鄭瑞璇，陶宜楠，石玉含，張環(huán)環(huán)，汪萌芽

(皖南醫(yī)學院 細胞電生理研究室，安徽 蕪湖 241002)

·基礎醫(yī)學·

大鼠海馬興奮性突觸傳遞的表觀受體動力學分析及其應用

鄭瑞璇，陶宜楠，石玉含，張環(huán)環(huán)，汪萌芽

(皖南醫(yī)學院 細胞電生理研究室，安徽 蕪湖 241002)

目的：觀察大鼠離體海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元興奮性突觸后電位(EPSP)的刺激強度依賴性及表觀受體動力學性質(zhì)。方法：應用成年大鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元細胞內(nèi)記錄技術，觀察不同強度電刺激Schaffer側(cè)支誘發(fā)的EPSP的變化，并分析其表觀受體動力學特性，以及在LTP中的變化。結(jié)果：①電刺激Schaffer側(cè)支誘發(fā)EPSP的幅度與刺激強度呈正相關(r=0.9251，P<0.01)，表觀解離速率常數(shù)K2和表觀平衡解離常數(shù)KT均隨刺激強度增強而降低，對應的相關系數(shù)r=-0.9725和-0.9483(P均<0.01)。②給予Schaffer側(cè)支的強直刺激在6個測試神經(jīng)元中的3個細胞誘發(fā)出LTP，對LTP過程中的EPSP表觀受體動力學分析顯示強直刺激后10 min時K2和KT值減小(P<0.01)。結(jié)論：大鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元EPSP的表觀受體動力學參數(shù)具有刺激強度依賴性，表觀受體動力學分析方法亦可用于海馬LTP的分析。

海馬；興奮性突觸后電位；長時程增強；受體動力學

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2017.02.001

海馬是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)邊緣組織的一部分，它具有多方面的生理功能，被認為是參與學習記憶和情感恐懼記憶等過程的核心腦區(qū)[1]，其突觸可塑性與學習記憶密切相關[2]，長時程增強(long-term potentiation，LTP) 是N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate，NMDA)受體依賴性突觸傳遞效能的持續(xù)性增強，是目前較為公認的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)信息儲存的機制[3]。1993年Bliss和Collingridge[4]首次發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元在受到強直刺激后，會產(chǎn)生LTP現(xiàn)象，在這之后的很多研究都發(fā)現(xiàn)LTP與學習和記憶能力之間存在相應的聯(lián)系。通常觀察LTP突觸效能變化的指標，主要是興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)的幅度和曲線下面積，也有潛伏期、時程及最大上升斜率等分析的報道[5-7]，而有關遞質(zhì)與受體作用的受體動力學研究卻很少，其中海馬腦片EPSP及其LTP的受體動力學分析尚未見報道。本實驗室前期的研究[7-8]已經(jīng)證明表觀受體動力學分析方法對突觸可塑性的研究中進行受體親和力等性質(zhì)的分析具有較好的參考價值。因此，本文應用大鼠海馬腦片CA1錐體神經(jīng)元細胞內(nèi)記錄技術，觀察刺激Schaffer側(cè)支誘發(fā)的EPSP的刺激強度依賴性和表觀受體動力學性質(zhì)，并對其在LTP受體動力學分析中的應用進行了初步的探討，為進一步分析海馬興奮性突觸傳遞及其LTP的受體動力學機制提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 海馬腦片的制備 取成年雄性Sprague Dawley大鼠(體質(zhì)量150～200 g)，購自南京青龍山動物繁殖場。按文獻報道方法[9]，吸入乙醚全身麻醉后斷頭，在頭部正中剪開皮膚，咬去顱骨，剪開軟腦膜并取出全腦，置于0～4℃、用95%O2+5%CO2混合氣體飽和的人工腦脊液(ACSF)中矢狀對切，將一側(cè)腦的海馬取出，放于與水平成45°角V形槽的瓊脂塊中，用膠水(Super Glue)固定在振蕩切片機(Vibratome，Technical Products International Inc，USA)的浴碟內(nèi)，隨后立即加入ACSF冰水混合物并持續(xù)通氧，用固定在振蕩切片機上的刀片(Gillete)橫向切取400～500 μm的切片若干，置于室溫(20～25℃)下的經(jīng)混合氣體飽和的ACSF中備用。整個切片過程限制在15 min。

1.2 細胞電生理記錄 海馬腦片在室溫下孵育0.5～1 h后，取一腦片置于全浸式記錄浴槽(容積0.5～1.0 mL)的底網(wǎng)上，上方使用蓋網(wǎng)固定。通過恒流泵以3 mL/min左右速率持續(xù)灌流混合氣體飽和的ACSF，并控制浴槽溫度保持在室溫25℃左右。用P-97程控拉制儀(Sutter Instrument Co，USA)，把玻管毛坯拉成實驗所需的微電極，電極內(nèi)充入少許3 mol/L乙酸鉀，電極尖端的阻抗以80～140 MΩ為宜，固定于微操縱儀上，將探頭(headstage)上的銀絲插入電極尾端，調(diào)整顯微操作裝置，對海馬腦片CA1錐體神經(jīng)元進行細胞穿刺。當電極尖端緩慢碰到細胞膜時，利用微電極放大器的遙控開關(Buzz)給予2 ms的瞬時振蕩，讓微電極的尖端刺入細胞內(nèi)。記錄到的電信號經(jīng)由Axoclamp 900A微電極放大器、DigiData 1440A聯(lián)機采樣接口、pClamp 10.2軟件(Axon Instrument/Molecular Devices，USA)用計算機進行采樣、記錄和貯存。三通道電子刺激器(NIHON KOHDEN，Japan)輸出的脈沖經(jīng)放大器由微電極向細胞內(nèi)注射，而Schaffer通路電刺激則經(jīng)SS-201J隔離器(NIHON KOHDEN，Japan)后由置于Schaffer側(cè)支通路所在處的同芯雙極電極進行局部刺激。

1.3 電刺激方法 在Schaffer側(cè)支施加測試刺激(單脈沖，波寬0.1 ms，10次/分鐘，10～100 V)，在CA1區(qū)錐體神經(jīng)元細胞內(nèi)記錄EPSP反應，記錄到穩(wěn)定15 min的EPSPs后，進行強直刺激(100 Hz，50脈沖/串，波寬0.4～1.0 ms，共6串，串間隔10 s，電壓強度等同于測試刺激)，之后繼續(xù)記錄測試刺激誘發(fā)的EPSPs至少30 min。

1.5 受體動力學分析方法 按報道方法[7-8,10]，EPSP上升相和下降相的直線化公式分別為In[Veq/(Veq-V)]=(K1·S+K2)·t和In(V/Veq)=-K2·t，直線回歸后可得斜率為K1S+K2和-K2，由此算出表觀結(jié)合速率常數(shù)K1、表觀解離速率常數(shù)K2，以及表觀平衡解離常數(shù)KT(表征平衡解離常數(shù)KD)：KT=K2/K1，即表觀半幅有效遞質(zhì)濃度(表征EC50)，KT值越小，親和力越強。

2 結(jié)果

2.1 海馬CA1神經(jīng)元EPSP的刺激強度依賴性 對在CA1區(qū)記錄到的神經(jīng)元，在Schaffer側(cè)支加以不同強度(單脈沖，波寬0.1 ms，10次/分鐘，10～100 V)的電刺激，圖1例示一個神經(jīng)元記錄到的EPSP呈刺激強度依賴性結(jié)果，由此分析記錄到的大鼠海馬腦片CA1錐體神經(jīng)元EPSP的各個參數(shù)與刺激強度的相關性，直線相關分析結(jié)果顯示，在1 T～1.5 T范圍內(nèi)，EPSP的幅度與刺激強度呈顯著正相關(r=0.9251，P<0.01，圖2A)。

T：閾強度；箭頭(Sch)：對Schaffer側(cè)支電刺激的刺激偽跡;該神經(jīng)元的靜息電位為-70 mV。

圖1 大鼠海馬腦片CA1錐體神經(jīng)元EPSP的刺激強度依賴性

2.2 海馬CA1神經(jīng)元EPSP的表觀受體動力學性質(zhì) 以閾強度T為單位，對12個具有刺激強度依賴性的海馬腦片CA1錐體神經(jīng)元EPSPs的各項表觀受體動力學參數(shù)進行分析，可見在1 T～1.5 T范圍內(nèi)，表觀受體動力學參數(shù)K1值與刺激強度不存在明顯的相關性；K2值和KT值均隨刺激強度增大而逐漸減小，呈負相關，相應r=-0.9725和-0.9483(P均<0.01，圖2B～D)。

2.3 海馬CA1神經(jīng)元EPSP的LTP現(xiàn)象 通過在Schaffer側(cè)支施加測試刺激，記錄到至少穩(wěn)定15 min的EPSPs后，施加強直刺激。在測試的6個神經(jīng)元中，有3個細胞在強直刺激前后神經(jīng)元的基本電生理參數(shù)保持穩(wěn)定，且強直刺激后EPSP幅度或曲線下面積增大到基礎值的120%以上并持續(xù)30 min以上，可鑒定為LTP現(xiàn)象。在這3個細胞進行強直刺激前5 min和后10 min處各取兩個點進行曲線下面積的配對t檢驗，結(jié)果顯示，P<0.01，說明強直刺激后EPSP的曲線下面積顯著增大(表1)。

表1 強直刺激前后大鼠海馬腦片CA1錐體神經(jīng)元EPSP參數(shù)的變化

2.4 LTP過程中的EPSP表觀受體動力學分析 如上所述，在產(chǎn)生LTP現(xiàn)象的3個細胞進行強直刺激前5 min和后10 min處各取兩個點，對其LTP過程中的EPSP表觀受體動力學參數(shù)進行配對t檢驗分析，結(jié)果表明，EPSP的K1值變化不大(P>0.05)，而K2和KT值在強直刺激后均顯著減小(P<0.01，表1)。

3 討論

本實驗觀察到，大鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元EPSP在1 T～1.5 T范圍內(nèi)的表觀受體動力學參數(shù)呈刺激強度依賴性，即表觀解離速率常數(shù)K2和表觀平衡解離常數(shù)KT均與刺激強度呈負相關。因KT提示了受體親和力的變化，故海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元EPSP的表觀受體動力學分析，可能在觀察LTP的受體動力學機制中具有參考價值。

已有報道顯示，在人的海馬中，谷氨酸是一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過激活谷氨酸受體參與多種功能的調(diào)節(jié)。谷氨酸受體分為離子型和代謝型兩類，離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptors,iGluRs)又包括NMDA受體與非NMDA受體(AMPA受體、KA受體)，而NMDA受體在學習記憶、突觸可塑性、神經(jīng)發(fā)育等方面都具有重要的作用[11]。功能性NMDA受體通道的激活，對Ca2+、K+、Na+通透性增強，可產(chǎn)生興奮性突觸后電位。就本實驗而言，EPSP的幅度等參數(shù)與刺激強度呈正相關，說明具有刺激強度依賴性。而刺激強度依賴性的表觀受體動力學分析結(jié)果顯示，K2值與刺激強度呈負相關，提示隨著刺激強度增大且EPSP增大的過程中，遞質(zhì)與突觸后相應受體的解離速率減慢；KT值也隨刺激強度增大而降低，提示在刺激強度增大時，遞質(zhì)與突觸后受體作用的親和力升高，突觸后可能不斷有受體被激活，特別是高親和力的NMDA受體的激活，但不排除還存在其他更復雜的受體參與介導的可能性。

給予強直刺激后，在測試的6個神經(jīng)元中，有3個細胞EPSP幅度或曲線下面積增大到基礎值的120%以上，且維持超過30 min，根據(jù)LTP的判斷標準[12-13]，可以被判定誘發(fā)了LTP。在海馬發(fā)育早期，NMDA受體參與了LTP的建立[14]。給予一定強度和頻率的電刺激后，谷氨酸能突觸的后膜去極化，Ca2+濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，磷酸化的CaMKⅡ和NMDA受體的NR2B亞單位親和力增高，通過某種機制移除阻礙Ca2+內(nèi)流的Mg2+，從而使NMDA受體通道復合體的通道開放，Ca2+內(nèi)流，并觸發(fā)神經(jīng)元內(nèi)一系列的生化反應，進而改變突觸后膜的性質(zhì)，誘發(fā)LTP[14-16]。本實驗的表觀受體動力學分析表明，強直刺激后10 min EPSP的K1值未明顯變化，而K2值和KT值則明顯減小(P<0.01)，這與我們實驗室前期關于脊髓運動神經(jīng)元LTP的表觀受體動力學分析結(jié)果相類似，提示遞質(zhì)與突觸后受體的親和力增大，可能與大量高親和力的NMDA受體被激活有關[7]，說明EPSP的表觀受體動力學分析方法可能也適用于海馬CA1錐體神經(jīng)元的LTP分析，而海馬CA1錐體神經(jīng)元EPSP的LTP受體動力學特性還需要進一步的研究和探討。

綜上所述，通過對離體大鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元EPSP的刺激強度依賴性和表觀受體動力學性質(zhì)的分析，表明EPSP的表觀受體動力學參數(shù)具有刺激強度依賴性特征，而其LTP過程也涉及K2值和KT值的減小過程，可能也為海馬CA1神經(jīng)元突觸可塑性分析提供了一個新的有參考價值的方法。

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Analysis of the apparent receptor kinetics in excitatory synaptic transmission in rathippocampus

ZHENG Ruixuan,TAO Yi′nan,SHI Yuhan,ZHANG Huanhuan,WANG Mengya

Cell Electrophysiology Laboratory,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To observe the stimulus intensity-dependent and the apparent receptor kinetics properties of excitatory postsynaptic potential (EPSP) in hippocampal CA1 pyramidal neurons in the slice preparation of adult rats byinvitrotechnique.Methods:Hippocampal CA1 neurons were prepared from the slices of adult rats,and intracellular recording technique was used to observe the changes of EPSPs evoked by Schaffer collateral electrical stimulation at different intensities,and the receptor kinetics properties of EPSPs and the changes of receptor kinetics in long-term potentiation(LTP) were analyzed with apparent receptor kinetics technique.Results:①The amplitude of EPSPs evoked by Schaffer collateral stimulation was increased with higher stimulus intensity (r=0.9251,P< 0.01),while the correlation coefficient (r) between apparent dissociation rate constant (K2) or apparent equilibrium dissociation constant (KT) of EPSPs and stimulus intensity was decreased,with corresponding correlation coefficient of -0.9725 or -0.9483(P<0.01);②The LTP was evoked by tetanic stimulation of Schaffer collaterals in 3 of the 6 tested neurons,and the apparent receptor kinetics of EPSPs during LTP showed decreasedK2andKTat 10 min following tetanic stimulation(P<0.01).Conclusion:The apparent receptor kinetics parametersK2andKTof EPSPs in hippocampal CA1 pyramidal neurons are stimulus intensity-dependent,and the apparent receptor kinetics analysis may be used for measurement of LTP in hippocampus either.

hippocampus;excitatory postsynaptic potential;long-term potentiation;receptor kinetics

1002-0217(2017)02-0103-04

國家自然科學基金項目(31271155)；皖南醫(yī)學院大學生科研資助項目(WK2015S20)

2016-10-18

鄭瑞璇(1992-)，女，2014級碩士研究生，(電話)13024042877，(電子信箱)13024042877@163.com； 汪萌芽，男，教授，博士，碩士生導師，(電子信箱)wangmy@wnmc.edu.cn，通信作者。

R 338

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