楊 銳，文繼鋒，龔永平，王承東，鄧林華，黃 杰，任 露，顏其貴

小熊貓感染肺炎克雷伯氏菌的檢查及藥敏試驗

楊 銳1，文繼鋒1，龔永平1，王承東2，鄧林華2，黃 杰1，任 露1，顏其貴1

目的 為確診導致一只6歲左右的雌性小熊貓死亡的病因。方法 無菌采集死亡小熊貓的心、肝、脾、肺等樣品并進行病原學檢查。通過對多個內(nèi)臟樣本進行細菌平行分離鑒定(形態(tài)特征、生化特性和16S rDNA分析)，對分離得到的一株優(yōu)勢菌(R1)進行小鼠人工感染及藥敏試驗。結果 R1被鑒定為肺炎克雷伯氏菌，且未檢測到別的細菌；R1對小鼠具有較強致病力，LD50為6.5×104CFU/mL，且死亡小鼠與該小熊貓具有一致臨床表現(xiàn)和病理剖解癥狀；R1對頭孢噻肟等藥物敏感，對丁胺卡那等藥物敏感性為中介，對青霉素等耐藥。結論 該小熊貓死于肺炎克雷伯氏菌感染。該菌對青霉素類抗生素耐藥較強，且耐藥譜較廣，對大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類抗生素均有耐受作用，對頭孢菌素類和氨基糖苷類抗生素敏感。

小熊貓；肺炎克雷伯氏菌；16S rDNA；LD50；藥敏試驗

小熊貓(Ailurusfulgens)又名紅熊貓、小貓熊，為國家Ⅱ級重點保護動物[1]。小熊貓的食性較雜，除了竹簡以外，也吃其他幾種野果、野菜、根莖、青草[2]；小熊貓在分類、生態(tài)學等領域具有十分重要的研究價值，也是動物園里具有很高觀賞價值的一種野生動物[3]。某動物養(yǎng)殖基地中一只6歲左右的雌性小熊貓與另外3只小熊貓共養(yǎng)。剛開始發(fā)病時，發(fā)現(xiàn)該小熊貓出現(xiàn)精神沉郁、腹圍增大，并且靠近尾根處有類似咬傷的傷口等癥狀。該小熊貓死亡后，剖解發(fā)現(xiàn)有化膿灶、胸腔積液、心包積液、肝臟有壞死灶等病變。為確診該小熊貓死亡的原因，對采集的樣本進行微生物學檢查。

1 材料與方法

1.1 病料 對該死亡小熊貓進行剖解，無菌采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、心包液、腹水及創(chuàng)傷部位樣品。

1.2 培養(yǎng)基與試劑 MH營養(yǎng)瓊脂、兔鮮血、瓊脂粉；病毒DNA提取試劑盒、病毒RNA提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；生化及藥敏試驗的材料參照文獻[4]使用。

1.3 實驗動物 健康昆明小白鼠購自簡陽達碩動物科技有限公司，共60只，規(guī)格為19-21 g/只。

1.4 主要病毒病的診斷 分別利用病毒DNA提取試劑盒、病毒RNA提取試劑盒對無菌采集的小熊貓肝臟進行DNA和RNA的提取，按照郭玲等的檢測方法[5-6]進行犬細小病毒(CPV)和犬瘟熱病毒(CDV)的檢測。

1.5 細菌分離鑒定 將無菌采取的心臟、肝臟、脾臟、肺臟等組織分別接種于MH固體培養(yǎng)基和含5%的兔鮮血固體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察細菌的生長情況，并挑取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌的菌體形態(tài)及染色特征；分離純化后，將純化的細菌接種于MH液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到擴大培養(yǎng)的菌液。對分離純化的細菌參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]進行系統(tǒng)的理化特性測定。引物設計參照文獻進行[8]，由上海英駿生物技術有限公司合成。按照文獻中[9]方法對分離純化細菌進行16S rDNA序列測定分析。

1.6 人工感染小鼠試驗 鑒定多個組織共有的菌株命名為R1。將R1菌株培養(yǎng)物用0.9% 生理鹽水稀釋制成菌懸液備用，在預實驗的基礎上，采用微量點樣法[10]對菌落計數(shù)并調(diào)整菌懸液濃度至8.2×108、8.2×107、8.2×106、8.2×105、8.2×104CFU/mL，以0.2 mL/只劑量腹腔注射小鼠，對照組小鼠以0.2 mL/只劑量腹腔注射無菌0.9% 生理鹽水，每組5只。在接種后每隔6 h觀察1次，連續(xù)觀察兩周。記錄小鼠的臨床表現(xiàn)，對死亡小鼠進行剖解，觀察并記錄各組織器官病變；從死亡小鼠肺臟再次分離細菌，并進行鑒定。

1.7 藥敏試驗 選用22種抗生素藥敏紙片，參照文獻[11]操作及標準對R1進行藥敏試驗并判定結果。

2 結 果

2.1 病毒診斷 抽提血液組織的總RNA 和DNA，采用CPV與CDV的特異性引物經(jīng)RT-PCR和PCR擴增反應后，將其擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果未出現(xiàn)各自預期的特異性條帶，判定該小熊貓未感染CPV和CDV。

2.2 細菌分離鏡檢 心臟、肝臟、脾臟、肺臟、心包液及創(chuàng)傷部位樣品經(jīng)劃線平板培養(yǎng)基并培養(yǎng)后中均有大量細菌生長，每個平板上具有相似的菌落出現(xiàn)且為優(yōu)勢菌落，將優(yōu)勢菌株命名為R1。對R1優(yōu)勢菌落進行分離純化后鏡檢，菌體形態(tài)一致。該菌在MH固體培養(yǎng)基上生長為圓形、微凸、表面光滑、邊緣整齊、白色菌落，直徑2～3 mm；在含兔血清的MH固體培養(yǎng)基上不產(chǎn)生溶血環(huán)，菌落呈白色，圓形、微凸，邊緣光滑，直徑2～4 mm。革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性粗短桿菌，無鞭毛和芽孢，呈單個或成對存在。

2.3 生化試驗 將各個組織中分離出來的共同菌R1株進行生化鑒定，該菌株理化特性見表1。

表1 分離優(yōu)勢菌株R1的生理生化特性

Tab.1 Biochemical and physiological characteristics of the R1 isolate

試劑Regents結果判定Results試劑Regents結果判定ResultsOxidasetest-VPtest+EsculinHydrate+OrnithineDecar-boxylase-Sucrose+LysineDecarbox-ylase+CottonseedSugar+ArginineDecar-boxylase-H2SProduction-Glucose+Lactose+Gelatintest-Sorbierite+Malonate-Urea+Citrate+Mannitol+Arabinose+

注：“+”陽性；“-”陰性

Note：“+”Positive；“-”Negative

通過查閱《伯杰氏細菌鑒定手冊》可以看出，所分離的共同細菌與肺炎克雷伯氏菌的生化特性相符合，判定為肺炎克雷伯氏菌，命名為R1株。

2.4 分子生物學鑒定 將提取的R1菌株DNA進行16S rDNA-PCR擴增、測序、BLAST分析，結果表明：R1菌株16S rDNA基因序列與肺炎克雷伯氏菌(GenBank登陸號：CP016811.1) 的同源性達100%。

2.5 人工感染小鼠試驗 R1菌株對小鼠的致病性結果見表2。接種細菌后小鼠出現(xiàn)精神萎靡，呼吸困難，眼角粘性分泌物多等臨床癥狀。剖解后發(fā)現(xiàn)腹腔有膠凍樣積液，腸道嚴重臌氣，肺有實變和充血，肝邊緣壞死等病理變化，與死亡小熊貓表現(xiàn)一致，對照小鼠表現(xiàn)正常，并且從死亡小鼠肺臟中分離到的菌株經(jīng)過鑒定與R1菌株一致。試驗顯示該分離株對小鼠具有較強致病力，依改良寇氏法計算其半致死劑量LD50，即logLD50=Xk-i(∑p-0.5)，其中Xk為最大劑量的對數(shù)，∑p為死亡率的總計，i為劑量對數(shù)的間距[4]。計算出其LD50為6.5×104CFU/mL。

表2 R1菌株對小鼠的致病力

Tab.2 Pathogenicity of R1 isolate to mice

細菌濃度Concentration(CFU/mL)8.2×1088.2×1078.2×1068.2×1058.2×104ControlLD50死亡率DeathNo./TestNo.5/55/55/54/54/50/56.5×104CFU/mL

2.6 藥敏試驗 藥敏實驗結果見表3。結果表明，R1菌對頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢拉定、磺胺異噁唑、復方新諾明、諾氟沙星、多黏菌素B、環(huán)丙沙星等敏感；對丁胺卡那、卡那霉素、頭孢氨芐、新霉素的敏感性為中介；對青霉素、紅霉素、氨芐西林、利福平等不敏感。這表明，R1菌株對頭孢菌素類、喹諾酮類、四環(huán)素類等抗生素敏感；對氨基糖苷類等抗生素的敏感性為中介；對β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類等抗生素耐藥，即R1菌株對三類以上抗生素耐藥。

3 討 論

基于R1菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性和16S rDNA序列分析，依據(jù)參考文獻[12-14]，確定該分離病原菌為肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)。參照相關文獻[15]，選擇其敏感實驗動物小鼠進行人工感染試驗，確定出肺炎克雷伯氏菌感染為此次小熊貓死亡的原因。通過人工感染小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，分離鑒定出的肺炎克雷伯氏菌對小鼠有較強致病力，經(jīng)計算得出其LD50為6.5×104CFU/mL。肺炎克雷伯氏菌在人類和其他哺乳動物體內(nèi)腐生，定植胃腸道，皮膚和鼻咽；也在土壤、水等各種環(huán)境中有發(fā)現(xiàn)[16]。肺炎克雷伯氏菌為條件致病菌，當機體抵抗力降低時容易引起發(fā)病甚至死亡，可引起急性人畜共患傳染病。該病常發(fā)生于豬、牛、羊、雞、鴨等多種家畜、家禽及野生動物，已有很多相關報道肺炎克雷伯氏菌對大熊貓、白頰長臂猿、扭角羚等野生動物的感染并致死[17-19]。對于一些珍稀的野生動物，更應加強防范感染該菌，以至于能夠減少甚至避免人與野生動物對肺炎克雷伯氏菌的感染。

表3 R1菌株的藥敏試驗

Tab.3 Antibiotic sensitivity test of the R1 strain

藥物名稱Drug劑量Dose(μg/disc)抑菌圈直徑(mm)Diameterofinhibition(mm)敏感性SensitivityCefotaxime3030SCeftazidime3024SCefradine3018SSulfasoxazole3020SBactrim2525SNorfloxacin1023SStreptomycin1015SGentamycin1015SPolymyxinB300IU12SCiprofloxacin523STetracycline3020SLevofloxacin525SAmikacinhy-drate3016IKanamycin3017ICefalexin3017INeomycin3013IPenicillins10U6RAmpicillin106RErythromycin156RVancomycin306RPiperacillin10016RRifampicin58R

注： “S” 敏感；“ I” 中介；“R” 耐藥

Notes：“S” High sensitivity；“ I” Moderate sensitivity；“R” Resistance

肺炎克雷伯氏菌是重要的醫(yī)院感染及免疫缺陷者感染的致病菌，它作為一種條件致病菌所導致的感染在細菌感染性疾病中的比重日漸增加。肺炎克雷伯氏菌對人也造成嚴重的感染，主要感染肺部與腸道，經(jīng)研究報道[20]，肺炎克雷伯氏菌感染人肺部并且引起智力障礙。藥敏結果顯示對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥較強，這可能與大量使用抗生素比如青霉素的結果有關，致使耐藥性日趨加強，同時，藥敏試驗結果也發(fā)現(xiàn)對肺炎克雷伯氏菌耐受的抗生素藥物類型較多，即其耐藥譜越來越廣泛，這對于動物及人都有較大的危險性，因此對于肺炎克雷伯氏菌感染的機體要慎重用藥，而不是濫用抗生素。從20世紀90年代以來，一直關注研究臨床上肺炎克雷伯氏菌耐藥譜變化并已發(fā)生顯著變化。研究表明[21-22]，肺炎克雷伯氏菌已成為革蘭氏陰性菌中存在多重耐藥機制的代表菌，其耐藥率也在不斷上升。耐藥性對肺炎克雷伯氏菌造成不當?shù)慕?jīng)驗性抗生素治療[23]，因此，在防治疫病時，因根據(jù)藥敏試驗的結果選擇最佳藥物進行治療。

近年來研究表明肺炎克雷伯氏菌是致病力較強的人獸共患細菌，因此應加強對該菌的防治以免造成對人及動物的更大危害。對于其耐藥性的研究也相對較多，對于肺炎克雷伯氏菌的預防，建議臨床上最好選用對該菌敏感性高的藥物，避免濫用抗生素導致病原菌對更多藥物產(chǎn)生的耐藥性。從本試驗結果看來，肺炎克雷伯氏菌對小鼠的致病力很強，耐藥譜較廣，為小熊貓健康養(yǎng)殖生產(chǎn)和對預防肺炎克雷伯氏菌病提供一定的參考價值。

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Detection and antibiotic sensitivity test ofKlebsiellapeneumoniaeinAilurusfulgens

YANG Rui1，WEN Ji-feng1，GONG Yong-ping1，WANG Cheng-dong2， DENG Lin-hua2，HUANG Jie1，REN Lu1，YAN Qi-gui1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China； 2.ChinaConservationandResearchCenterfortheGiantPanda，Wolong623006，China)

To confirm the etiology of a dead case for a 6 year-old femaleAilurusfulgens，one strain of the predominant bacteria from pathologic tissues(heart，liver，spleen，lung and other samples) of the deadAilurusfulgenswere examined and isolated．The isolate was named R1 and no other bacteria were isolated. The bacterial etiological examination(morphological characteristics，biochemical characteristics and 16S rDNA gene detection)of R1 showed that it was identifed asK.peneumoniae. Artificial infection to mice about R1 was also conducted in this study．R1 had strong pathogenicity to mice and the LD50is 6.5×104CFU/mL. Moreover，the clinical and pathological features of the dead mice were consistent with that of theAilurusfulgens．To find effective therapeutic drugs of curing otherAilurusfulgens，antibiotic sensitivity test of R1 was conducted，and the results revealed that R1 was highly sensitive to cefotaxime et al，moderately sensitive to amikacin and resistant to penicillin．These data showed thatK.peneumoniaewas bacterial pathogen leading to death of theAilurusfulgensand it had strong resistance to penicillins，macrolides and virginiamycin and it had broad drug resistance spectrum.However，R1 is sensitive to cephalosporins and aminoglycoside antibiotics．

Ailurusfulgens；K.peneumoniae；16S rDNA；LD50；antibiotic sensitivity test Supported by the Innovation Team Project of " Changjiang Scholars and Innovation Team Development Plan" by the Ministry of Education (No. IRT0848) Corresponding author: Yan Qi-gui, Email: yanqigui@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.015

顏其貴，Email: yanqigui@126.com

1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，溫江 611130； 2.中國保護大熊貓研究中心，臥龍 623006

R378.99

A

1002-2694(2017)03-0271-05

2016-10-11 編輯：李友松

教育部《長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃》創(chuàng)新團隊項目(No. IRT0848)資助