胡 桓 鄭江紅

iRGD-外泌體-阿霉素抑制成纖維細胞體外增殖的研究

胡 桓 鄭江紅

目的探討應用iRGD-外泌體-阿霉素抑制成纖維細胞體外增殖的有效性及靶向性。方法體外轉(zhuǎn)染iRGD，提取外泌體，通過電穿孔包裹阿霉素，利用流式細胞儀檢測iRGD-外泌體-阿霉素對成纖維細胞的親和力，并對iRGD-外泌體-阿霉素抑制成纖維細胞的增殖能力進行分析。結(jié)果iRGD-外泌體-阿霉素對成纖維細胞的親合力高于空白轉(zhuǎn)染-外泌體-阿霉素；iRGD-外泌體-阿霉素可明顯抑制成纖維細胞的增殖，空白轉(zhuǎn)染-外泌體-阿霉素無明顯的抑制作用。結(jié)論iRGD-外泌體-阿霉素能通過靶向作用于成纖維細胞，以抑制成纖維細胞的增殖，可應用于瘢痕疙瘩的治療研究。

外泌體阿霉素瘢痕疙瘩成纖維細胞

瘢痕疙瘩是一種具有特殊性質(zhì)的病理性瘢痕，表現(xiàn)為成纖維細胞的異常增殖，不同個體臨床表現(xiàn)不同，治療效果也不盡相同。瘢痕疙瘩不但嚴重影響外觀，導致關節(jié)及體表器官功能障礙，還可影響兒童肢體及關節(jié)的正常發(fā)育[1]。瘢痕疙瘩的病因尚不明確，單純手術切除術后復發(fā)率高，且手術治療相對復雜、并發(fā)癥風險較高。因而，藥物治療聯(lián)合手術切除或放療，是目前治療瘢痕疙瘩的主要方法。文獻報道，外泌體為一種特異性的納米囊泡載體，能包裹阿霉素等化療藥物，利用外泌體的特性可降低傳統(tǒng)化療的副作用，并顯著降低藥物的溶解性和循環(huán)中較短的半衰期，而通過iRGD-外泌體靶向作用于成纖維細胞上的αν整合素，可抑制成纖維細胞增殖[2]。我們根據(jù)iRGD與αν整合素特異性結(jié)合的原理[3]，體外轉(zhuǎn)染iRGD與外泌體結(jié)合，經(jīng)電穿孔將阿霉素包裹于外泌體中，iRGD-外泌體-阿霉素靶向結(jié)合成纖維細胞，經(jīng)胞吞作用將阿霉素攝入細胞內(nèi)，起到抑制成纖維細胞異常增殖的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

成纖維細胞（3T6）、人腎上皮細胞系（293T）均購于中科院上海細胞所[4]；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)液、胰酶、PBS（凱基生物）；外泌體提取試劑（美國Invitrogen公司）；阿霉素（美國Sigma公司）。

電穿孔儀（美國Invitrogen公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

在DMEM培養(yǎng)基中加入10%的小牛血清，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T細胞，待細胞融合至85%～90%時，傳代培養(yǎng)，收集第6～8代293T細胞用于后續(xù)實驗[5]。

1.2.2 質(zhì)粒構建與細胞轉(zhuǎn)染

將293T細胞接種至六孔板，待細胞85%～90%融合時，按Lipofectamine 2000說明書配置溶液A：240 μL無血清DMEM+10 μL Lipofectamine2000；溶液B：233 μL無血清DMEM+17 μL pcDNA3.1（+）-hLAMP2b-Cys-iRGD質(zhì)粒。質(zhì)粒序列：TGCTGTAGAGGTGACAAAGGCCCAGATTGTGGTGGATCATGC。將A、B溶液在5 min內(nèi)混勻，室溫放置20 min后，每孔各加入2 mL DMEM，A、B混合液懸滴加入培養(yǎng)液中，標記為空白轉(zhuǎn)染組（對照組）、iRGD轉(zhuǎn)染組（實驗組）。搖動培養(yǎng)板輕輕混勻，放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換含10%胎牛血清的FBS培養(yǎng)液，24 h后收集上清，提取外泌體[6]。

1.2.3 外泌體的提取

細胞轉(zhuǎn)染后收集上清，2 000 g離心30 min，離心后收集1 mL上清，加入500 μL Total Exosome Isolation reagent，4℃放置過夜，10 000 g 4℃離心1 h，棄上清，分別獲得空白轉(zhuǎn)染-外泌體（blank-exo，對照組）、iRGD-外泌體（iRGD-exo，實驗組），沉淀，-20℃保存。

1.2.4 藥物包裝

將0.2 μL外泌體+50 μg阿霉素用buffer混勻（200 μL體系），常溫下1 000 V、20 ms電穿孔后4℃保存[7]，分別獲得空白轉(zhuǎn)染-外泌體-阿霉素（blankexo-dox，對照組）與iRGD-外泌體-阿霉素（iRGD-exo-dox，實驗組）。

1.2.5 iRGD的RT-PCR檢測

取凍存外泌體抽提RNA，將其轉(zhuǎn)合成為cDNA，進行PCR反應，GAPDH設為管家基因。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性40 sec，40℃退火40 sec，72℃延伸1 min。將EP管放入儀器擴增，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。4℃儲存。用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，并檢測拍照。

GAPDH引物序列：上游5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’；iRGD引物序列：上游TCGATGTTAGACCTGGAAATAGTGGTGCTGTG，下游CCGGCACAGCACCACTATTTCCAGGTCTAACA。

1.2.63 T6細胞染色

用含10%胎牛血清的FBS培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩組3T6細胞，待細胞65%～70%融合時，以試劑Dio進行細胞染色。使用DMSO配置成1 mM濃度作為儲存液，PBS稀釋200倍至5 μM工作液，將稀釋好的Dio染料懸滴加入3T6細胞培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2孵育1 h。PBS溶液清洗染劑，在細胞培養(yǎng)皿中加入10 mL含10%胎牛血清的FBS培養(yǎng)液[8]。

1.2.7 外泌體結(jié)合

將獲取的blank-exo-dox、iRGD-exo-dox懸液分別懸滴加入Dio染色的3T6細胞培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2孵育1 h后，PBS清洗3次，去除多余的外泌體，分別得到A組（blank-exo-dox-3T6，實驗組）、B組（iRGD-exo-dox-3T6，對照組）細胞，分別進行流式細胞儀檢測和細胞增殖檢測[9]。

1.2.8 流式細胞儀檢測

胰酶消化后分別獲取A組和B組細胞懸液，1 000 g離心3 min后棄上清，獲取細胞沉淀，將兩組細胞沉淀分別加入0.9%NaCl，稀釋至1 mL，流式細胞儀檢測[11]。

1.2.9 細胞增殖檢測

取96孔板，分別用于檢測A、B組細胞，每孔加入100 μL的A或B細胞懸液（104個/孔）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的條件培養(yǎng)箱中分別孵育0、24、48、72、96 h，向待測孔加入10 μL CCK-8溶液。每組細胞、每個時間點取3個樣品檢測，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h[10]，酶標儀測定450 nm處的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 iRGD-外泌體的鑒定

我們通過RT-PCR對iRGD mRNA的表達水平進行評估。結(jié)果顯示，相較于blank-exo，iRGD-exo具有較高水平的iRGD mRNA表達[11]（圖1）。

2.2 iRGD-外泌體-阿霉素靶向于成纖維細胞研究

為了確認iRGD是否靶向于成纖維細胞上的αν整合素，我們將blank-exo-dox、iRGD-exo-dox懸液分別懸滴加入Dio染色的3T6細胞培養(yǎng)皿中。流式細胞儀證實，iRGD-exo-dox與成纖維細胞的結(jié)合效率高于blank-exo-dox（分別為45.6%、9.2%），這表明以多肽為標靶的iRGD顯著增強了外泌體靶向于成纖維細胞的能力[12]（圖2）。

圖1 RT-PCR檢測iRGD的mRNA表達Fig.1 The mRNA expression of iRGD detected by RT-PCR

圖2 流式細胞儀檢測結(jié)果Fig.2 Results of flow cytometry

2.3 iRGD-外泌體抑制成纖維細胞的效果

使用iRGD-exo-dox與blank-exo-dox對成纖維細胞進行24、48、72、96 h存活能力分析。CCK-8檢測顯示，iRGD-exo-dox抑制了細胞的增殖，但在blank-exo-dox中并沒有觀察到明顯的抑制現(xiàn)象，表明iRGD-exo-dox對成纖維細胞的增殖有明顯的抑制作用（圖3）。

圖3 3T6細胞增殖曲線Fig.3 The curve of cell proliferation in 3T6 cells

3 討論

目前針對瘢痕疙瘩的治療仍然缺乏很好的方法。現(xiàn)有的治療方法包括手術、化療藥物、類固醇藥物瘢痕內(nèi)局部注射，以及同位素和放射治療?；熕幬锇⒚顾伛：蹆?nèi)注射，用藥后敏感性較高，皮損消退快，但存在大劑量用藥后出現(xiàn)類似化療的不良反應。因此，我們參考Tian等[13]利用iRGD-外泌體包裹阿霉素靶向識別乳腺癌上的αν整合素的實驗思路，設計本實驗，將阿霉素包裹于iRGD-外泌體之中，并作用于高表達αν整合素的成纖維細胞，體外監(jiān)測其對成纖維細胞增殖的抑制作用[9]。

阿霉素在多種腫瘤疾病的治療中具有關鍵作用，但由于具有劑量毒性，所以在臨床應用中受到極大限制[9]。利用自然存在的納米級別的藥物載體，轉(zhuǎn)載藥物來治療腫瘤的方法，已表現(xiàn)出極大的應用前景[14]。我們使用轉(zhuǎn)染iRGD的外泌體包裹阿霉素作用于成纖維細胞，證實轉(zhuǎn)染后的外泌體具有標靶成纖維細胞的功效。實驗中，iRGD-外泌體對于帶有αν整合素的成纖維細胞具有很強的親和力，并能顯著抑制成纖維細胞的增殖。實驗表明，外泌體似乎是一種更好地將藥物傳遞到成纖維細胞的方法[15]。

與傳統(tǒng)化療方法相比，以外泌體為載體的靶向治療優(yōu)勢明顯。第一，外泌體可來源于患者自身細胞，相比人造的運載工具有較低的免疫原性。第二，外秘體具有磷脂雙分子層，可以直接與靶細胞膜融合，而且毒性較低[16]。第三，外泌體為自然的納米細胞，可以避免單核細胞吞噬，且易于穿透腫瘤毛細血管組織，使化療藥物易于在腫瘤內(nèi)擴散。這些潛在優(yōu)勢使其成為治療瘢痕疙瘩理想的藥物載體[17]。

4 結(jié)論

本實驗表明，iRGD-外泌體是一種天然的納米級藥物傳遞平臺，能針對性地遞送化療藥物到瘢痕疙瘩中，并能降低化療反應，提高藥物對成纖維細胞增殖的抑制作用，從而給瘢痕疙瘩的治療帶來了新的思路。

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The Inhibition of iRGD-Exosomes-Doxorubicin on the Proliferation of Fibroblasts in VitroHU Huan,ZHENG

Jianghong．Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233, China.Corresponding author:ZHENG Jianghong(E-mail:zjhsh68@sohu.com).

ObjectiveTo investigate the effect and targeting of iRGD-exosomes-doxorubicin(iRGD-exo-dox)on the inhibition of the proliferation of fibroblasts.MethodsThe exosomes were extracted from the iRGD-transfected fibroblasts. The doxorubicin was wrapped by electroporation.Flow cytometry was used to detect the affinity of iRGD-exo-dox to fibroblasts.The ability of iRGD-exo-dox on inhibiting the proliferation of fibroblasts was analyzed.ResultsThe affinity of iRGD-exo-dox to fibroblasts was higher than the blank-exo-dox.The proliferation of fibroblasts was obviously inhibited by iRGD-exo-dox.The inhibition effect was not observed in blank-exo-dox group.ConclusioniRGD-exo-dox can inhibit the proliferation of fibroblasts by targeting function,which can be used in the treatment of keloid.

Exosomes;Doxorubicin;Keloid;Fibroblasts

R619+.6

A

1673－0364（2017）02－0070－04

2016年12月19日；

2017年2月10日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.02.003

200233上海市上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院整形外科。

鄭江紅（E-mail：zjhsh68@sohu.com）。