董 麗，于慧霞，陳彩玉，王立新，王化彬，景懷琦，王 鑫

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在達(dá)烏爾黃鼠鼠疫疫源地分布及特征研究

董 麗1，于慧霞1，陳彩玉1，王立新1，王化彬1，景懷琦2，王 鑫2

目的 了解小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在達(dá)烏爾黃鼠鼠疫疫源地動(dòng)物中的種間帶菌分布情況及其特征，為我國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的研究提供科學(xué)的參考數(shù)據(jù)。方法 在達(dá)烏爾黃鼠鼠疫疫源地內(nèi)選擇牧區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)和農(nóng)區(qū)3個(gè)不同生態(tài)環(huán)境，分別采集鼠類、家畜家禽動(dòng)物的糞便、舌根、咽拭子及腸道內(nèi)容物等樣本，進(jìn)行小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分離、鑒定和毒力基因檢測(cè)。結(jié)果 共檢測(cè)各類樣本3 260份，檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌65株，總檢出率為1.99%；豬的帶菌率最高，其攜帶O∶3/3、O∶5/1A、O∶4/4 3個(gè)血清生物型；其中O∶3/3型致病性菌株攜帶ail、ystA、yadA、VirF、rfbc毒力基因；且在牧區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)、農(nóng)區(qū)的樣本均可檢出陽(yáng)性菌，以農(nóng)區(qū)最高, 檢出率為9.95%。結(jié)論 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在內(nèi)蒙古達(dá)烏爾黃鼠鼠疫疫源地中分布較廣，以農(nóng)區(qū)為重；豬是致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的主要攜帶者。

達(dá)烏爾黃鼠鼠疫疫源地；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；病原特征；分布

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)屬于腸桿菌科，耶爾森菌屬(Yersinia)。該菌中某些菌株對(duì)人和動(dòng)物有很強(qiáng)的致病性,是當(dāng)前國(guó)際社會(huì)廣泛關(guān)注的食源性致病菌之一[1]。人感染后能引起嚴(yán)重的腸道疾患，甚至累及肝、肺、關(guān)節(jié)等器官，嚴(yán)重者可引起敗血癥導(dǎo)致死亡，有個(gè)別患者的臨床表現(xiàn)(如關(guān)節(jié)疾病)極容易與布魯氏菌桿菌病混淆。同時(shí)該菌屬的致病性菌包括鼠疫耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,它們攜帶的毒力質(zhì)粒PYV具有同源性,耶爾森菌僅限于初次感染，即動(dòng)物被3種耶爾森菌屬中的任何一種感染，就會(huì)對(duì)另外兩種產(chǎn)生一定的免疫力,表明這3種近緣菌存在交叉免疫。

內(nèi)蒙古赤峰市是達(dá)烏爾黃鼠鼠疫歷史疫區(qū),也是布魯氏菌病自然疫源地，因小腸結(jié)腸炎與鼠疫桿菌有較近的親緣關(guān)系，且可與布魯氏菌產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)。目前，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在該地區(qū)的分布情況及病原特征未見(jiàn)報(bào)道。為了填補(bǔ)這項(xiàng)空白該研究旨在闡明小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在該地區(qū)的分布和病原特征，為該病的預(yù)防控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查區(qū)概況 內(nèi)蒙古達(dá)烏爾黃鼠鼠疫疫源地內(nèi)的赤峰市位于東經(jīng)116°21′-120°58′，北緯41°17′-45°24′之間，總面積90 275 km2，人口460萬(wàn)，是多民族集聚的地區(qū)。按動(dòng)物地理區(qū)劃屬古北界、蒙新區(qū)、東部草原亞區(qū)；自然氣候?qū)僦袦貛О敫珊荡箨懶约撅L(fēng)氣候區(qū)，大部分地區(qū)年平均氣溫為0～7 ℃，年降雨量在300～500 mm。為玄武巖丘陵半干旱草原地帶,草原內(nèi)植物主要以大針茅、羊草為代表的禾本科的多種植物。該地區(qū)鼠疫的主要貯存宿主為達(dá)烏爾黃鼠,故稱達(dá)烏爾黃鼠鼠疫疫源地,是我國(guó)歷史悠久的鼠疫監(jiān)測(cè)點(diǎn),目前本市轄12個(gè)旗(縣區(qū))，有11個(gè)旗(縣區(qū))已達(dá)到了國(guó)家穩(wěn)定控制鼠疫的標(biāo)準(zhǔn)水平，僅阿魯科爾沁旗近十余年動(dòng)物間鼠疫疫情仍然活躍。

1.2 調(diào)查點(diǎn)選擇 赤峰市北部多為牧區(qū)，中部為半農(nóng)半牧區(qū)，南部多為農(nóng)區(qū)。根據(jù)本市地理位置的條件,為使本次調(diào)查具有代表性和科學(xué)性，本次在牧區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)和農(nóng)區(qū)各抽樣選擇一個(gè)調(diào)查點(diǎn)，進(jìn)行動(dòng)物樣本的采集。

1.3 樣本采集 在各調(diào)查點(diǎn)隨機(jī)采集鼠類和家禽家畜等標(biāo)本。對(duì)鼠疫疫區(qū)內(nèi)獲得的鼠類樣本首先進(jìn)行鼠疫桿菌檢驗(yàn),排除鼠疫桿菌的可能。采集動(dòng)物的樣本主要包括新鮮糞便、舌根、腸道內(nèi)容物和咽拭子，采集的樣本裝在盛有改良磷酸鹽緩沖液的離心管(按1∶10混合)中，并置于4 ℃條件下冷增菌20 d。從2009-2013年共采集各類宿主動(dòng)物樣本3 260份,其中達(dá)烏爾黃鼠1 515份，小家鼠193份，黑線倉(cāng)鼠、長(zhǎng)爪沙土鼠、三趾、五趾跳鼠等42份；豬糞771份，豬咽拭子217份，牛、驢、馬、羊、雞、鵝等家畜家禽522份。

1.4 試劑來(lái)源 耶爾森菌麥康凱選擇性培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司，API-20E試條購(gòu)自法國(guó)梅里埃生物公司，分型血清O∶3、O∶8、O∶9單克隆抗體由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供，O∶4、O∶5血清型分型血清購(gòu)自日本生研株式會(huì)社，生物分型試劑購(gòu)自丹麥ROSCO公司。耶爾森增菌液PBS、改良克氏雙糖瓊脂、半固體瓊脂均購(gòu)自北京陸橋生物科技有限公司。尿素培基購(gòu)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社。聚合酶鏈反應(yīng)PCR所有試劑均購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.5 菌株分離培養(yǎng)和鑒定 常規(guī)操作參考小腸結(jié)腸炎耶爾森菌書(shū)中的介紹[2]。在生物安全柜中接種增菌樣品于耶爾森選擇性培基平板，25 ℃培養(yǎng)48 h；選擇形態(tài)可疑菌落接種于改良克氏雙糖瓊脂培養(yǎng)基中，在25 ℃條件下培養(yǎng)24 h；改良克氏雙糖斜面；黃/黃、不產(chǎn)H2S的菌落接種于尿素培基，在25 ℃條件下培養(yǎng)3 h，將分解尿素的菌株分別接種于兩管半固體培養(yǎng)基，分別在25 ℃和37 ℃條件下培養(yǎng)24 h；取25 ℃培養(yǎng)有動(dòng)力且37 ℃培養(yǎng)無(wú)動(dòng)力的疑似菌株，進(jìn)行革蘭氏染色；對(duì)革蘭氏染色為陰性的桿菌或球桿菌進(jìn)行AP1-20E系統(tǒng)生化鑒定，最后確定為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌株。血清分型采用玻片法，生物型鑒定采用小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物分型指標(biāo)[2]。

1.6 毒力基因檢測(cè) 常規(guī)PCR操作方法，并參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)引物，引物由生物工程(上海)股份有限公司合成,所用引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系中，模板1 μL，Premix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL(20 μmol)，純水定容至20 μL，PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：94 ℃， 5 min，94 ℃,15 s，54 ℃,30 s，72 ℃,30 s，25個(gè)循環(huán),最后72 ℃ 10 min。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

Tab.1 Primers used in PCR amplification

引物引物序列(5'-3')產(chǎn)物大小/bpailForwardTAATGTGTACGCTGCGAG351ReverseGACGTCTTACTTGCACTGystAForwardATCGACACCAATAACCGCTGAG79ReverseCCAATCACTACTGACTTCGGCTystBForwardGTACATTAGGCCAAGAGACG146ReverseGCAACATACCTCACAACACCyadAForwardCTTCAGATACTGGTGTCGCTGT849ReverseATGCCTGACTAGAGCGATATCCvirFForwardGGCAGAACAGCAGTCAGACATA561ReverseGGTGAGCATAGAGAATACGTCGrfbcForwardCGCATCTGGGACACTAATTCG405ReverseCCACGAATTCCATCAAAACCA

2 結(jié) 果

2.1 菌株分離鑒定結(jié)果 從3 260份樣本中分離培養(yǎng)共檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌65株，陽(yáng)性檢出率為1.99%。血清學(xué)、生物化學(xué)分析，所獲65株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，包含了O∶3,O∶5,O∶4 3個(gè)血清型和3、4、1A三個(gè)生物型。其中O∶3/3血清生物型菌株占64.62%(42/65)，O∶5/1A血清生物型菌株占33.84%(22/65)，O∶4/4血清生物型菌株占1.54%(1/65)。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

2.2 菌株分布情況 3種不同的生境均可檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，其中牧區(qū)17株，檢出率為0.69%，半農(nóng)半收區(qū)檢出7株，檢出率為1.84%；農(nóng)區(qū)檢出41株，檢出率為9.95%。呈現(xiàn)牧區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)、農(nóng)區(qū)的檢菌率依次升高的趨勢(shì)，且不同生境的檢菌率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=155.05P<0.005)。豬的帶菌率最高，為6.28%(62/988)。在牧區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)、農(nóng)區(qū)3個(gè)不同環(huán)境的菌株O∶3/3血清生物型分別占各檢出菌株的5.88%(1/17)、28.57%(2/7)和95.12%(39/41)。

2.3 毒力基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)65株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，在65株菌中共檢測(cè)了6種毒力基因，其中22株中檢出了ystB基因,42株菌種檢出了ail、ystA、yadA、virF、rfbc基因，1株菌檢出ail、ystA、rfbc基因。詳見(jiàn)表3。

表2 達(dá)烏爾黃鼠鼠疫疫源地小腸結(jié)腸炎耶爾森菌宿主動(dòng)物檢菌情況

Tab.2 Detection ofY.enterocoliticain animal hosts inCitellucsdauricusplague focuses

時(shí)間牧區(qū)半農(nóng)半牧區(qū)農(nóng)區(qū)檢測(cè)數(shù)(份)陽(yáng)性數(shù)(份)陽(yáng)性率%檢測(cè)數(shù)(份)陽(yáng)性數(shù)(份)陽(yáng)性率%檢測(cè)數(shù)(份)陽(yáng)性數(shù)(份)陽(yáng)性率%20094651(豬糞)0.14201097600.00201174416(鼠3、豬13)1.392297(豬)3.0625641(豬)16.02201218200.0015200.0015600.00201310000.00+-合計(jì)2467170.6938171.84412419.95

總檢出率：1.99%(65/3 260,3 260=2 467+381+412) χ2=155.05>10.60，P<0.005

表3 黃鼠鼠疫疫源地動(dòng)物中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分型及毒力測(cè)定結(jié)果

Tab.3 Classification ofY.entorocaliticaand detection of toxicity genes inCitellusdauricusplague focuses

樣品采集時(shí)間地點(diǎn)宿主菌株數(shù)血清型生物型毒力基因ailystAystByadAvirFrfbc2009.07牧區(qū)豬糞1O∶51A--+---2011.04牧區(qū)豬糞5O∶51A--+---2011.05牧區(qū)黃鼠腸1O∶51A--+---2011.05牧區(qū)豬糞7O∶51A--+---2011.05牧區(qū)豬糞1O∶33++---+2011.07牧區(qū)家鼠腸2O∶51A--+---2011.09半農(nóng)半牧區(qū)豬糞3O∶51A--+---2011.09半農(nóng)半牧區(qū)豬糞1O∶33++-+++2011.10半農(nóng)半牧區(qū)豬咽拭1O∶33++-+++2011.10半農(nóng)半牧區(qū)豬咽拭2O∶51A--+---2011.10農(nóng)區(qū)豬咽拭1O∶51A--+---2011.10農(nóng)區(qū)豬咽拭39O∶33++-+++2011.10農(nóng)區(qū)豬咽拭1O∶44++-+++合計(jì)65

※致病性菌株占42/65×100%=64.6%

3 討 論

通過(guò)對(duì)該地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分布及病原特征檢測(cè)結(jié)果分析，共在3種不同生境采集的3 260份樣本中獲得小腸結(jié)腸炎耶爾森菌65株，總檢出率為1.99%。證實(shí)了內(nèi)蒙古達(dá)烏爾黃鼠鼠疫疫源地內(nèi)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的存在，但檢出率較低。65株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌62株分離自豬糞樣本，表明豬是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的主要貯存宿主，這一結(jié)果與先前報(bào)道一致[4]。65株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均分離自2011年，該結(jié)果可能是由采樣質(zhì)量偏差或其他原因，導(dǎo)致究其原因有待進(jìn)一步調(diào)查證實(shí)。本次調(diào)查結(jié)果顯示小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在農(nóng)區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)、牧區(qū)均有分布。在農(nóng)區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)、牧區(qū)的檢出率依次為9.95%，1.84%、0.69%，以農(nóng)區(qū)最高。因?yàn)樨i是該地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的主要宿主，其結(jié)果一方面可能與3種不同環(huán)境牲豬飼養(yǎng)數(shù)量的多少以及飼養(yǎng)方式有關(guān)，另一方面可能與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的地域性分布有一定關(guān)系[5]。

本次對(duì)65株菌的病原特征分析顯示，該疫源地內(nèi)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌共有O∶3/3、O∶5/1A、O∶4/4三個(gè)血清生物型。O∶3/3血清生物型菌株，是我國(guó)已確定的對(duì)人有很強(qiáng)致病性菌株，它攜帶了ail，ystA，yadA，virF，rfbc等毒力基因[6-9]；由該菌株引發(fā)的人間疾病暴發(fā)，國(guó)內(nèi)外不乏相關(guān)報(bào)道[7，10]。調(diào)查結(jié)果提示當(dāng)?shù)厝巳簯?yīng)當(dāng)對(duì)該病引起重視，謹(jǐn)防致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染，造成暴發(fā)流行。本次調(diào)查在農(nóng)區(qū)的豬體中還發(fā)現(xiàn)了O∶4/4血清生物型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，經(jīng)鑒定它攜帶了ail，ystA，yadA，virF，rfbc毒力基因，與其相關(guān)的分布情況及致病性等問(wèn)題有待進(jìn)一步調(diào)查研究。

由于布魯氏菌桿菌病與致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌存在交叉免疫，所以在布魯氏菌桿菌病的診斷檢驗(yàn)中應(yīng)采用多種檢驗(yàn)方法，提高檢驗(yàn)準(zhǔn)確性，避免誤診。本次調(diào)查未發(fā)現(xiàn)O∶9血清型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，但赤峰市與遼寧省相毗鄰，而同屬于達(dá)烏爾黃鼠鼠疫疫源地的遼寧省某地區(qū)曾因O∶9血清型致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染引起該病流行，應(yīng)強(qiáng)化監(jiān)測(cè)。

本試驗(yàn)共檢測(cè)了1 500余只達(dá)烏爾黃鼠的舌根和腸內(nèi)容物，僅在靠近村莊的黃鼠體中檢到一株O∶5/1A血清生物型非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，可能除黃鼠自身帶菌外,不排除該菌株可能來(lái)自豬的交叉感染。在疫源地內(nèi)鼠疫主要貯存宿主體內(nèi)未檢出致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，應(yīng)進(jìn)一步加大達(dá)烏爾黃鼠感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的監(jiān)測(cè)力度，同時(shí)開(kāi)展血清學(xué)調(diào)查，從而佐證致病性耶爾森菌僅限于初次感染的觀點(diǎn)，為該地區(qū)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌引起的疾病防控提供依據(jù)。

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Pathogenic characteristic and distribution ofYersiniaenterocoliticainCitellusdauricusplague focuses,Inner Mongolia

DONG Li1,YU Hui-xia1，CHEN Cai-yu1，WANG Li-xin1，WANG Hua-bin1,JING Huai-qi2,WANG Xin2

(ChifengCenterforDiseaseControlandPrevention,Chifeng024000，China)

In order to investigate the distribution ofYersiniaenterocoliticainCitellusdauricusplague focuses in Inner Mongolia,three different ecological environ/ments were chosen as the sampling area.Feces，tongue roots throat swabs，and intestinal contents of rodent，livestock，and poultry were separately collected，and differentY.enterocoliticastrains were isolated,and identified.PCR analysis was conducted to detect the toxicity genes ofY.enterocolitica.Statiscal analysis was performed by chi-square test.Of the 3 260 samples,65Y.enterocoliticastrains were isolated and the overall detection rate was 1.99%.To include O∶3/3,O∶5/1A,O∶4/4 serum biological type,the pathogenic strain of serotype O∶3 and biological typt 3 carryinq toxicity genes ail，ystA,VirF yadA and rfbc was isolated from pigs inCitellusdauricusplague focuses， Inner Mongolia are the major carrier of pathogenicY.enterocoliticadistributed in three different ecological environment,and distributed mainly in agricultural area.

Citellusdauricusplague focuses;Yersiniaenterocolitica;pathogenic character istics;distribution Supported by the National Science and Technology Major Project (No.2009-2012ZX10004-201) Corresponding author:Wang Hua-bin，Email：wanghuabin00@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.012

王化彬，Email：wanghuabin00@163.com

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市疾病預(yù)防控制中心，赤峰 024000； 2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206

R379

A

1002-2694(2017)03-0256-04

2016-04-21 編輯：梁小潔

國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題(No.2009-2012ZX10004-201)