范偉偉，倪 華，孫衛(wèi)平，張 劍，李超龍，吳倩倩，王長軍，潘秀珍

2型豬鏈球菌FtsZ重組蛋白的制備及其酶活性測定

范偉偉1,2，倪 華2，孫衛(wèi)平2，張 劍2，李超龍2，吳倩倩2，王長軍2，潘秀珍1,2

目的 制備2型豬鏈球菌絲狀溫度敏感蛋白(Filamentous temperature-sensitive protein Z，F(xiàn)tsZ)重組蛋白并測定其水解三磷酸鳥苷(GTP)的酶活性。方法 從2型豬鏈球菌中國強毒株05ZYH33基因組中PCR擴增目的基因ftsz，構建重組表達質粒 pET28a-ftsz，轉化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，篩選陽性轉化子進行 IPTG誘導表達，SDS-PAGE 鑒定表達產(chǎn)物，Ni2+親和層析柱純化重組蛋白，Western blot分析。重組蛋白免疫新西蘭兔后收集多抗血清，間接 ELISA 法檢測抗體效價，用孔雀綠-磷酸檢測法測定FtsZ重組蛋白的GTP酶活性。結果 成功構建pET28a-ftsz重組表達質粒；純化獲得大量純度較高的FtsZ重組蛋白； ELISA檢測兔多抗血清效價達1∶13 107 200；Western blot顯示FtsZ重組蛋白能夠與His-Tag單抗和兔多抗血清發(fā)生反應；以GTP為底物檢測重組蛋白具有GTP酶活性。結論 成功制備了具有GTP酶活性的2型豬鏈球菌FtsZ重組蛋白并以重組蛋白為抗原制備出高效價的多抗血清，為進一步研究2型豬鏈球菌FtsZ在細胞分裂調控過程中的作用奠定基礎。

2型豬鏈球菌；絲狀溫度敏感蛋白；純化

豬鏈球菌(Streptococcussuis，S.suis)為革蘭氏陽性兼性厭氧菌，是重要人獸共患病病原菌，在豬鏈球菌33個血清型中以2型豬鏈球菌(S.suis2)分布最廣、致病性最強、臨床檢出率最高[1-3]，其感染人導致腦膜炎、敗血癥、心內膜炎以及鏈球菌中毒性休克綜合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)[4]。本課題組前期已完成2型豬鏈球菌強毒株05ZYH33全基因組的測序和注釋[5]。通過基因組注釋分析發(fā)現(xiàn) 05SSU_0481 編碼絲狀溫度敏感蛋白 (Filamentous temperature-sensitive protein Z，F(xiàn)tsZ)。FtsZ 是一種細菌分裂相關蛋白，在細菌分裂過程中起重要的核心作用。目前，F(xiàn)tsZ在細菌分裂過程中的功能作用，在E.coli、B.subtilis、分枝桿菌等細菌中已有相關研究報道[6-7]。然而在豬鏈球菌中尚未見有關FtsZ的研究報道。本文以S.suis2強毒株05ZYH33為對象，對其ftsz基因進行克隆及表達，純化獲得到純度較高并具有GTP酶活性的重組蛋白，為進一步研究 FtsZ在S.suis2細菌分裂過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和引物S.suis2菌株 05ZYH33 分離自2005年四川資陽的中毒性休克綜合征病人的外周血，本實驗室保存。

表1 菌株、質粒和引物

Tab.1 Bacterial strains, plasmid and primers used in this study

BacterialstrainsandprimersPhenotypesandcorrelativecharacteristicsSourcesBacterialstrains05ZYH33VirulentstrainisolatedfromadeadpatientwithSTSSLabcolletionE.coliDH5αCloninghostforrecombinantplasmidTransgenBL21(DE3)ExpressionhostforrecombinantplasmidTransgenPlasmidpMD18-TE.colicloningvector,lacZ,AmprTaKaRapET28aExpressionvector,kanrTaKaRaPrimers0481F5'-GGATCCATGGCATTTTCATTTG-3'(BamHI)0481R5'-CTCGAGGCGATTACGGAAGAAT-3'(XhoI)

1.1.2 試劑 PCR擴增試劑盒、質粒提取試劑盒、限制性內切酶BamHI和XhoI、T4連接酶和250 bp DNA Ladder Marker購于大連寶生物工程公司； DNA 膠回收試劑盒購自Promega公司；Malachite Green Phosphate Assay 購于sciencell；PageRuler Prestained Protein Ladder、ECL化學發(fā)光試劑盒購于Thermo scientific；HRP標記的羊抗鼠IgG、HRP標記的羊抗兔IgG購于博奧森生物工程有限公司；His-Tag單克隆抗體購自CST；Todd-Hewitt Broth (THB)，購自 Difco 公司；SDS、丙烯酰胺、N,N-2 亞甲雙丙烯酰胺、卡那霉素、氨芐霉素和IPTG購于上海生工生物公司；BSA(Albumin Bovine V)購于Roche公司；其他化學試劑均為分析純。

1.1.3 實驗動物 健康新西蘭雌性兔(2 kg)購于南京金陵種兔場。

1.2 實驗方法

1.2.1ftsz基因的篩選及生物信息學分析 利用Blast軟件等生物信息學工具分析本實驗室S.suis2 05ZYH33全基因組中ftsz基因序列，根據(jù)其對應的氨基酸序列搜索同源蛋白，進行同源性分析，根據(jù)比對結果利用MEGA.7軟件繪制FtsZ蛋白分子進化樹。

1.2.2 PCR擴增目的基因 以05ZYH33全基因組為模板，用引物F 5′-GGATCCATGGCATTTTCATTTG-3′(BamHI)，R5′-CTCGAGGCGATTACGGAAGAAT-3′(XhoI)進行PCR 擴增。PCR 擴增體系(25 μL)：ddH2O18.3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mix 2 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL， Ex Taq 酶(5 U/μL) 0.2 μL，模板(約 100 mg/L)1 μL。PCR 擴增條件： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 5 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR 擴增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，DNA膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.3 重組表達載體的構建和鑒定 將ftsz目的片段與 pMD18-T克隆載體16 ℃水浴過夜連接，連接產(chǎn)物轉化宿主菌E.coliDH5α，菌液PCR驗證為陽性的轉化子進行質粒提取，BamHI和XhoI雙酶切鑒定及測序證實為重組質粒pMD18-T-ftsz。質粒pMD18-T-ftsz和 pET28a載體分別雙酶切，回收目的片段，通過T4 DNA連接酶連接后轉化至宿主菌E.coliDH5α，菌液PCR驗證為陽性的轉化子提取質粒，經(jīng)酶切及測序驗證后，重組質粒pET28a-ftsz-80 ℃保存。

1.2.4 FtsZ重組蛋白的誘導表達及純化 將重組pET28a-ftsz質粒轉化E.coliBL21(DE3)，LB平板(含卡那霉素100 μg/mL)篩選陽性轉化子，挑取單菌落接種于LB(含卡那霉素100 μg/mL)培養(yǎng)液中， 37 ℃培養(yǎng)12 h后，以1∶50接種于新鮮LB(含卡那霉素100 μg/mL)培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，37 ℃誘導4 h，4 ℃ 以12 000 r/min 離心10 min，收集沉淀物。加適量pH 7.4的PBS(140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4)重懸，取適量重懸的菌體加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，沸水中 5 min，10% SDS-PAGE 檢測目的蛋白的表達。超聲破碎后離心，取上清與沉淀進行10% SDS-PAGE。對上清用Ni2+親和層析柱進行親和層析，用咪唑緩沖液梯度洗脫，純化重組蛋白，10% SDS-PAGE 電泳鑒定目的蛋白的分子量和純度。

1.2.5 FtsZ兔多抗血清的制備 取400 μg FtsZ重組蛋白溶于0.01 mol/L PBS(無菌)中與等體積完全弗氏佐劑進行乳化，將乳化的FtsZ蛋白背部皮下多點注射新西蘭兔；第15 d及第29 d，各取等量FtsZ重組蛋白與等體積不完全弗氏佐劑乳化，背部皮下多點注射新西蘭兔；第43 d，用未經(jīng)乳化的400 μg FtsZ重組蛋白對新西蘭兔加強免疫。加強免疫后第7 d耳緣靜脈采血測定其抗體效價，然后采血并分離血清。

1.2.6 間接 ELISA 測定血清抗體效價 純化的FtsZ重組蛋白以5 μg/mL 100 μL/孔4 ℃過夜包被ELISA 96孔板，PBST洗3次，3% BSA 37 ℃封閉2 h，PBST洗3次，分別加入100 μL/孔梯度稀釋的FtsZ兔多抗血清，陰性對照采用免疫前兔血清，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入100 μL/孔1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，于37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入100 μL/孔TMB顯色避光5～10 min，然后加入100 μL/孔2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀于450 nm處讀取OD值，計算P/N值大于2.1時即為陽性結果。

1.2.7 Western blot分析 取FtsZ重組蛋白，加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，沸水煮 5 min，進行10%SDS-PAGE電泳，采用電轉印(濕轉恒流 300 mA 70 min)將蛋白轉移至PVDF膜上，然后用封閉液(含5% 脫脂牛奶的TBST)室溫封閉2 h，TBST洗膜，將膜分別與1∶1 000稀釋的His-Tag單抗和1∶4 000稀釋FtsZ兔多抗血清孵育4 ℃過夜，TBST洗膜，再將膜分別與HRP標記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG37 ℃孵育2 h，TBST洗膜，ECL化學發(fā)光顯色。

1.2.8 FtsZ重組蛋白GTP酶活性的測定 參照文獻[8]利用孔雀綠磷酸鹽分析法測定FtsZ重組蛋白GTP酶活性。FtsZ重組蛋白(0.59 mg/mL)分別置于用緩沖液(50 mmol/L Tris pH 7.5，5 mmol/L MgCl2，250 mmol/L KCl)配制的不同濃度的GTP(0 mmol/L、0.04 mmol/L、0.08 mmol/L、0.16 mmol/L、0.31 mmol/L、0.62 mmol/L、1.25 mmol/L 、2.5 mmol/L)中37 ℃孵育25 min，加入終止液(65 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris pH 7.5，5 mmol/L MgCl2，250 mmol/L KCl)終止反應。加入Malachite Green Reagent A 室溫反應10 min，Malachite Green Reagent B 室溫反應20 min，用酶標儀檢測630 nm處的吸光度值。同時繪制磷酸標準曲線。酶活性單位定義為：以每分鐘每毫克的酶蛋白作用于底物GTP所釋放Pi的納摩爾數(shù)(nmolPi/mg/min)來表示。

2 結 果

2.1 05ZYH33中ftsz基因的生物信息學分析 通過Blast比對發(fā)現(xiàn)，05ZYH33基因組中SSU05_0481蛋白屬于微管蛋白超家族，與其他鏈球菌中絲狀敏感蛋白同源性為78%～88%，說明其在進化過程中高度保守。根據(jù)比對結果利用MEGA.7軟件繪制FtsZ蛋白的分子發(fā)育樹(圖1)。

圖1 FtsZ蛋白的分子進化樹Fig.1 Phylogenetic trees of FtsZ protein

2.2 目的基因的擴增 以S.suis2 05ZYH33 基因組DNA為模板，對目的基因ftsz進行 PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖 2)。結果顯示，在 1 200 bp有一特異性條帶，片段大小與ftsz(1 227 bp)基本相符。

M：DNA marker；1：PCR產(chǎn)物M: DNA marker; 1: products of PCR 圖2 PCR擴增結果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of target gene

2.3 重組表達載體的構建與鑒定 將重組表達載體pET28a-ftsz經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得1 200 bp左右的目的片段(圖3)，測序結果顯示該片段全長1 227 bp，與ftsz基因序列完全相同，說明pET28a-ftsz質粒構建正確。

M：DNA marker；1：重組質粒；2：XhoI單酶切；3：BamHI+XhoI雙酶切M:DNA marker; 1: pET28a-ftsz; 2: pET28a-ftsz/XhoI; 3: pET28a-ftsz/BamHI+XhoI圖3 重組質粒pET28a-ftsz酶切鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pET28a-ftsz by restriction enzymes

2.4 重組蛋白的表達 重組表達質粒pET28a-ftsz轉化E.coliBL21(DE3)，經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導，SDS-PAGE分析蛋白誘導表達情況。結果顯示IPTG誘導的表達菌，在約50 kD處有一明顯的新生蛋白條帶(圖4)。

M：蛋白Marker；1：未誘導的pET28a /BL21； 2：IPTG誘導的pET28a/BL21；3：未誘導的pET28a-ftsz/BL21；4：IPTG誘導的pET28a-ftsz/BL21M: protein Marker; 1: pET28a/BL21 uninduced with IPTG; 2: pET28a/BL21 induced with IPTG; 3: pET28a-ftsz/BL21 uninduced with IPTG; 4: pET28a-ftsz/BL21 induced with IPTG圖4 重組質粒轉化菌表達產(chǎn)物SDS-PAGE檢測Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant expression product

2.5 FtsZ重組蛋白可溶性表達鑒定及純化 經(jīng)IPTG誘導的表達菌，超聲破碎后其上清中含有大量目的蛋白，表明目的蛋白能夠在上清中可溶性表達。利用Ni2+親和層析柱對上清進行純化，純化后獲得純度較高的FtsZ重組蛋白。

M：蛋白 Marker；1：重組質粒轉化菌IPTG誘導超聲后上清；2：重組質粒轉化菌IPTG誘導超聲后沉淀；3：純化的FtsZ蛋白M: protein Marker; 1: The supernatant lysed by sonication; 2: Insoluble pellets lysed by sonication; 3: Purified FtsZ protein圖5 FtsZ重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant FtsZ protein

2.6 FtsZ兔多抗血清制備及抗體效價檢測 用純化的FtsZ重組蛋白免疫新西蘭兔后，收集兔多抗血清，采用間接ELISA 方法測定其抗體效價為1∶13 107 200(圖6)。

圖6 間接ELISA法檢測血清抗體效價Fig.6 Serum antibody titer detect by indirect ELISA

2.7 Western blot 分析 Western blot結果顯示FtsZ重組蛋白不但可以與His-Tag單抗發(fā)生反應(圖7A)，而且還可以與其兔多抗血清發(fā)生反應(圖7B)。

A：FtsZ與His-tag單抗免疫印跡； B：FtsZ與兔多抗血清免疫印跡A: Western blot with monoclonal antibody against His-tag; B: Western blot with rabbit serum against recombinant FtsZ圖7 FtsZ的免疫印跡Fig.7 Western blot analysis of the recombinant FtsZ

2.8 FtsZ重組蛋白的GTP酶活性測定 FtsZ重組蛋白的GTP酶活性由Pi釋放量表示。FtsZ重組蛋白(0.56 mg/mL)與不同濃度的GTP(0～2.5 mmol/L)反應，測定630 nm的吸收值，通過Pi標準液繪制標準曲線y=0.009 9x+0.0215(R2=0.991 8)進行換算，得出不同GTP濃度下，Pi的釋放量，從而反映FtsZ的GTP酶活性。結果顯示隨著底物GTP濃度的增加，Pi釋放量增加，說明純化得到具有GTP酶活性的FtsZ重組蛋白(圖8)。

圖8 FtsZ的GTP酶活性測定Fig.8 GTPase activity of FtsZ

3 討 論

FtsZ是一種存在于除支原體、衣原體和古細菌外幾乎所有原核生物中重要的、高度保守的細菌分裂相關蛋白，在細菌分裂過程中起著十分重要的作用[9-10]。FtsZ是真核細胞微管同源蛋白，含有GTP 結合基序(GGGTGTG)，具有GTP酶活性[11]，細菌分裂的后期階段即胞質分裂的過程中在GTP 的參與下在細胞中部聚合成Z 環(huán)，Z環(huán)收縮最后使一個細菌分裂成兩個，完成整個細菌的分裂過程[12]。由于FtsZ在細菌分裂過程中的重要作用以及生長過程中的高度保守，被認為是抗菌藥物研究的理想靶點[13]。

多項研究表明FtsZ是細菌真核樣絲蘇氨酸激酶(Ser/Thr kinase, STK)的磷酸化底物。Thakur等[14]對分枝桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，其真核樣絲蘇氨酸磷酸酶(PknA)能夠磷酸化FtsZ。Silvestroni等[15]運用磷酸肽富集與質譜分析發(fā)現(xiàn)GBS中FtsZ是真核樣絲蘇氨酸激酶磷酸化底物。Giefing等[16]通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌StkP和FtsZ均定位于細菌分裂位點，并制備了FtsZ重組蛋白及相應的多抗血清，研究發(fā)現(xiàn)FtsZ可被StkP磷酸化。課題組前期對2型豬鏈球菌中stk基因功能研究發(fā)現(xiàn)，該基因的缺失會導致分裂表型異常，透射電子顯微鏡顯示stk基因敲除株中細胞隔膜形成受阻[17]，其具體機制不明?；蚪M注釋05SSU_0481 編碼蛋白為細胞分裂蛋白FtsZ[5]，為探究S.suis2中FtsZ在細胞分裂過程中的功能作用以及與STK的相互關系，本研究從S.suis2中國強毒株05ZYH33基因組中克隆ftsz基因，成功構建pET28a-ftsz重組表達質粒，以低濃度IPTG誘導重組表達菌，獲得大量可溶性表達蛋白，Ni2+親和層析獲得較高純度的FtsZ重組蛋白，孔雀綠磷酸鹽法活性分析表明FtsZ重組蛋白具有GTP酶活性，利用重組蛋白免疫新西蘭兔獲得高效價的FtsZ兔多抗血清，為進一步開展2型豬鏈球菌FtsZ蛋白在細胞分裂調控及抗菌藥物篩選研究奠定了基礎。

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Purification and enzyme activity assay of filamentous temperature-sensitive protein Z inStreptococcussuisserotype 2

FAN Wei-wei1,2, NI Hua2, SUN Wei-ping2, ZHANG Jian2, LI Chao-long2, WU Qian-qian2, WANG Chang-jun2, PAN Xiu-zhen1,2

(1.ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing211198,China;2.InstituteofMilitaryMedicalSciences,NanjingCommand,Nanjing210002,China)

We conducted purification of filamentous temperature-sensitive protein Z ofStreptococcussuisserotype 2 (S.suis2) and measured its GTPase activity. Theftszgene in the genome of the Chinese 05ZYH33 strain ofS.suis2 was successfully amplified using PCR, and then theftszgene was cloned into prokaryotic expression plasmid pET28a, and the recombinant plasmid pET28a-ftszwas transformed intoE.coliBL21. After induction by IPTG, the isolated FtsZ protein was analyzed with SDS-PAGE. Then the recombinant protein was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography. The rabbit serum was harvested after immunization with recombinant FtsZ protein, and was analyzed by indirect ELISA and Western blotting. The GTPase activity of FtsZ was measured with the malachite green method. Results showed that successfully constructed recombinant plasmid pET28a-ftszand the recombinant protein with high purity was obtained; Western blot result indicated that FtsZ could react with the His-tag antibody and the rabbit serum; the polyclonal antibody titer of the rabbit serum reached 1∶13 107 200; FtsZ have GTPase activity. We successfully preparedS.suis2 recombinant protein FtsZ having GTPase activity and high titer antiserum would be useful for the further study ofS.suis2 cell division mechanism.

Streptococcussuisserotype 2; filamentous temperature-sensitive protein Z; purification Funded by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81571965 & 81471920)， the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No.BK20151091)，and the 333 Engineering Science Foundation of Jiangsu Province (No.BRA2014363) Corresponding author: Pan Xiu-zhen,Email: panxiuzhen_2004@163.com

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10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.011

國家自然科學基金(No.81571965，No.81471920)、江蘇省自然科學基金(No.BK20151091)、江蘇省333工程科研資助項目(No.BRA2014363)聯(lián)合資助

潘秀珍，Email:panxiuzhen_2004@163.com

1.中國藥科大學中藥學院，南京 211198； 2.南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所，南京 210002

R378.1

A

1002-2694(2017)03-0250-06

2016-08-08 編輯：王曉歡