俞 驊，潘勁草，汪皓秋，斯國靜，劉 濤，樓秀芹，張 蔚，嚴(yán) 杰

杭州地區(qū)單核細(xì)胞增生李斯特菌食品分離株分子型別研究

俞 驊1, 2，潘勁草2，汪皓秋2，斯國靜2，劉 濤2，樓秀芹2，張 蔚2，嚴(yán) 杰1

目的 研究杭州地區(qū)單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)食品分離株的分子分型情況，了解當(dāng)?shù)亓餍兄甑男蛣e特征。方法 用脈沖場凝膠電泳(PFGE)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)的方法對單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行分子分型。PFGE結(jié)果進(jìn)行聚類分析，并繪制MLST數(shù)據(jù)的最小生成樹。結(jié)果 6個血清型組成的133株杭州食品分離株共獲得19個MLST型別，并發(fā)現(xiàn)1個新的ST型ST767。ST9和ST121是數(shù)量最多的型別。用AscI和ApaI酶切分別獲得33和45個PFGE帶型。結(jié)論 杭州地區(qū)單核細(xì)胞增生李斯特菌食品分離株分子型別分布廣泛，大部分菌株是可引起人李斯特菌病的Lineage I和Lineage II菌株。食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的污染比較嚴(yán)重，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測與管理以防食源性疾病的發(fā)生。

單核細(xì)胞增生李斯特菌；多位點(diǎn)序列分型；脈沖場凝膠電泳

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一種革蘭氏染色陽性短桿菌，是最常見的食源性致病菌，該病原引起人類和動物的疾病統(tǒng)稱為李斯特菌病，其主要病癥有腦膜炎，菌血癥以及孕婦流產(chǎn)等[1]。李斯特菌病發(fā)病的高危人群是兒童，老年人以及免疫力低下或缺陷的人群，致死率可以達(dá)到20%～30%[2]。

近年來歐美發(fā)達(dá)國家連續(xù)發(fā)生了多起單核細(xì)胞增生李斯特菌感染暴發(fā)事件[2-3]，而我國食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌分離率一直處于較高的水平，但主要是散發(fā)的孕婦流產(chǎn)病例[4]，目前國內(nèi)還沒有李斯特菌病暴發(fā)的報道。由于李斯特菌病不是法定報告?zhèn)魅静?，臨床病例關(guān)注度不高；并且李斯特菌病潛伏期長，且與一般的食源性疾病引起的癥狀不同，很容易被忽視，病原菌較難開展進(jìn)一步的追蹤溯源。

血清分型和噬菌體分型技術(shù)是最常見的細(xì)菌表型分型的方法，但單核細(xì)胞增生李斯特菌的表型分型方法較為不敏感，操作復(fù)雜，因此常用分子分型的方法對菌株溯源。脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)是做為細(xì)菌分子分型的金標(biāo)準(zhǔn)，用于菌株在暴發(fā)事件中的聚類關(guān)系界定。多位點(diǎn)序列分型(Multi-locus sequence typing, MLST)通過對管家基因建立等位基因圖譜的方式來分型，用于種群分析和分子流行病學(xué)的研究。本文采用PFGE和MLST方法對近年來杭州地區(qū)單核細(xì)胞增生李斯特菌食品分離株的型別特征進(jìn)行分析，建立本地單核細(xì)胞增生李斯特菌食品分離株的分子型別數(shù)據(jù)庫，有助于病原菌的追蹤溯源。

1 材料和方法

1.1 菌株及來源 收集2003-2016年杭州地區(qū)133株分離自食品的單核細(xì)胞增生李斯特菌株。分離時間及食品類別見表1。實(shí)驗(yàn)采用的單核細(xì)胞增生李斯特菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC 54007購自中國藥品生物制品檢定所。脈沖場凝膠電泳所用Marker標(biāo)準(zhǔn)菌株為沙門氏菌H9812由中國疾病預(yù)防控制中心提供。限制性內(nèi)切酶AscI和ApaI購自New England Biolabs 公司；Ex-Taq酶，限制性內(nèi)切酶XbaI和蛋白配K購自上海生工生物工程有限公司；溶菌酶購自Merck公司；核酸提取試劑盒Qiagen DNA mini Kit購自QIAGEN公司。

表1 133株單核細(xì)胞增生李斯特菌株信息

Tab.1 Information of 133 isolates ofListeriamonocytogenesinvestigated in this study

食品種類Food年份Year生禽肉Rawpoultry生畜肉Rawmeat熟肉制品Cookedmeatproducts即食涼拌菜Instantcolddishes生食水產(chǎn)品Freshaquaticproducts預(yù)加工肉制品Processedmeatproducts其他Others菌株數(shù)No.ofstrains20031562005112221182007104111620084112820092932111192010222620115117201255201321320141231221212015332421420164211210Total4732091188133

1.2 PFGE分型 PFGE實(shí)驗(yàn)依照PulseNet International的操作手冊進(jìn)行[5]。PFGE電泳圖譜用BioNumerics v6.6軟件進(jìn)行分析。采用UPGMA方法和Dice系數(shù)來繪制聚類圖，條帶位置的差異容許度(Tolerance)設(shè)置1.5%，優(yōu)化值(Optimization)設(shè)置1.5%，分別繪制菌株采用AscI和ApaI酶切的帶型關(guān)系圖譜。

1.3 MLST分型 菌株核酸提取，PCR引物和擴(kuò)增反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)[6]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用BioNumerics v6.6 軟件進(jìn)行拼接分析，獲得各菌株的ST型別。為構(gòu)建單核細(xì)胞增生李斯特菌種群結(jié)構(gòu)，將Institute Pasteur MLST Databases網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)導(dǎo)入BioNumerics，繪制MLST最小生成樹圖(Minimum Spanning Tree, MSTree)。

2 結(jié) 果

2.1 PFGE分型結(jié)果 133株單核細(xì)胞增生李斯特菌用AscI酶切產(chǎn)生約10-12條帶，片段長度25 kb-1 000 kb，共獲得33個PFGE帶型；131株單核細(xì)胞增生李斯特菌(2株酶切降解)用ApaI酶切產(chǎn)生約13-15條帶，片段長度25 kb-480 kb，共獲得45個PFGE帶型。PFGE結(jié)果散在分布，未見與分離時間或分離食品類別相關(guān)的聚類關(guān)系。AscI和ApaI酶切的不同PFGE帶型的聚類關(guān)系見圖1、2。

2.2 MLST分型結(jié)果 133株單核細(xì)胞增生李斯特菌共分成19個ST型(參見圖3)，ST9(1/2a)和ST121(1/2c)是分離數(shù)最多的型別。根據(jù)等位基因的關(guān)系，引起人類和動物李斯特菌病的菌株譜系(Lineage)主要為Lineage I和Lineage II型，也是杭州地區(qū)食品分離株的主要型別。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1個新型別ST767，該型別與本地分離數(shù)最多的ST9型僅在等位基因abcZ有差異，屬于同一個克隆系(Clonal Complex)。本地分離株在MLST數(shù)據(jù)庫最小生成樹的型別分布見圖3，本地分離株的最小生成樹見圖4。

圖1 133株單核細(xì)胞增生李斯特菌AscI酶切圖譜聚類分析Fig.1 PFGE cluster analysis on 133 Listeria monocytogenes by AscI

圖2 131株單核細(xì)胞增生李斯特菌ApaI酶切圖譜聚類分析Fig.2 PFGE cluster analysis on 133 Listeria monocytogenes by ApaI

實(shí)心圓點(diǎn)表示杭州本地食品分離株的型別

Solid dots are localListeriamonocytogenesisolates MLST types.

圖3 單核細(xì)胞增生李斯特菌MLST數(shù)據(jù)庫的最小生成樹圖

Fig.3 Minimum spanning tree forListeriamonocytogenesMLST database isolates

圓點(diǎn)大小表示菌株數(shù)，圓點(diǎn)周圍數(shù)字表示MLST型別，線條中數(shù)字代表等位基因的差異數(shù)

The dots sizes indicate strain number, the numbers outside dots indicate MLST type, and the number in the lines means the number of different genes.

圖4 133株本地分離株的最小生成樹

Fig.4 Minimum spanning tree for 133Listeriamonocytogeneslocal isolates

3 討 論

近年來，西方發(fā)達(dá)國家發(fā)生了多起由單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的食源性疾病暴發(fā)事件[7-9]。De Noordhout CM[10]通過對全球李斯特菌病meta數(shù)據(jù)分析評估，認(rèn)為李斯特菌病能引起較高的致死和致殘率。隨著國內(nèi)經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，交通逐漸便利，人民的生活水平日益提高，日常的飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)與西方發(fā)達(dá)國家越來越接近，我們應(yīng)更加關(guān)注單核細(xì)胞增生李斯特菌食源性感染的風(fēng)險。

單核細(xì)胞增生李斯特菌引起人和動物李斯特菌病暴發(fā)的血清型主要是1/2a，1/2b和4b[11]。免疫缺陷或免疫低下者是李斯特菌病易感人群，但目前其致病機(jī)制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌食品分離株的常見毒力基因檢出率超過98%[12-13]，因此菌株毒力基因的攜帶與否和菌株致病性沒有直接關(guān)聯(lián)。

PFGE結(jié)果顯示ApaI酶切能獲得更多的帶型數(shù)，但存在部分血清型單核細(xì)胞增生李斯特菌均無法獲得帶型的情況，這在Brosch R[14]和Nevesa E[15]等人的研究中也報道過。AscI酶切條帶數(shù)少，但是條帶分布均勻，更容易識別。本實(shí)驗(yàn)的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌株的PFGE聚類關(guān)系可以分成3個組，分別為Lineage I，Lineage II和Lineage III/IV。ApaI酶切帶型中Lineage II的菌株可以分為5個聚類(以80%為界限)，而AscI酶切的帶型則差異明顯小于ApaI酶切，只有3個聚類。對于Lineage I型的菌株，ApaI和AscI酶切的帶型分類差異不明顯，可能與菌株數(shù)量與地區(qū)分布等因素有關(guān)。在不同年份均可分離得到主要PFGE帶型的菌株，說明該型別菌株是本地流行株。PFGE型別顯示不同帶型的菌株與食品樣品種類和食品采集時間關(guān)系不明顯，同一采樣地點(diǎn)采集的不同種類樣品出現(xiàn)聚類的現(xiàn)象提示樣品污染來源很可能與后期包裝，運(yùn)輸，儲存和銷售等環(huán)節(jié)有關(guān)。

通過構(gòu)建Pasteur公共數(shù)據(jù)庫的MLST 最小生成樹，對照Wang Y等[16]對中國單核細(xì)胞增生李斯特菌食品分離株的研究，結(jié)果顯示杭州分離株與國內(nèi)其他地區(qū)分離株的ST型別基本一致。比較劉萍萍等[17]的研究，結(jié)果顯示上海動物源性單核細(xì)胞增生李斯特菌分離株MLST型別在杭州食品分離株中均可分離得到，提示這些型別的單核細(xì)胞增生李斯特菌可能為國內(nèi)的主要流行株。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)1個屬于Lineage II的新型別ST767與ST9只在abcZ基因(ST767:12;ST9:6)有差異。但在該基因序列上這2個等位基因位點(diǎn)相差了10個堿基，有可能是遺傳上發(fā)生1次重組事件產(chǎn)生的新型別。而abcZ:12這個等位基因只出現(xiàn)在除ST312的Lineage I的型別中(ST8, ST88, ST156, ST296,ST310, ST594, ST612, ST619, ST730, ST767)，而同屬Lineage II的型別ST312的菌株也是分離自中國，提示這種重組事件可能是在中國發(fā)生的。杭州地區(qū)食品分離株的ST型別除ST299為Lineage III型外，其他均為Lineage I/II型菌。而2株ST299菌株均為分離自三文魚中，從食品的來源看可能為國外輸入性菌株。

杭州本地流行株主要分布在圖3最小生成樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的節(jié)點(diǎn)位置，這些型別的菌株在國際上也是主要流行株[18]，如ST1，ST3，ST121等引起的食源性疾病暴發(fā)[19-21]。而國內(nèi)李斯特菌病的散發(fā)病例也主要由這些型別引起[22]。但同時也存在ST9流行株衍生出的ST767本地變異株。

通過比對本地食品分離株的PFGE帶型和引起歐美國家食物中毒暴發(fā)的血清型為1/2b，4b菌株的帶型，結(jié)果顯示帶型并不一致。但我們?nèi)詰?yīng)高度重視食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的污染狀況，加強(qiáng)銷售終端在運(yùn)輸和儲存環(huán)節(jié)上的管理。同時加強(qiáng)李斯特菌病的重視程度，尋找臨床分離株和食品分離株的溯源關(guān)系，才能使單核細(xì)胞增生李斯特菌分子分型數(shù)據(jù)庫更有應(yīng)用意義。

(致謝：我們對于單核細(xì)胞增生李斯特菌MLST數(shù)據(jù)庫的維護(hù)者Institut Pasteur (Paris, France) 提供的MLST數(shù)據(jù)以及對新數(shù)據(jù)的提交和審核表示感謝。)

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Molecular characteristics ofListeriamonocytogenesfoodborne
isolates in Hangzhou, China

YU Hua1,2, PAN Jing-cao2, WANG Hao-qiu2, SI Guo-jing2, LIU Tao2, LOU Xiu-qin2, ZHANG Wei2, YAN Jie1

(1.DepartmentofMedicalMicrobiologyandParasitology,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China; 2.HangzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310026,China)

We determined molecular characteristics ofListeriamonocytogenesfoodborne isolates in Hangzhou and investigated the characterization of local strains. Multi-locus sequence typing(MLST) and pulsed-field gel electrophoresis(PFGE) were applied to identify molecular types ofListeriamonocytogenesisolates. Results showed that a total of 133 strains of 6 serotypes were divided into 19 MLST types including a new type ST767. ST9 and ST121 were the major ST types. There were 33 and 45 PFGE patterns characterized byAscI andApaI. The molecular types ofListeriamonocytogenesstrains were widely distributed in Hangzhou. It is indicated that the major clusters were Lineage I and Lineage II which will cause listeriosis. The contamination ofListeriamonocytogenesin food is serious in Hangzhou and the surveillance and management should be strengthened to prevent the food borne diseases.

Listeriamonocytogenes; multi-locus sequence typing; pulsed field gel electrophoresis Supported by the Zhejiang Provincial Medical and Health Science and Technology Program (No. 2015123381) Corresponding author: Yan Jie, Email: med_bp@zju.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.014

嚴(yán)杰，Email: med_bp@zju.edu.cn

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，杭州 310058； 2.杭州市疾病預(yù)防控制中心，杭州 310026

R378

A

1002-2694(2017)03-0264-07

2016-12-31 編輯：林丹

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2015123381)