范曉光，洪翔，朱新雅，張成林，陳寧

（1.代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津300457；3.天津科技大學生物工程學院，天津300457）

二肽的生物合成及應用研究進展

范曉光1,2,3，洪翔1,2,3，朱新雅1,2,3，張成林1,2,3，陳寧1,2,3

（1.代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津300457；3.天津科技大學生物工程學院，天津300457）

二肽是由兩個氨基酸組成的最簡單的肽，但與蛋白質和氨基酸相比，由于缺少有效的制備方法，許多二肽的生理功能尚不清楚。目前，只有少數二肽實現了商業(yè)化，如阿斯巴甜（L-天門冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯）以及丙谷二肽（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）等。近年來，隨著微生物體內一些非依賴于核糖體系統(tǒng)的二肽合成途徑的發(fā)現，使得人們開始利用酶轉化或發(fā)酵的方法制備不同種類的二肽。因此，對一些商品化二肽的功能和應用、二肽的現有制備方法以及生物合成二肽的技術和新思路進行綜述。

二肽；生理功能；制備方法；生物合成

二肽是由一分子氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脫水縮合形成的酰胺鍵（即—CO—NH—）組成的蛋白質片段或物質。二肽分子中一般包含一個肽鍵，特殊的二肽如環(huán)二肽則可以存在兩個肽鍵。近年來，隨著一些商品化二肽產品如阿斯巴甜（L-天門冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯）以及丙谷二肽（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）在食品和醫(yī)藥行業(yè)中的廣泛應用，人們對于二肽的營養(yǎng)與功能越發(fā)關注。但與此同時，由于缺乏合理有效的制備方法，許多二肽產品的開發(fā)和應用研究停滯不前。筆者將結合現有的研究報道，對一些商品化二肽的功能和應用、二肽的現有制備方法以及生物合成二肽的技術和新思路進行綜述。

1 二肽的功能和應用

二肽在生物體內會被分解為氨基酸，因此二肽具有相應氨基酸的功能，但其物化性質卻不同于相應氨基酸[1]。例如，谷氨酰胺是人體所需的重要氨基酸，但熱穩(wěn)定性較差，而丙氨酰-谷氨酰胺的熱穩(wěn)定較高；酪氨酸幾乎不溶于水，但丙氨酰-酪氨酸在水中的溶解度可達到14 g/L。有意思的是，一些二肽要比其兩種相應氨基酸的溶解性更好，例如丙氨酸和谷氨酰胺在水中的溶解度分別為89 g/L和36 g/L，而丙氨酰-谷氨酰胺的溶解度則可達到586 g/L?；谏鲜鲂再|，這類二肽如Ala-Gln和Gly-Tyr常作為注射液的主要營養(yǎng)組成成分應用于患者的術后恢復[2]。除了物化性質改變以外，一些二肽本身還具有氨基酸所不具備的特殊生理功能。肌肽，又名β-丙氨酰-L-組氨酸，是由β-丙氨酸和L-組氨酸構成的二肽化合物，廣泛存在于肌肉細胞和腦部組織細胞。研究結果表明肌肽在細胞內具有一定的抗氧化能力，可清除在氧化應激過程中脂肪酸過度氧化形成的活性氧自由基（ROS）以及α，β不飽和醛[3]。鵝肌肽是由β-丙氨酸和甲基-L-組氨酸構成的一種水溶性二肽化合物，廣泛存在于脊椎動物的骨骼肌組織和腦組織中，在酸性條件下（pH＜3.0）能夠穩(wěn)定存在。鵝肌肽與肌肽在結構和生物學功能上相近，在食品工業(yè)中已用作天然的抗氧化劑，在醫(yī)藥領域作為抗氧化和抗衰老保健品使用[4]。阿斯巴甜（L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯）是為數不多的具有甜味的二肽類衍生物，甜度是蔗糖的200倍左右，比蔗糖所含熱量少。使人感到甜味所需的阿斯巴甜用量非常少，以至于可忽略其所含的熱量，所以阿斯巴甜被廣泛用作蔗糖的替代品[5]。目前，世界上有超過90個國家批準使用阿斯巴甜作為食品添加劑。此外，存在于魚肉、海藻或蘑菇水解液或提取物中的二肽（如Ile-Tyr，Lys-Trp，Val-Tyr，Ile-Trp）由于能夠抑制人體內血管緊張素轉化酶（ACE）的活性，發(fā)揮抗高血壓的功效，在日本已批準作為特殊的營養(yǎng)保健品使用[6]。

2 二肽的現有制備方法

目前，二肽常用的制備方法包括天然提取法、化學合成法及化學-酶轉化法。其中化學合成法和化學-酶轉化法是制備二肽的經典方法，也是目前商品化二肽的主要生產方法。而天然提取法由于原料來源有限，植源性或動物源性的肽類化合物種類繁多，含量有限，不具備經濟優(yōu)勢和大規(guī)模生產的可行性。

2.1 化學合成法

化學合成法是利用氨基酸作為原料，通過化學方法人工構建肽鍵制備二肽的方法，主要包括以下步驟[7]：1）保護除了肽鍵所需的官能團以外的其他所有的活性官能團；2）激活保護的氨基酸中游離的羧基；3）將激活的氨基酸與另一種已保護的氨基酸連接；4）去除二肽中所有的保護基團?；瘜W合成法的優(yōu)勢在于通過選擇合適的保護基團和激活劑能夠合成多種二肽，且反應得率較高。同時，根據已知二肽的性質和功能，通過改變氨基酸上連接的結構，可以合成出天然無法獲取的具有特殊結構的二肽，從而開發(fā)出特殊用途的藥物及功能食品。因此，化學合成法是制備商品化二肽的主要方法?；瘜W合成法的不足在于反應步驟及反應試劑較多導致的反應成本過高。同時，反應產物易于消旋化，副反應較多，有毒試劑的使用也會對人體造成潛在的危害。

2.2 化學-酶轉化法

該方法運用蛋白酶和酯酶催化逆反應連接氨基酸，與化學法相比具有更專一的立體選擇性，反應條件更溫和?，F已知兩種反應機制：熱力學控制和動力學控制的過程（圖1）。熱力學控制過程基于蛋白酶和酯酶的逆反應過程，在生理條件下酶反應更偏向于水解方向。為推動反應向肽鍵形成方向進行，可以利用產物沉淀，底物過量或者在兩相條件下將產物從水相轉移至另一不溶相中等方法促進合成反應[8-9]。動力學控制過程取決于適當活化的羧基端酯（或酰胺）迅速?；粋€絲氨酸或者半胱氨酸蛋白酶。?；钢虚g體經歷了一個限速脫酰基反應，它發(fā)生在水與另一種親核試劑的競爭中，該過程可以短暫積累產物。該機制下，二肽的產率取決于水和親核試劑對?；傅墓羲俣群投牡乃馑俣?，所以酶自身和反應條件如pH，離子強度和親核試劑濃度都很重要[10-11]。

3 二肽的生物合成

生物體中多數的肽鍵合成反應是在細胞中核糖體的指導下進行的。但近年來，研究者們相繼發(fā)現了一些非依賴于核糖體系統(tǒng)的肽鍵合成反應。這些反應所涉及到的酶包括：非核糖體肽合成酶（NRPS）[12]、聚谷氨酰胺合成酶[13]、藻青素合成酶[14]、谷胱甘肽合成酶[15]、L-氨基酸-α-連接酶（Lal）[16]等。上述酶催化合成的次級代謝產物往往是細胞組分形成或者細胞生長所必須的。其中NRPS和Lal的發(fā)現使得生物法制備二肽成為可能。

3.1 利用NRPS合成二肽

NRPS是一個很大的酶系，分子量達到了100～1 700 kDa。它由很多個具有獨立催化能力的模塊構成，每個模塊含有一系列結構域用來把一個氨基酸作為底物結合到新生肽鏈上[17]。腺苷酰化結構域（A位點）負責識別氨基酸的類別并且通過腺苷?；饔脤⑵浠罨?，這是一個需要消耗ATP的過程。活化過的氨基酸隨后被轉移到肽載體蛋白（PCP）上，PCP作為中介再將被活化的氨基酸轉移到縮合結構域（C位點），氨基酸在此脫水縮合成肽。最后經硫酯結構域（Te位點）把合成的肽鏈從NRPS上釋放出去（圖2）。圖2中閉合菱形和三角形代表兩種不同氨基酸。A domain:腺苷?；Y構域；PCP domain：肽載體蛋白；C domain：縮合結構域；Te domain：硫酯結構域；A，PCP和C結構域共同組成一個模塊。

NRPS系統(tǒng)已經成功地應用到二肽的合成中。Doeckel和Marahiel通過連接部分bac基因（在地衣芽孢桿菌中編碼桿菌肽素生物合成的NRPS）和tyc基因（在短芽孢桿菌中編碼短桿菌酪肽生物合成的NRPS），設計了二肽合成的生物模板[18]。其中第一個A區(qū)域BacA1，能夠識別并激活異亮氨酸，將其跟TycC包含的C-PCP-A2（識別并激活亮氨酸）區(qū)域融合在一起，并通過4-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶在大腸桿菌中成功表達了人工合成的NRPS全酶。將此酶純化后與異亮氨酸、亮氨酸和ATP混合形成了異亮氨酸-亮氨酸二肽。他們利用同樣的策略完成了苯丙氨酸-亮氨酸和異亮氨酸-苯丙氨酸的生物合成。

盡管人們已經能夠通過人工構建的NRPS全酶催化合成所需的二肽，但是仍有一些問題需要克服。第一個問題是C區(qū)域的選擇性，這對于控制二肽合成的順序至關重要；第二個問題是人工合成的NRPS的活力不夠，使得二肽的產率較低。

3.2 利用Lal合成二肽

Lal屬于ATP依賴型的羧酸鹽-胺/硫醇連接酶超家族，使用?；?磷酸鹽作為活性中間體，如圖3所示。該酶可以以無活性基團保護的氨基酸為底物合成二肽，其反應伴隨著ATP到ADP的去磷酸化過程，但是不能催化合成三肽或更長的肽鏈。

第一個報道的Lal來源于Bacillus subtilis 168（ATCC 23857），由ywfE基因編碼，負責催化L-Ala和抗莢膜菌素（L-anticapsin）形成二肽類抗生素芽孢桿菌溶素（bacilysin）[19]（圖4）。晶體結構分析表明[20-21]：該酶N-末端的底物選擇性較為嚴格，只能接受小分子酸性氨基酸（如L-Ala），而其C-末端的底物選擇性相對寬泛，可以接受許多疏水性氨基酸如L-Phe和L-Met等，同時該酶不能識別D型氨基酸。隨后，大約20種不同的Lal相繼被發(fā)現，其對各種氨基酸的親和力也有所不同。例如，Bacillus subtilis NBRC3134中rizA基因編碼的Lal只能接受Arg作為其N-末端的底物[22]。Bacillus subtilis NBRC12200中BL00235基因編碼的Lal只能接受Met和Leu作為其N-末端的底物[23]。然而，Pseudomonas syringae NBRC14081中tabS基因編碼的Lal對底物的選擇性較為寬泛，在236個待測的二肽合成反應中共檢測到136個二肽產物，一些非常規(guī)的氨基酸如L-哌啶酸，羥基脯氨酸及β-丙氨酸亦可作為其催化底物[24]。

由于不同來源的Lal對底物氨基酸的親和能力不同，因此目前研究更多集中在對Lal的定點改造以增強其對特定二肽的合成能力。例如，BL00235基因編碼的Lal可以催化合成Met-Gly，但同時伴隨著Met-Met副產物的產生，對該酶的晶體結構進行分析發(fā)現，將其85位Pro轉變?yōu)榉枷阕灏被崛鏟he，Tyr和Trp等能夠阻止該酶C-末端與Met的結合[25]。tabS基因編碼的Lal可以催化20 mmol/L的Pro和20 mmol/L的Gly合成8.3 mmol/L的咸味肽Pro-Gly，其85位Ser以及294位His的改變能夠顯著影響酶的活力，其中S85T/ H294D突變酶催化的Pro-Gly產量增加了一倍[26]。

3.3 直接發(fā)酵法制備二肽

直接發(fā)酵法是將氨基酸發(fā)酵與Lal催化反應進行偶聯，從而實現使用基礎底物葡萄糖和氨水生產二肽的過程。但研究發(fā)現，在野生型大腸桿菌中表達Lal基因時沒有二肽產生，這說明Lal對底物氨基酸的親和力較低，同時菌體自身能夠利用二肽作為氮源[27]。對于前一問題，可以通過提高底物氨基酸的通量予以克服，例如可以通過基因過表達或解除氨基酸對合成酶的反饋調控提高胞內底物氨基酸的濃度，從而增加Lal的底物選擇性，減少其他二肽的產生。對于后一問題，可以通過破壞一些相關的蛋白酶基因和二肽攝取酶基因予以克服，例如敲除幾個大腸桿菌中編碼二肽酶或氨肽酶的pepA，pepB，pepD或pepN基因，弱化二肽運輸蛋白基因dpp，能有效減少菌體自身對二肽的降解。Tabata和Hashimoto運用上述策略構建了一株產Ala-Gln的基因工程大腸桿菌。經過47 h的發(fā)酵培養(yǎng)，Ala-Gln的產量達到100 mmol/L（25 g/L），副產物Ala-Ala的產量為26 mmol/L（3.6 g/L），對葡萄糖的轉化率達到11.5%[28]。

4 結論

二肽的生物合成技術目前仍處在初步研發(fā)階段，但非核糖體肽合成酶以及L-氨基酸-α-連接酶的發(fā)現說明微生物中確實存在特異性的肽合成酶。與現有的二肽制備方法相比，使用基于NRPS以及Lal的生物合成技術制備二肽能夠帶來更好的經濟效益和環(huán)境效益。在二肽發(fā)酵工程菌的構建方面，既需要通過合理設計NRPS或尋找同源的Lal來合成更多種類的二肽，又需要通過強化胞內氨基酸的供給及能量供應，減弱二肽降解和輸入途徑來增加二肽的積累。上述生物合成途徑的建立和優(yōu)化將有助于打破目前二肽的生產瓶頸，為更多種類二肽的制備及應用研究提供幫助。

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（責任編輯：朱小惠）

Research advances on the biosynthesis and application of dipeptides

FAN Xiaoguang1,2,3,HONG Xiang1,2,3,ZHU Xinya1,2,3,ZHANG Chenglin1,2,3,CHEN Ning1,2,3
(1.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology,Tianjin 300457,China;
2.Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture,Tianjin 300457,China;
3.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Dipeptide is the simplest peptide composed of two amino acids.The functions of dipeptides have been poorly studied compared with proteins or amino acids due to the lack of efficient preparation method.Only a few dipeptides,such as aspartame(L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester)and L-alanyl-L-glutamine,are commercially used.Recently,the discovery of nonribosomal-dependent synthetic pathway of dipeptide enabled its production via enzymatic methodor fermentative processes.In this review,the functions and applications of dipeptides,as well as the existed methods and new strategies for dipeptide production are summarized.

dipeptides;physiological function;production methods;biosynthesis process

TQ922

A

1674-2214（2016）04-0199-05

2016-05-13

天津市科技特派員項目（15JCTPJC62800）

范曉光（1987—），男，天津人，講師，博士，研究方向為代謝控制發(fā)酵，E-mail:xiaoguangfan@tust.edu.cn.