張小燕，任 毅，何延淼，胡碧煌，劉中強(qiáng)

(熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院，海南 ?？?570228)

環(huán)二肽(cyclodipeptide)含有一個(gè)2，5-二酮哌嗪(2,5-diketopiperazines)六元環(huán)結(jié)構(gòu)；它廣泛分布于多種生物體內(nèi)，在細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物(包括人)中均有發(fā)現(xiàn).許多環(huán)二肽表現(xiàn)出良好的生物活性，例如抗病毒、抗細(xì)菌、抗腫瘤、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用[1-3].氧化應(yīng)激(oxidative stress) 可以導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷，引起炎癥性腸病、早衰和癌癥等疾病[4].2008年，Minelli等指出：cyclo(His-Pro)對(duì)血清缺乏下的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系(PC12)具有保護(hù)作用，可以阻止由自由基氧化、鈣離子移動(dòng)和創(chuàng)傷所引起的神經(jīng)元死亡[5].

左旋多巴(L-3,4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)是一種天然存在的稀有氨基酸；在生物體內(nèi)一般由酪氨酸在酪氨酸羥化酶作用下轉(zhuǎn)化而來[6].類似于丹參素和兒茶素等多酚類物質(zhì)，左旋多巴分子中包含一個(gè)兒茶酚基團(tuán)，因此左旋多巴及其衍生物具有一定的抗氧化活性[7]，例如，Manchineella等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，含多巴環(huán)二肽cyclo(DOPA-DOPA)與cyclo(DOPA-Phe)不僅具有良好的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除活性，而且安全性好，在實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)PC12細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性[8].

含多巴環(huán)二肽的經(jīng)典制備方法是：以酸催化并在高沸點(diǎn)醇中加熱回流的方式促進(jìn)含多巴直鏈二肽發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)[9-12]，例如cyclo(DOPA-Gly)與cyclo(DOPA-Phe)的化學(xué)合成[8].該方法一般不適用于含活潑側(cè)鏈的氨基酸，因?yàn)槎鄶?shù)側(cè)鏈保護(hù)基難以承受劇烈的高溫和酸性條件.2008年，張崇敬等采用固相吸附加微波輻射的方法來制備脯氨酸與多巴形成的環(huán)二肽，結(jié)果由于高溫(>200 ℃)引起了氨基酸嚴(yán)重消旋，雖采用液相色譜分離得到一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體cyclo(L-DOPA-L-Pro) (1) (圖 1.)和cyclo(L-DOPA-D-Pro) (1’)[13]，但卻難以排除非手性柱無法區(qū)分的旋光對(duì)映異構(gòu)體的存在.最近，任毅等提出了采用縮丙酮保護(hù)多巴的兒茶酚基團(tuán)，液相法合成N-Fmoc保護(hù)的直鏈二肽甲酯，然后在常溫下以哌啶脫去Fmoc保護(hù)并催化分子內(nèi)縮合來制備含多巴環(huán)二肽的方法[14].該方法有效避免了高溫條件，所制得的保護(hù)狀態(tài)的環(huán)二肽中間產(chǎn)物在常溫下非常穩(wěn)定，有利于儲(chǔ)存，而且其又可以在95%的三氟乙酸(TFA)溶液中快速高效地轉(zhuǎn)化成脫保護(hù)的環(huán)二肽，方便使用.

圖1 左旋多巴與L/D-谷氨酸、L/D-脯氨酸形成的環(huán)二肽

本文首次在常溫下以弱堿為催化劑，通過不引起氨基酸消旋的化學(xué)反應(yīng)制備了光學(xué)純的環(huán)二肽cyclo(L-DOPA-L-Pro)(1)，并第一次合成了左旋多巴與L-或D-谷氨酸形成的一對(duì)環(huán)二肽非對(duì)映異構(gòu)體.另外，采用DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，以丹參素為對(duì)照，首次研究了這三種環(huán)二肽的抗氧化活性.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器Fmoc-DOPA(Acetonide)-OH和H-DOPA(Acetonide)-OMe，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道由實(shí)驗(yàn)室合成[15-16]；L-脯氨酸甲酯鹽酸鹽(H-Pro-OMe·HCl)、L-谷氨酸甲酯鹽酸鹽(H-Glu(OtBu)-OMe·HCl)和芴甲氧羰基-D-谷氨酸-5-叔丁酯(Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH)，購自吉爾生化；DPPH和其他相關(guān)試劑都購自阿拉丁或麥克林等公司.使用的儀器包括：Waters 2695-2998高效液相色譜儀、Bruker 400 MH超導(dǎo)核磁共振儀、LCMS-IT-TOF高分辨液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀、BUCHI(R-210)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、HERMLE 2326K高速冷凍離心機(jī)、FD-1C-50凍干機(jī)和BioTekGen5TM酶標(biāo)儀.

1.2 合成途徑A. 左旋多巴在N-端的直鏈二肽的合成及其環(huán)化反應(yīng)路線(圖2)

圖2 左旋多巴在N-端的直鏈二肽的合成及其環(huán)化反應(yīng)路線

1.2.1 Cyclo(L-DOPA-L-Pro)的合成

(1) Fmoc-DOPA(Acetonide)-Pro-OMe (1a) 的合成 將4.59 g(10 mmol) Fmoc-DOPA(Acetonide)-OH，2.27 g(11 mmol) 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)， 2.3 g(20 mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(HOSU)和100 mL二氯甲烷(DCM)加入到250 mL圓底燒瓶中，室溫下反應(yīng)1小時(shí)后，再加入1.65 g(10 mmol) H-Pro-OMe·HCl和3.42 mL(20 mmol) N,N-二異丙基乙胺(DIEA)，然后室溫下繼續(xù)攪拌24 h.過濾掉不溶性白色固體，濾液采用飽和食鹽水和蒸餾水各洗兩遍，然后用無水硫酸鎂(MgSO4)干燥4 h.濾掉MgSO4，濾液濃縮后采用柱層析法分離，接著用正己烷/DCM/乙酸乙酯(EtOAc)按極性由小到大梯度洗脫，得直鏈二肽1a 4.57 g，產(chǎn)率80%.HR-MS(ESI) m/z: Calcd for C33H34N2O7{[M+H]+} 571.243 9, Found: 571.244 5.

(2) Cyclo[DOPA(Acetonide)-Pro] (1b) 的合成 取一個(gè)100 mL的單口圓底燒瓶，加入一個(gè)攪拌子、15 mL乙腈和5 mL哌啶.稱取2 g(3.5 mmol) 1a溶于10 mL 乙腈中并置入一10 mL注射器內(nèi)，配制10 mL哌啶/乙腈(1:1)溶液并置入另一10 mL注射器內(nèi).把兩個(gè)注射器固定在微量進(jìn)樣器上，以相同的速度(1 mL/h)緩慢滴入上述燒瓶中.加樣后，室溫下繼續(xù)攪拌并使其反應(yīng)12 h.采用柱層析法分離純化，以正己烷/DCM/EtOAc按極性從小到大梯度洗脫.產(chǎn)物分離完成后，將所得濾液濃縮至少量，用石油醚沉淀出不溶性白色固體，離心5 min(4 ℃, 8000 r/min)，倒掉上清液，放入真空干燥箱中干燥48 h，得到白色固體1b 0.86 g, 產(chǎn)率78%.1HNMR(400 M Hz, DMSO-d6):δ7.86(s, 1H), 6.76 (s, 1H), 6.692 (s, 1H), 6.690(s, 1H), 4.27(t,J=5.2 Hz, 1H), 4.07(t,J=8.1 Hz 1H), 3.42(m, 1H), 3.28(m, 2H), 2.99(dd,J=14.2, 5.1 Hz, 1H), 2.90(dd,J=14.2, 5.2 Hz, 1H), 2.05(m, 2H), 1.74(m, 2H), 1.60(s, 6H), 1.49(m, 2H).13C NMRδ:169.03, 165.08, 146.54, 145.36, 130.15, 122.29(CH), 117.47, 109.84(CH), 107.54(CH), 58.37(CH), 55.91(CH), 44.55(CH2), 35.03(CH2), 27.72(CH2), 25.46(CH3), 21.90(CH2). HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C17H20N2O4{[M+H]+} 317.149 6, Found 317.150 3.

(3)Cyclo(L-DOPA-L-Pro) (1) 的合成 將100 mg(0.32 mmol) 1b加入到3 mL的脫保護(hù)液(TFA: TIS(三異丙基硅烷)∶H2O的體積比為95∶2.5∶2.5)中，攪拌兩小時(shí).反應(yīng)完成后濃縮至少量液體，加入冰乙醚沉淀得白色絮狀沉淀，離心5 min(4 ℃, 8000 r/min)，倒掉上清液后得到白色固體沉淀，將其放入真空干燥箱中干燥4 h，加入5 mL冰乙酸冷凍成冰后放入凍干機(jī)凍干48 h，得蓬松白色固體狀環(huán)二肽1 80.35 mg, 產(chǎn)率92%.1H (400 M Hz, DMSO-d6):δ7.71(s, 1H), 6.64(s, 1H), 6.58(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.48(d,J=8.0 Hz, 1H), 4.20(t,J=5.2 Hz, 1H), 4.06(t,J=8.3 Hz, 1H), 3.44(m, 1H), 3.27(m, 1H), 2.89(dd,J=14.2, 4.9 Hz, 1H), 2.81(dd,J=14.2, 5.2 Hz, 1H), 2.00(m, 2H), 1.73(m, 2H), 1.46(m, 2H).13C NMRδ: 168.91, 165.23, 145.23, 144.23, 127.59, 120.43(CH), 117.60(CH), 115.57(CH), 58.43(CH), 55.95(CH), 44.58(CH2), 34.88(CH2), 27.81(CH2), 21.91(CH2). HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H16N2O4{[M+H]+} 277.118 3, Found: 277.118 9.

1.2.2 Cyclo(L-DOPA-L-Glu)的合成采用類似于圖2的合成路線，首先Fmoc-DOPA(Acetonide)-OH與H-L-Glu(OtBu)-OMe縮合成L-DOPA在N-端的直鏈二肽衍生物，然后經(jīng)25%哌啶催化環(huán)化和在95% TFA中脫去保護(hù)基.

(1)Fmoc-DOPA(Acetonide)-L-Glu(OtBu)-OMe (2a) 的合成 將1.15 g(2.5 mmol) Fmoc-DOPA(Acetonide)-OH、0.95 g(2.5 mmol) HBTU、0.63 g(2.5 mmol) H-Glu(OtBu)-OMe·HCl、0.83 mL(5 mmol) DIEA和100 mL DMF加入圓底燒瓶中，在室溫下攪拌24 h.采用高真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮反應(yīng)液至少量，加入飽和NaHCO3水溶液，以乙酸乙酯萃取.然后，用無水Na2SO4將有機(jī)相干燥3 h，過濾除去Na2SO4，旋蒸除去溶劑，過濾，得到直鏈二肽2a 1.24 g，產(chǎn)率75%.HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C37H42N2O9{[M+H]+} 659.296 3, Found 659.299 3.

(2)Cyclo[DOPA(Acetonide)-L-Glu(OtBu)] (2b) 的合成 將0.66 g(1 mmol)直鏈二肽Fmoc-DOPA(Acetonide)-Glu(OtBu)-Ome加入到10 mL 的25%哌啶/乙腈溶液中，攪拌24 h.將所得懸濁液旋蒸濃縮，用乙醚沉淀，離心5 min (4 ℃, 8000 r/min)，并洗滌5次，得白色固體2b 0.27 g, 產(chǎn)率68%.1HNMR (400 M Hz, DMSO-d6)δ: 8.18(s, 1H), 8.10(s, 1H), 6.68(d,J=7.8 Hz, 1H), 6.59 (d,J=1.6 Hz, 1H) 6.55(dd,J=7.8,J=1.6 Hz, 1H), 4.13(m, 1H), 3.71(t,J=5.5 Hz 1H), 3.17(d,J=3.4 Hz, 2H), 3.05(dd,J=13.6, 3.5 Hz, 1H), 2.73(dd,J=13.6, 4.8 Hz, 1H), 1.68(m, 2H), 1.59(s, 6H), 1.36(s, 9H).13C NMRδ:171.57, 166.36, 166.17, 146.60, 145.79, 128.79, 122.76(CH), 117.58, 110.37(CH), 107.62(CH), 79.50, 55.32(CH), 53.02(CH), 37.61(CH2), 29.65(CH2), 28.74(CH2), 27.73(CH3), 25.51(CH3). HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C21H28N2O6{[M+H]+} 405.202 0, Found 405.231 3.

(3)Cyclo(L-DOPA-L-Glu) (2) 的合成 環(huán)二肽2的合成方法與1的類似，取0.40 g (1 mmol) 2b，在12 mL 的TFA/TIS/ H2O(95∶2.5∶2.5)脫保護(hù)液中反應(yīng)，得到環(huán)二肽2 0.3 g，產(chǎn)率96%.1H NMR (400 M Hz, DMSO-d6+CD3COOD):δ8.08(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.03(d,J=2.4 Hz, 1H)，6.59(d,J=8.0, 1H), 6.55(d,J=2.0 Hz, 1H), 6.40(dd,J=8.0,J=2.0 Hz, 1H), 4.03(t,J=5.3 Hz, 1H), 3.70(t,J=5.7 Hz, 1H), 2.91(dd,J=13.7, 4.4 Hz, 1H), 2.68(dd,J1=13.7, 4.8 Hz, 1H), 1.91(m, 2H), 1.37～1.20(m, 2H).13C NMRδ: 173.97, 166.85, 166.73, 144.89, 144.20, 126.72, 120.93(CH), 117.66(CH), 115.13(CH), 55.59(CH), 53.09(CH), 37.81(CH2), 28.93(CH2), 28.81(CH2). HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H16N2O6{[M-H]-} 307.093 6, Found 307.093 7.

B. 左旋多巴在C-端的直鏈二肽的合成及其環(huán)化反應(yīng)路線(圖3)

圖3 左旋多巴在C-端的直鏈二肽的合成及其環(huán)化反應(yīng)路線

1.2.3 Cyclo(L-DOPA-D-Glu)(3)的合成

(1)Fmoc-D-Glu(OtBu)-DOPA(Acetonide)-OMe (3a) 的合成 將0.72 g(2.5 mmol) H-DOPA(Acetonide)-OMe·HCl、0.95 g(2.5 mmol) HBTU、1.06 g(2.5 mmol) Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH、0.83 mL (5 mmol) DIEA和100mL DMF加入圓底燒瓶中，在室溫下攪拌反應(yīng)24 h.采用高真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮反應(yīng)液至少量，加入飽和NaHCO3水溶液，以乙酸乙酯萃取.然后，用無水Na2SO4將有機(jī)相干燥3 h，過濾除去Na2SO4，旋蒸除去溶劑，過濾，得到直鏈二肽3a 1.2 g，產(chǎn)率75%.HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C37H42N2O9{[M+H]+} 681.278 3，F(xiàn)ound 681.275 4.

(2) Cyclo[DOPA(Acetonide)-D-Glu(OtBu)] (3b) 的合成 化合物3b的合成方法與化合物2b的類似，最終得3b 0.23 g，產(chǎn)率56%.1H NMR (400 M Hz, DMSO-d6):δ8.10(d,J=2.3 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 6.70(d,J=7.8 Hz, 1H), 6.61(d,J=1.6 Hz, 1H), 6.58(dd,J=7.8,J=1.6 Hz, 1H), 4.05(m, 1H), 3.20(t,J=5.2 Hz, 1H), 2.98(dd,J1=13.6, 4.6 Hz, 1H), 2.78(dd,J1=13.7, 4.8 Hz, 1H), 2.16 (m, 2H), 1.78(m, 2H), 1.60(s, 6H), 1.37(s, 9H).13C NMRδ: 171.52, 167.41, 167.26, 146.54, 145.67, 128.91, 122.61(CH), 117.60, 110.02(CH), 107.73(CH), 79.66, 55.48(CH), 52.41(CH), 38.04(CH2), 30.01(CH2), 27.69(CH3), 27.53(CH) 25.40(CH3). HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C21H28N2O6{[M+H]+}427.184 0, Found 427.180 1.

(3) Cyclo(L-DOPA-D-Glu) (3) 的合成 環(huán)二肽3的合成方法與1的類似，取0.41 g(1 mmol) 3b, 在12 mL 的TFA/TIS/ H2O(95∶2.5∶2.5)脫保護(hù)液中反應(yīng)，得環(huán)二肽3 0.27 g，產(chǎn)率89%.1H NMR (400 M Hz, DMSO-d6+CD3COOD):δ8.08(d,J=2.5 Hz, 1H), 7.98(s, 1H), 6.60(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.56(d,J=2.0 Hz, 1H), 6.40(dd,J1=8.0,J2=2.0 Hz, 1H), 3.99(s, 1H), 3.08(t,J=5.0 Hz, 1H), 2.91(dd,J1=13.7, 4.3 Hz, 1H), 2.68(dd,J1=13.7, 4.8 Hz, 1H), 2.19(m, 1H), 2.09(m, 1H), 1.77(m, 2H).13C NMRδ: 173.97, 167.80, 167.32, 144.87, 144.12, 126.55, 120.90(CH), 117.61(CH), 115.32(CH), 55.84(CH), 52.34(CH), 38.15(CH2), 28.85(CH2), 27.20(CH2). HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H16N2O6{[M-H]-} 307.093 6, Found 307.093 8.

1.3 DPPH自由基清除活性測定DPPH自由基清除活性測定參考了Manchineella、Furukawa[2,17]和何延淼[18]的方法，并做了略微修改.

(1)DPPH自由基清除測試溶液的配制 DPPH溶液的配制：將5.91 mg(15 μmol)的DPPH加入到10 mL無水乙醇中，超聲10 min，使其充分溶解，制成濃度為1.5 mmol·L-1的DPPH母液，備用.取母液1 mL，用無水乙醇稀釋至0.15 mmol·L-1，用微孔濾膜(0.22 μm) 過濾備用，避光保存，在3.5 h內(nèi)用完.待測樣品溶液的配制：將待測樣品用超純水或二甲基亞砜(DMSO)充分溶解，用無水甲醇稀釋成濃度為300、240、180、120、60 μmol·L-1的溶液，用微孔濾膜(0.22 μm) 過濾，備用.

(2)DPPH自由基清除活性的測定方法 以丹參素為陽性對(duì)照，取100 μL不同濃度的待測樣品或陽性對(duì)照溶液于96孔板中，各加入200 μL的DPPH(0.15 mmol·L-1)溶液，避光靜置反應(yīng)30 min后，在酶標(biāo)儀515 nm處測定吸光度值OD1；取樣品溶劑100 μL，加入200 μL 的DPPH(0.15 mmol·L-1)溶液，測得的吸光度為OD0，取200 μL無水乙醇溶液代替DPPH為空白組，測得的吸光度為OD2；每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值.按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率= [1-(OD1-OD2)/OD0]×100%；計(jì)算IC50，IC50的計(jì)算是通過軟件GraphPad Prism 6的Log(agonist)vs.response—Variable slope(four parameters)方法求出.

2 結(jié)果與討論

2.1 三種含多巴環(huán)二肽的合成在20種常見氨基酸中，脯氨酸是唯一以剛性五元環(huán)作側(cè)鏈的仲胺氨基酸，其α-氨基的反應(yīng)活性比相應(yīng)的伯胺基要弱，因此脯氨酸氨基端肽鍵的形成最好發(fā)生在合成直鏈二肽的反應(yīng)中，而不是發(fā)生在進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)時(shí)，以避免后者反應(yīng)困難或不進(jìn)行.在常見碳二亞胺型縮合劑DCC作用下，F(xiàn)moc-DOPA(acetonide)-OH與H-Pro-OMe·HCl 反應(yīng)成功合成了L-DOPA在N-端的直鏈二肽衍生物1a：HR-MS m/z Calcd for C33H34N2O7{[M+H]+} 571.243 9, Found 571.244 5.在有機(jī)堿哌啶作用下，N-Fmoc經(jīng)β-消除快速脫去，新產(chǎn)生的α-伯胺基與直鏈二肽另一端的活潑甲酯發(fā)生分子內(nèi)胺酯交換反應(yīng)形成熱力學(xué)上更穩(wěn)定的環(huán)二肽結(jié)構(gòu)1b：HR-MS(ESI)m/zCalcd for C17H20N2O4{[M+H]+} 317.149 6, Found 317.150 3.采用縮丙酮保護(hù)L-DOPA的側(cè)鏈，有效避免了其兒茶酚基團(tuán)在堿性條件下的氧化交聯(lián)等多種副反應(yīng)，使得在DIEA堿性條件下的直鏈二肽合成和在哌啶堿性條件下的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)可以順利進(jìn)行.化合物1b在95% TFA溶液中快速(2h)高效地脫去縮丙酮保護(hù)而轉(zhuǎn)化成目標(biāo)環(huán)二肽1.本文采集了該環(huán)二肽的NMR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道的、經(jīng)液相色譜純化后的環(huán)二肽1的數(shù)據(jù)吻合很好，表明本方法避免了分離結(jié)構(gòu)相似的旋光對(duì)映體或非對(duì)映體雜質(zhì).

谷氨酸是一種常見的、側(cè)鏈帶負(fù)電荷的氨基酸；其L-和D-型旋光異構(gòu)體可分別與L-DOPA反應(yīng)而形成一對(duì)環(huán)二肽非對(duì)映異構(gòu)體.采用上述合成路線，F(xiàn)moc-DOPA(Acetonide)-OH 與購買的叔丁酯保護(hù)的谷氨酸衍生物H-L-Glu(OtBu)-OtBu反應(yīng)，經(jīng)三步反應(yīng)制備了環(huán)二肽cyclo(L-DOPA-L-Glu).由于D-型谷氨酸叔丁酯衍生物價(jià)格貴且難以購買到，環(huán)二肽cyclo(L-DOPA-D-Glu)的制備采用了另一種合成策略(圖3)：以可購買到的Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH中間體與實(shí)驗(yàn)室合成的多巴甲酯衍生物H-DOPA(Acetonide)-OMe反應(yīng)，制備了多巴在C-端的直鏈二肽甲酯3a：HR-MS(ESI) m/z Calcd for C37H42N2O9{[M+H]+} 681.278 3，F(xiàn)ound 681.275 4.同樣，經(jīng)哌啶催化環(huán)化，然后在TFA中脫去縮丙酮保護(hù)，獲得了目標(biāo)環(huán)二肽cyclo(L-DOPA-D-Glu).環(huán)二肽2由兩種L-型氨基酸構(gòu)成，其氨基酸殘基側(cè)鏈處于二酮哌嗪六元環(huán)的同一面(順式結(jié)構(gòu))；環(huán)二肽3由手性不同的L-DOPA和D-Glu構(gòu)成，其殘基側(cè)鏈分處于二酮哌嗪環(huán)的不同面(反式結(jié)構(gòu))；因此環(huán)二肽3的兩個(gè)側(cè)基相隔更遠(yuǎn)，不易產(chǎn)生空間阻礙效應(yīng)，導(dǎo)致其哌嗪環(huán)結(jié)構(gòu)要比環(huán)二肽2的結(jié)構(gòu)在熱力學(xué)上更穩(wěn)定.

比較3對(duì)非對(duì)映異構(gòu)環(huán)二肽的核磁數(shù)據(jù)(表1)發(fā)現(xiàn)，L-DOPA殘基上X-H和X-C的化學(xué)位移分別保持在一個(gè)小范圍內(nèi)變動(dòng)，3.86×10-6～4.21×10-6和5.532×10-5～5.727×10-5.順式環(huán)二肽的X-H化學(xué)位移一般都大于相應(yīng)反式環(huán)二肽的值，暗示反式結(jié)構(gòu)降低了X-H的去電子屏蔽效應(yīng)；X-C的情況則相反，順式環(huán)二肽的X-C化學(xué)位移一般小于相應(yīng)反式環(huán)二肽的.這表明，環(huán)二肽的另一個(gè)氨基酸對(duì)L-DOPA殘基的性質(zhì)可以產(chǎn)生一定的影響，但程度不是很大.

對(duì)于環(huán)二肽的Y位點(diǎn)而言，不同環(huán)二肽的Y-H化學(xué)位移差別明顯，范圍在2.92～4.06 ppm之間；順式環(huán)二肽Y-H的化學(xué)位移一般都大于反式環(huán)二肽的，且差別較大(5.2×10-7～1.12×10-6).順式環(huán)二肽1的Y-C化學(xué)位移遠(yuǎn)大于反式環(huán)二肽1′的位移，差值約為4.05×10-6；然而，順式環(huán)二肽2和2b的Y-C化學(xué)位移卻小于相應(yīng)的反式環(huán)二肽3和3b的化學(xué)位移，雖然差值只有6.1×10-5～7.5×10-5.這表明環(huán)二肽Y位點(diǎn)的化學(xué)位移受其所在氨基酸殘基側(cè)鏈的性質(zhì)影響較大；另外，L-DOPA與D-Glu成反式結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了Y-H上電子屏蔽效應(yīng)增強(qiáng)，這可能歸因于兒茶酚的芳香性.

表1 三對(duì)環(huán)二肽非對(duì)映異構(gòu)體的核磁數(shù)據(jù)對(duì)比 ×10-6

2.2 含左旋多巴環(huán)二肽L-Glu、D-Glu、L-Pro的自由基清除活性以常見抗氧化劑丹參素為對(duì)照，DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)(圖 1)表明：含多巴環(huán)二肽1, 2, 3都具有一定的抗氧化能力，但都不如L-DOPA；這暗示含多巴環(huán)二肽的自由基清除能力主要來自于其側(cè)鏈的兒茶酚基團(tuán)，而且環(huán)二肽的哌嗪環(huán)并不能提高其自由基清除能力.在被測試的3種環(huán)二肽中，環(huán)二肽2的清除能力最強(qiáng)，其IC50(18.9 μmol·L-1)值低于Vc(32.8 μmol·L-1)和丹參素(22.5 μmol·L-1)；另外，環(huán)二肽2的自由基清除能力高于與其結(jié)構(gòu)非常類似的非對(duì)映異構(gòu)體環(huán)二肽3，暗示順式結(jié)構(gòu)有利于兒茶酚捕獲DPPH自由基.

100806040200DPPHremaining/%L-GluL-ProD-GluDanshensu020406080100Sampleconcentration圖4 不同濃度含多巴環(huán)二肽L-Glu、D-Glu、L-Pro的自由基清除率表2 含左旋多巴環(huán)二肽L-Glu、D-Glu、L-Pro的DPPH· 清除活性(X±S)化合物IC50/(μmol·L-1)丹參素22.5±1.63L-Glu118.9±2.47L-Pro33.7±3.29D-Glu49.7±7.59表中氨基酸表示Cyclo(L-DOPA-AA)中的氨基酸殘基

3 結(jié) 論

采用縮丙酮保護(hù)L-DOPA的兒茶酚基，成功地避免了L-DOPA在堿性環(huán)境下的氧化交聯(lián)問題，減少了在制備含多巴直鏈二肽的反應(yīng)中副產(chǎn)物的生成，簡化了中間產(chǎn)物的分離和純化，提高了目標(biāo)直鏈二肽的收率和純度.其次，縮丙酮保護(hù)在堿性條件下非常穩(wěn)定，從而可以讓含多巴的直鏈二肽于常溫下和在哌啶催化下穩(wěn)定地進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，有效避開了高溫加熱環(huán)化的不利條件，非常適合用于制備L-DOPA與含活潑側(cè)鏈氨基酸組成的環(huán)二肽.縮丙酮保護(hù)的環(huán)二肽不僅性質(zhì)穩(wěn)定和易于保存，且使用方便.含多巴的環(huán)二肽具有一定的抗氧化活性，其中，由L-DOPA于L-Glu構(gòu)成的順式環(huán)二肽的活性最好，高于其反式對(duì)映異構(gòu)體.