陳 平, 王 翔, 支三軍, 韋長梅

(淮陰師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 江蘇省低維材料化學(xué)重點建設(shè)實驗室, 江蘇 淮安 223300)

新型兩親性二肽分子的合成與表征

陳 平, 王 翔, 支三軍, 韋長梅

(淮陰師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 江蘇省低維材料化學(xué)重點建設(shè)實驗室, 江蘇 淮安 223300)

通過多肽液相合成的方法,利用氨基與活化酯在水與四氫呋喃混合溶劑中進(jìn)行反應(yīng),高產(chǎn)率地合成出谷氨酸二肽分子衍生物．同時基于該二肽結(jié)構(gòu)中棕櫚酸分子端位疏水性的烴基鏈與谷氨酸側(cè)基二聚乙二醇單甲醚鏈段的親水性,制備得到了一種新型的具有兩親性的二肽分子,并對其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)進(jìn)行了研究．

多肽液相合成; 兩親性二肽分子; 谷氨酸

0 引言

多肽類藥物及基于多肽的生物醫(yī)用材料,在各類疾病的治療過程中具有非常廣泛的應(yīng)用[1]．但是由離子型氨基酸形成的多肽藥物分子,其溶解性往往會受到環(huán)境pH、鹽濃度等因素的影響,并且這些由離子型氨基酸組成的完全親水性的多肽藥物及載體,往往很難透過疏水性的細(xì)胞膜被機(jī)體所吸收[2]．而兩親性分子可以在親水性與親油性之間找到一個平衡點,類似于表面活性劑或脂質(zhì)體的性質(zhì),使具有兩親性結(jié)構(gòu)的多肽分子可以在水溶液中自組裝形成多樣性的結(jié)構(gòu),從而提高多肽類藥物的生物利用度[3-4]．同時,離子型多肽分子往往還會導(dǎo)致生物體內(nèi)帶相反電荷生物分子的聚沉,引起生物毒性效應(yīng),從而限制了該類多肽分子的應(yīng)用．利用合成得到的側(cè)鏈為寡聚乙二醇功能化的谷氨酸衍生物,這種側(cè)基為非離子型結(jié)構(gòu)的氨基酸,由于其寡聚乙二醇側(cè)鏈的溶解性具有溫度響應(yīng)性,因此該新型氨基酸單體也被用于制備溫度響應(yīng)性的聚多肽[5]和構(gòu)建多肽水凝膠體系[6]的研究中．但是這些通過開環(huán)聚合方法得到的聚多肽結(jié)構(gòu),通常不具有確定的、單一的分子量,其分子量分布在某一范圍內(nèi),并且聚多肽合成過程的條件一般較為苛刻,需要在無水、無氧且聚合單體純度較高的條件下,才能合成出分子量分布較窄的聚多肽結(jié)構(gòu)．

本文基于多肽液相合成的方法,不需要對氨基酸單體進(jìn)行化學(xué)修飾保護(hù),在四氫呋喃與水的混合溶劑中,能夠高產(chǎn)率地合成出谷氨酸二肽分子衍生物．并且在該二肽分子的端位上引入了一段疏水性的烴基鏈段,同時利用氨基酸側(cè)鏈寡聚乙二醇鏈段的溫度響應(yīng)性,合成出了一種新型的具有兩親性的二肽分子．

1 實驗部分

1.1 材料與主要試劑

L-谷氨酸(上海吉爾生化,99%),N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC,上海吉爾生化,99%),N-羥基丁二酰亞胺(阿拉丁試劑,NHS,99%),4-二甲氨基吡啶(阿拉丁,DMAP,99%),棕櫚酸(阿法埃莎試劑,Pal,99%)購買后未經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用．四氫呋喃(THF)經(jīng)高純氮鼓泡除氧再利用活性氧化鋁柱干燥后使用．去離子水(電阻率>18 MΩ·cm-1)通過Millipore Milli-Q純化系統(tǒng)獲得．1H-NMR使用Bruker AV400 FT-NMR核磁共振儀測定．

1.2 γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-左旋-谷氨酸(L-EG2-Glu)的合成

在燒瓶中加入25 mL二乙二醇單甲醚,攪拌下加入5 g谷氨酸,形成白色懸濁液,于0℃冰水浴中緩慢滴加3 mL濃硫酸,滴加完畢后緩慢升溫至室溫,在室溫下攪拌過夜．反應(yīng)結(jié)束后溶液變澄清,將其緩慢滴加到三乙胺(12 mL)的異丙醇(48 mL)溶液中產(chǎn)生白色沉淀,經(jīng)離心分離得到白色固體,用過量的異丙醇洗滌2次,經(jīng)真空干燥后最終得到L-EG2-Glu,產(chǎn)率為48%．1H-NMR(400 MHz,D2O):δ4.31-4.22(t,2H),3.82-3.72(m,3H),3.72-3.64(m,2H),3.63-3.56(m,2H),3.39-3.32(s,3H),2.66-2.49(m,2H),2.25-2.07(m,2H);ESI-MS(m/z)[M+H]+Calcd C10H19NO6,250.1;found 250.1.

圖1 γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-左旋-谷氨酸(L-EG2-Glu)的合成

1.3 棕櫚酸活化酯(Pal-NHS)的合成

如圖2所示,取棕櫚酸(4.0 g),1.1倍當(dāng)量的N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(3.540 g),1.05倍當(dāng)量的N-羥基丁二酰亞胺(1.885 g),0.01倍當(dāng)量的DMAP(0.019 g),無水四氫呋喃約30 mL,冰水浴中反應(yīng)5 min后,溶液變成乳白色,有大量不溶物N,N′-二環(huán)乙基脲(DCU)產(chǎn)生．反應(yīng)過夜后,置于4℃冰箱約1 h后,過濾除去大部分的DCU．再將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的2/3后,再于4℃放置約4 h,過濾除去析出的DCU．繼續(xù)濃縮至原體積的1/3, 于4℃放置后,進(jìn)一步過濾除去殘留的DCU．最后旋蒸濃縮后得到產(chǎn)物Pal-NHS,產(chǎn)率為90%．

圖2 Pal-NHS的合成

1.4 棕櫚酸-γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-L-谷氨酸(Pal-EG2-Glu)的合成

首先取1.0 g Pal-NHS,溶解于10 mL THF中,然后取1.2倍當(dāng)量的L-EG2-Glu(0.846 g),2.4倍當(dāng)量的NaHCO3(0.570 g),加10 mL水,調(diào)節(jié)溶液pH至10左右,使L-EG2-Glu完全溶解．在冰水浴中,將谷氨酸的水溶液緩慢滴加至上述THF溶液中,反應(yīng)約5 h后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去反應(yīng)體系中大部分的THF,再用乙酸乙酯/鹽酸(1:1v/v)水溶液反復(fù)萃取3次．有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥后,過濾蒸干得到Pal-EG2-Glu,產(chǎn)率為86%．1H-NMR(400 MHz,CDCl3):δ4.64-4.50(m,1H),4.36-4.16(m,2H),3.70-3.67(t,2H),3.66-3.62(m,2H),3.60-3.57(m,2H),3.40(s,3H),2.57-2.38(m,2H),2.28-1.69(m,4H),1.63-1.58(m,2H),1.28-1.24(m,24H),0.89-0.86(t,3H);ESI-MS(m/z)[M+Na]+Calcd C26H49NO7Na,510.4;found 510.4.

圖3 Pal-EG2-Glu的合成

1.5 棕櫚酸-(γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-L-谷氨酸)2二肽(Pal-(EG2-Glu)2)的合成

取0.8 g Pal-EG2-Glu溶解于15 mL四氫呋喃中,然后如前述方法,依次加入相應(yīng)量的DCC、NHS和DMAP,在冰水浴中反應(yīng)30 min后,再于常溫下反應(yīng)3 h,過濾除去產(chǎn)生的DCU,后經(jīng)多次濃縮,并于4℃冷卻進(jìn)一步除去殘留的DCU,得到連接有活化酯的谷氨酸Pal-EG2-Glu-NHS．將該產(chǎn)物溶解于10 mL THF,按前述方法,將相應(yīng)摩爾比例的L-EG2-Glu溶解于NaHCO3水溶液中,然后在冰水浴中緩慢滴加到Pal-EG2-Glu-NHS的THF溶液中,反應(yīng)過夜后,經(jīng)萃取、干燥、旋蒸后得到最終的產(chǎn)物,產(chǎn)率為83%．1H-NMR(400 MHz,CDCl3):δ4.62-4.53(m,2H),4.31-4.20(m,4H),3.72-3.69(t,4H),3.66-3.64(m,4H),3.61-3.57(m,4H),3.40-3.39(d,6H),2.48-2.39(m,4H),2.27-1.70(m,6H),1.62-1.60(m,2H),1.28-1.25(m,24H),0.90-0.86(t,3H);ESI-MS(m/z)[M+H]+Calcd C36H67N2O12,719.5;found 719.5.

圖4 Pal-(EG2-Glu)2的合成

2 結(jié)果與討論

根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法[5],將二聚乙二醇單甲醚與谷氨酸在濃硫酸催化的條件下發(fā)生酯化反應(yīng),制備得到γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-左旋-谷氨酸(L-EG2-Glu)．由于寡聚乙二醇鏈段在水溶液中的溶解性具有溫度依賴性,從而在谷氨酸的側(cè)鏈上引入了具有溫度響應(yīng)性的功能基團(tuán)．

棕櫚酸是一種天然的飽和脂肪酸,常以甘油酯的形式普遍存在于動植物的油脂中,棕櫚酸中含有的十六個碳的烴基鏈?zhǔn)蔷哂辛己檬杷阅艿逆湺? 選擇將棕櫚酸作為兩親性多肽結(jié)構(gòu)中的疏水性端基的合成策略具有原料易得且生物相容性較好等優(yōu)點．

基于多肽液相合成方法利用棕櫚酸端位羧基與N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)制備活化酯的方法將其端位活化,具有操作簡單、易于純化并能在偶聯(lián)過程中保持氨基酸原有手性中心活性等特點．該酯化過程中,以DCC為脫水試劑、DMAP作為堿性催化劑,反應(yīng)后經(jīng)多次濃縮、冷卻過濾除去副產(chǎn)物DCU,從而高產(chǎn)率地制備出棕櫚酸端基連接有活化酯的結(jié)構(gòu)(Pal-NHS)．

將合成得到的谷氨酸L-EG2-Glu溶解于NaHCO3的水溶液中,從而使谷氨酸中的羧基保持離子化的水溶性狀態(tài)、游離的氨基保持較強(qiáng)的親核性能．然后在冰水浴中,將上述谷氨酸的水溶液緩慢滴加至溶解有Pal-NHS的THF溶液中,利用氨基與活化酯的特異性反應(yīng),經(jīng)洗滌、干燥后,成功合成得到了以疏水性棕櫚酸烷基為端基、溫敏性二聚乙二醇單甲醚為側(cè)鏈的谷氨酸Pal-EG2-Glu．該產(chǎn)物的1H-NMR(圖5-A)表征結(jié)果表明,在化學(xué)位移1～2的范圍內(nèi)出現(xiàn)棕櫚酸亞甲基的特征峰,同時氨基酸側(cè)鏈中二聚乙二醇單甲醚的亞甲基的吸收峰出現(xiàn)在化學(xué)位移3～4區(qū)域內(nèi),證明通過氨基與活化酯的反應(yīng),可以高效地制備以棕櫚酸為端基、二聚乙二醇單甲醚為側(cè)鏈的谷氨酸衍生物．通過類似的方法,我們進(jìn)一步利用Pal-EG2-Glu端位的羧基,也是先將其制備成活化酯的結(jié)構(gòu),然后與Pal-EG2-Glu在THF/NaHCO3的混合溶劑中反應(yīng)后,最終高產(chǎn)率地制備得到二肽Pal-(EG2-Glu)2．該二肽分子的核磁表征的結(jié)果如圖5-B所示,可以看到,在核磁氫譜的相應(yīng)化學(xué)位移處具有端位棕櫚酸與側(cè)基中乙二醇的亞甲基的相應(yīng)吸收峰,并且相應(yīng)的積分面積也與該分子結(jié)構(gòu)中氫的數(shù)目相對應(yīng),質(zhì)譜的表征結(jié)果也進(jìn)一步確認(rèn)了該二肽分子的結(jié)構(gòu)．

圖5 Pal-EG2-Glu(A)和Pal-(EG2-Glu)2(B)的核磁氫譜

在成功合成得到了側(cè)鏈為二聚乙二醇單甲醚、端基為棕櫚酸烴基鏈的二肽結(jié)構(gòu)以后,對該兩親性分子的溶解行為進(jìn)行了研究．在室溫20℃左右的溫度條件下,二肽分子側(cè)鏈中的二聚乙二醇單甲醚結(jié)構(gòu)具有很好的水溶性,將該二肽分子溶于水后可以形成澄清的透明溶液．通過芘熒光探針方法的研究，表明該兩親性二肽分子在20℃的水溶液中可能是以類似膠束的聚集狀態(tài)存在,其中聚集形貌與聚集機(jī)理將在后續(xù)研究中進(jìn)行．由于谷氨酸側(cè)鏈上的二聚乙二醇單甲醚鏈段的溶解性具有溫度響應(yīng)性,當(dāng)將該二肽水溶液加熱到40℃以上時,氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)變成疏水性的結(jié)構(gòu),從而使該二肽分子由原來具有疏水性端基與親水性側(cè)鏈的兩親性結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)變成完全疏水性的分子結(jié)構(gòu),這也使其從水溶液中沉淀出來．因此，基于該二肽分子的溶解性質(zhì)與溶液自組裝行為,有望將其應(yīng)用于藥物的負(fù)載與溫控釋放的研究中．

3 結(jié)論

通過液相合成的方法,利用氨基與活化酯的反應(yīng),合成得到了以棕櫚酸為端基、二聚乙二醇單甲醚為側(cè)鏈的谷氨酸二肽分子,并對其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了研究．由于該二肽分子中棕櫚酸烴基具有疏水性、二聚乙二醇單甲醚的溶解行為具有溫度響應(yīng)性. 該新型兩親性二肽分子在水溶液中溶解性質(zhì),對于多肽藥物的結(jié)構(gòu)設(shè)計和負(fù)載釋放等方面的研究具有一定的借鑒意義．

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[責(zé)任編輯：蔣海龍]

Synthesis and Characterization of a New Type of Amphiphilic Dipeptide

CHEN Ping, WANG Xiang, ZHI San-jun, WEI Chang-mei

(Jiangsu Key Laboratory for Chemistry of Low-dimensional Materials,School of Chemistry and Chemical Engineering, Huaiyin Normal University, Huaian Jiangsu 223300, China)

Herein, we describe the synthesis and characterization of a new type of amphiphilic dipeptide. The pegylated-L-glutamic acids were prepared by coupling between diethylene glycol monomethyl ether and L-glutamic acid. The N-terminal of the peptide was modified with palmitate via the reaction of amino and active ester. The obtained dipeptide displayed amphiphilic behaviors in water due to the different solubility of terminal alkyl chain and the side methylated ethyleneglycols.

peptide synthesis in liquid phase; amphiphilic dipeptide; glutamic acid

2016-10-09

國家自然科學(xué)基金資助項目(51403073)

陳平(1983-),男,講師,博士,主要從事功能高分子材料的合成與性能研究． E-mail: chenping@iccas.ac.cn

O629.7

A

1671-6876(2017)01-0023-05