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，3 d換液一次，5 d傳代一次。實(shí)驗(yàn)采用第3、4代成纖維細(xì)胞。

1.2.2 藏紅花素溶液的配置

藏紅花粉劑溶于無菌PBS中，終濃度10 mmol/L，避光保存。使用時以含10%血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成12.5、25、50、100、200 μM濃度。

1.2.3 藏紅花素對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響

取成纖維細(xì)胞以2 000個/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，分別加入不同濃度（0、50、100、200 μM）藏紅花素，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h后應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞光老化模型的建立

取成纖維細(xì)胞以2 000個/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，加入10 μL PBS，將96孔板置于UVB燈管正下方6 cm，能量測試儀測紫外光強(qiáng)度，計算照射時間，使照射總劑量分別達(dá)到25、50、100 mJ/cm2，將不接受紫外線照射的細(xì)胞設(shè)為對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔，照射后吸去PBS，重新加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 藏紅花素抗皮膚成纖維細(xì)胞光老化作用

取成纖維細(xì)胞以2 000個/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，以及1×105個/孔的密度接種于6孔板，分別加入不同濃度（0、12.5、25、50、100 μM）藏紅花素和150 μM維生素C，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，96孔板中加10 μL PBS，6孔板中加入400 μL PBS，將96孔板、6孔板置于UVB燈管正下方6 cm，照射總劑量為100 mJ/cm2。將不接受紫外線照射的細(xì)胞設(shè)為空白對照組，不加入藏紅花素的細(xì)胞設(shè)為陰性對照組（UVB組），加入維生素C的細(xì)胞設(shè)為陽性對照組（Vit C組），照射后分別檢測：①照射后即刻，應(yīng)用ROS試劑盒染色，共聚焦顯微鏡觀察；胰酶消化細(xì)胞后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。②照射后24 h，胰酶消化收集細(xì)胞，Propidium iodide染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期；③照射后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況；④照射后72 h，收集細(xì)胞提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測Ⅰ型膠原基因表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS.19統(tǒng)計軟件進(jìn)行0ne-Way ANOVA-Dunnett統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 藏紅花素對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響

為了明確單純藏紅花素對細(xì)胞是否有毒副作用，首先對培養(yǎng)至第3或4代的皮膚成纖維細(xì)胞予以不同濃度藏紅花素（0、50、100、200 μM）處理。孵育72 h后，CCK－8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，低濃度（50、100 μM）藏紅花素對成纖維細(xì)胞增殖無顯著影響，而高濃度（200 μM）藏紅花素可顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖（圖1），提示藏紅花素對成纖維細(xì)胞無毒副作用。

圖1 不同濃度藏紅花素對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of crocin on the proliferation of skin fibroblasts

2.2 細(xì)胞光老化模型的建立

為了探索合適的照射劑量，給予第3代皮膚成纖維細(xì)胞不同劑量的UVB照射（25、50、100 mJ/cm2），72 h后應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示，UVB照射能抑制成纖維細(xì)胞增殖，抑制作用與照射劑量呈量效依賴關(guān)系（圖2），根據(jù)抑制作用程度，選擇100 mJ/cm2作為光老化模型的照射劑量。

圖2 不同紫外線照射劑量對皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of different doses of ultraviolet light on the proliferation of skin fibroblasts

2.3 藏紅花素抗皮膚成纖維細(xì)胞光老化的作用

不同濃度藏紅花素（0、12.5、25、50、100 μM）預(yù)處理皮膚成纖維細(xì)胞24 h，UVB（100 mJ/cm2）照射后即刻檢測細(xì)胞內(nèi)ROS，與不照光的對照組相比，UVB照射顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS含量，而抗氧化劑維生素C可抑制ROS的產(chǎn)生，藏紅花素同樣也能抑制ROS的產(chǎn)生（表1）。

表1 藏紅花素對紫外線照射后成纖維細(xì)胞胞內(nèi)ROS的影響Table1 Effects of crocin on the intracellular ROS of skin fibroblasts after ultraviolet irradiation

細(xì)胞周期分析顯示，紫外線照射后G0/G1期細(xì)胞數(shù)量減少，G2/M期細(xì)胞顯著增加，而維生素C和藏紅花素處理都能恢復(fù)細(xì)胞周期，使之與正常細(xì)胞周期接近（表2）。

表2 藏紅花素對紫外線照射后成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響Table2 Effects of crocin on cell cycle of skin fibroblasts after ultraviolet irradiation

細(xì)胞增殖檢測顯示，紫外線照射后出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制，而維生素C和藏紅花素都能抵抗紫外線的抑制作用，恢復(fù)細(xì)胞增殖（圖3）。

圖3 不同濃度藏紅花素對紫外線照射后皮膚成纖維細(xì)胞增殖影響Fig.3 Effects of different concentrations of crocin on the proliferation of skin fibroblasts after ultraviolet irradiation

RT-PCR分析顯示，細(xì)胞Ⅰ型膠原的表達(dá)在紫外線照射后顯著降低，而維生素C和藏紅花素處理均能恢復(fù)細(xì)胞Ⅰ型膠原的表達(dá)（圖4）。

圖4 藏紅花素對紫外線照射后成纖維細(xì)胞I膠原表達(dá)影響Fig.4 Effects of different concentrations of crocin on the expression of type I collagen of skin fibroblasts after ultraviolet irradiation

3 討論

皮膚光老化常見于長期戶外工作的人群，其外觀表現(xiàn)與自然老化的皮膚明顯不同。自然老化通常表現(xiàn)為皮膚變薄、松弛，而光老化皮膚表現(xiàn)為皮膚粗糙、增厚、深而粗的皺紋，局部有過度的色素沉著或毛細(xì)血管擴(kuò)張等[5]。文獻(xiàn)報道一名從事貨運(yùn)25年的卡車司機(jī)，其左半側(cè)臉因受長期光照，呈現(xiàn)出光老化的皮膚改變，而右半側(cè)表現(xiàn)為皮膚自然老化的特征，顯示了光老化的累積效應(yīng)[6]。皮膚光老化的病理機(jī)制研究認(rèn)為，紫外線對皮膚上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生損傷，抑制細(xì)胞增殖和膠原的分泌，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶合成的增加，進(jìn)而促進(jìn)膠原的降解。紫外線照射可使細(xì)胞內(nèi)的ROS增加，影響細(xì)胞活力和功能，還可引起DNA突變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期阻滯[7]。

皮膚光老化的預(yù)防主要在于減少紫外線輻射，和涂抹防嗮霜等，對于已經(jīng)受紫外輻射的皮膚，可以采用保護(hù)性的面膜修復(fù)等方法。從損傷機(jī)制分析，具有抗ROS產(chǎn)生的化合物，理論上可以起到修復(fù)的作用，除了常見的還原劑（如維生素C）以外，一些植物及中藥提取物也被廣泛應(yīng)用，例如蘆薈、藏紅花等[8]。藏紅花是傳統(tǒng)中藥材，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老和美容養(yǎng)顏的功效。研究表明，藏紅花素具有抗氧化作用，能保護(hù)氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞損傷等[9-11]。因此，我們推測其可以對抗光老化過程中，細(xì)胞內(nèi)異常增高的ROS，進(jìn)而修復(fù)損傷的細(xì)胞。

本研究首先分析了藏紅花素對皮膚成纖維細(xì)胞的毒副作用，我們檢測了50、100、200 μM藏紅花素對成纖維細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，低濃度（50、100 μM）藏紅花素對成纖維細(xì)胞增殖無顯著影響，而高濃度（200 μM）藏紅花素能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，提示藏紅花素對成纖維細(xì)胞無毒副作用，這與文獻(xiàn)報道的相關(guān)結(jié)果一致[12]。

紫外燈照射是常用的光老化模型，不同劑量的照射可以產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，以往研究采用的照射劑量有一定的差別，低劑量照射可以產(chǎn)生細(xì)胞老化作用，而大劑量的紫外線照射可以直接引起細(xì)胞的壞死和凋亡[13]。為了建立光老化模型，我們探討了不同的紫外線照射劑量對細(xì)胞的影響，合適的照射劑量可引起細(xì)胞的損傷，但不會導(dǎo)致細(xì)胞的壞死和凋亡，以達(dá)到造成細(xì)胞老化的目的。本實(shí)驗(yàn)中，皮膚成纖維細(xì)胞在受到不同劑量紫外線照射后，細(xì)胞增殖均有抑制，并呈量效依賴關(guān)系，該劑量范圍內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壞死和凋亡。因此，實(shí)驗(yàn)選擇100 mJ/cm2為光老化模型照射劑量。

為了證實(shí)藏紅花素抗皮膚成纖維細(xì)胞光老化的作用，我們對藥物及紫外光照處理的細(xì)胞進(jìn)行了多個指標(biāo)的分析。本實(shí)驗(yàn)中，皮膚成纖維細(xì)胞在受到紫外線照射后，出現(xiàn)胞內(nèi)ROS水平升高，細(xì)胞周期在G2/M期阻滯，細(xì)胞增殖下降，Ⅰ型膠原合成減少，但沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壞死和凋亡，符合細(xì)胞光老化的特征。陽性對照組維生素C處理，可降低胞內(nèi)ROS水平，恢復(fù)細(xì)胞的增殖能力，與文獻(xiàn)報道一致[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素處理同樣具有降低胞內(nèi)ROS的作用，并能對抗紫外線照射引起的細(xì)胞周期阻滯，恢復(fù)細(xì)胞的增殖能力，這可能與藏紅花素降低胞內(nèi)ROS水平，使得DNA損傷減少有關(guān)。提示藏紅花素具有抗皮膚成纖維細(xì)胞光老化的作用。研究中，我們采用了不同的藥物劑量，但沒有看到明顯的量效依賴關(guān)系，說明在現(xiàn)有的損傷程度下，低劑量藏紅花素可能已產(chǎn)生飽和的作用。反復(fù)多次照射，加大細(xì)胞損傷后，藏紅花素是否會顯示更顯著的保護(hù)作用，則需要進(jìn)一步探討。

以往研究表明，紫外照射引起細(xì)胞內(nèi)ROS增多，可導(dǎo)致一系列信號通路的激活或抑制[16]。比如抑制TGF-β通路，抑制細(xì)胞外基質(zhì)膠原的合成；激活MAPK通路，導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶生成增多，促使膠原蛋白等降解增多。我們推測，藏紅花素也是通過降低胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而激活或抑制相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，使膠原合成增加，基質(zhì)金屬蛋白酶生成減少，相關(guān)信號通路分子的變化正在進(jìn)一步研究中。

綜上所述，本研究證實(shí)，藏紅花素可通過減少細(xì)胞ROS，產(chǎn)生抵抗紫外線照射作用，恢復(fù)皮膚成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成能力，起到抗光老化作用。

本論文第二作者為高中學(xué)生，利用假期及課余時間，全程參與了本課題的細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理，以及結(jié)果收集和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，為培養(yǎng)和鼓勵青少年對基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的興趣和熱情，并結(jié)合其在本課題中的貢獻(xiàn)程度，將其列為第二作者。特此說明。

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Effects of Crocin on Photoaged Skin FibroblastsDENG Mingwu1,ZHANF Yicheng2,LI Dong1,YU Ziyou1,WANF

Xiangsheng1,ZHANG Wenjie1.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.2 ShanghaiStarrierBilingualSchool,Shanghai201108,China.Correspondingauthor:ZHANGWenjie(E-mail: wenjieboshi@aliyun.com).

ObjectiveTo investigate the protective effects of crocin on photoaged skin fibroblasts,and elucidate the mechanism of crocin on anti-photoaging,which could provide new evidence for clinical application of crocin.Methods1. Human skin fibroblasts were isolated and treated with different concentration of crocin(0,50,100,100 μM)for 72 hours.CCK－8 assay was performed to detect cell proliferation.2.Fibroblasts were irradiated with different doses of ultraviolet light(25,50, 100 mJ/cm2),cell proliferation was measured by CCK－8 kit after 72 hours.3.Fibroblasts were treated with different concentration of crocin(0,50,100,100 μM)for 24 hours and irradiated by ultraviolet light(100 mJ/cm2).Intracellular reactive oxygen species(ROS)were analyzed immediately by flow cytometry.Cell cycles were analyzed 48 hours after irradiation by flow cytometry.Seventy-two hours after treatment,cell proliferation was measured by CCK－8 kit,total RNA was extracted,and the expression of typeⅠcollagen were detected by RT-PCR.Results1.Low concentration of crocin(50,100 μM)had no significant effect on the proliferation of skin fibroblasts while high concentration of crocin(200 μM)promoted cell proliferation. 2.Ultraviolet irradiation inhibited the proliferation of skin fibroblast in a dose dependent manner.3.Ultraviolet irradiation enhanced cellular level of ROS,and inhibited cell proliferation and the expression of typeⅠcollagen.Crocin(12.5,25,50,100 μM)treatment reduced the production of ROS caused by ultraviolet irradiation,and restored the cell cycle,cell proliferation,and type I collagen expression.ConclusionCrocin prevent the photoaging of dermal fibroblasts against ultraviolet irradiation by reducing the cellular level of ROS and restoring the cell cycle and type I collagen expression.

Skin photoaging;Crocin;Antioxidation

R758.14

A

1673－0364（2017）02－0077－05

2017年1月12日；

2017年3月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.02.005

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科；上海市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（鄧明武，李東，于子優(yōu)，王祥盛，張文杰）；201108上海市上海星河灣雙語學(xué)校（張溢晨）。

張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。