王嗣涵，李 冰，周緒正，楊孝樸，張繼瑜*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

HPLC法測定新型獸用蒿甲醚注射液中蒿甲醚含量

王嗣涵1,2，李 冰2，周緒正2，楊孝樸1，張繼瑜1,2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

為建立新型獸用蒿甲醚注射液中蒿甲醚含量的高效液相色譜測定方法，采用Hypersil ODS C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，流動相為乙腈-水-四氫呋喃(體積比為62∶37∶1)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長216 nm。測定結(jié)果顯示，蒿甲醚在該色譜條件下系統(tǒng)適應性好，在質(zhì)量濃度為100～800 μg/mL時線性關(guān)系良好，回歸方程為y=302.36x-682.02，R2=0.999 8；總平均回收率為97.58%，RSD為1.58%；對3批樣品的蒿甲醚含量進行測定，RSD為1.42%。表明建立的方法可用于新型蒿甲醚注射液中蒿甲醚含量的測定。

蒿甲醚注射液； 高效液相色譜法； 含量測定

青蒿素于1971年首次從菊科植物黃花蒿(ArmisiaannuaL.)中分離提取，對瘧原蟲紅細胞內(nèi)裂殖體的殺滅作用較好。隨后人們又以青蒿素為先導化合物合成了許多衍生物，蒿甲醚(artemether)是其中之一[1]。1987年9月11日,我國衛(wèi)生部舉行青蒿素及其衍生物新聞發(fā)布會,正式宣布批準蒿甲醚注射液作為治療各種危重瘧疾病人的特效藥投入大批量生產(chǎn)。同年,世界衛(wèi)生組織(WHO)對蒿甲醚的藥效進行嚴格驗證，并認定蒿甲醚為療效最好的抗瘧藥品。蒿甲醚成為我國第一個國際注冊的制劑藥品[2]。在人藥領(lǐng)域蒿甲醚主要用于瘧原蟲的治療，能快速消除寄生蟲血癥[3-4]。

目前，蒿甲醚尚未應用到獸藥領(lǐng)域。中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制了新型蒿甲醚注射液以用于獸醫(yī)臨床，因此，急需建立測定制劑中蒿甲醚含量的方法。參考人藥蒿甲醚制劑含量測定方法[5-8]，依據(jù)《中華人民共和國藥典(二部)》[9]和《獸藥研究技術(shù)指導原則匯編(2006—2011年)》[10]中的質(zhì)量控制指導原則，研究蒿甲醚含量的測定方法，旨在為新型蒿甲醚注射液的臨床應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑

蒿甲醚標準品(含量99.3%，批號100271-201404)購自中國藥品生物制品檢定所；蒿甲醚新型注射液(批次20141225、20150121、20150202)、不含蒿甲醚的對照注射液(批次20141223)及80%、100%、120%的蒿甲醚新型注射液(批次20141223、20141224、20141225)均由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制；Watsons純水為廣州屈臣氏食品飲料有限公司產(chǎn)品；乙醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純，為Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 儀器設備

Waters2695高效液相色譜儀、Waters2489紫外可見光檢測器、Empower2色譜工作站均為Waters 公司產(chǎn)品；Hypersil ODS C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×150 mm)為大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品；Sartorius ME235S電子天平為北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品；KQ-300DE超聲波清洗器為昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；溶劑過濾系統(tǒng)為Phenomen公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長為216 nm，流動相為乙腈-水-四氫呋喃(體積比為62∶37∶1)，流速為1 mL/min。

1.3.2 供試品溶液的配制 取蒿甲醚注射液(含量10%)，精密移取0.4 mL蒿甲醚新型注射液于100 mL容量瓶中，用乙醇(含四氫呋喃10%)溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL的蒿甲醚注射液。經(jīng)0.22 μm濾膜(尼龍)過濾后進樣，進樣量為10 μL。

1.3.3 系統(tǒng)適應性試驗 精密稱取蒿甲醚標準品(含量99.3%)0.050 04 g于50 mL容量瓶中，用乙醇(含四氫呋喃10%)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蒿甲醚標準品儲備液。再精密吸取儲備液4.0 mL于10 mL量瓶中，用乙醇(含10%四氫呋喃)溶液稀釋至刻度，搖勻，配制質(zhì)量濃度為400 μg/mL的標準品溶液。進樣前用0.22 μm的濾膜過濾，進樣量為10 μL，記錄色譜圖，并計算理論塔板數(shù)。

1.3.4 雜質(zhì)干擾試驗 按照1.3.2的方法分別配制蒿甲醚新型注射液樣品溶液和不含蒿甲醚的對照注射液樣品溶液，進樣量10 μL，分析不含蒿甲醚的對照注射液對蒿甲醚色譜峰是否有干擾。

1.3.5 標準品溶液的制備 取1.3.3中蒿甲醚標準品儲備液，分別精密吸取儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0 mL于10 mL量瓶中，乙醇(含10%四氫呋喃)溶液稀釋至刻度，搖勻，配制質(zhì)量濃度分別為100、200、300、400、500、600、800 μg/mL的工作液。

1.3.6 線性關(guān)系考察試驗 在上述色譜條件下分別測定蒿甲醚標準品各質(zhì)量濃度梯度溶液的峰面積，每個樣品測定3次，以平均峰面積(y)為縱坐標，以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，進行線性回歸。

1.3.7 精密度試驗 將質(zhì)量濃度為200、500、800 μg/mL的3個樣品，在同日內(nèi)不同時間進樣5次，求得日內(nèi)精密度。將這3個樣品連續(xù)5 d進樣，每天同一時間測定，求得日間精密度。

1.3.8 加樣回收率試驗 制備相當于蒿甲醚新型注射液含量80%、100%、120%的蒿甲醚新型注射液溶液，每個含量制備3份供試品，測定樣品中蒿甲醚含量，計算回收率。

1.3.9 樣品含量的測定 取各批次的蒿甲醚注射液按照上述的色譜條件及方法進行測定，每個批次平行測定3次。精密稱取0.2 mL蒿甲醚注射液于50 mL容量瓶中，用乙醇(含10%四氫呋喃)溶液溶解并稀釋至刻度，此溶液質(zhì)量濃度為400 μg/mL。記錄色譜峰面積，按照外標法以峰面積計算(外標法所用標準品溶液按照1.3.5的方法配制)，同時測定其相對密度，計算樣品含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應性和雜質(zhì)干擾試驗結(jié)果

由圖1可知，蒿甲醚標準品的保留時間約為8.1 min。由圖2可知，不含蒿甲醚的對照注射液對蒿甲醚的HPLC測定無干擾。

圖1 蒿甲醚標準品色譜圖

圖2 蒿甲醚新型注射液和不含蒿甲醚的對照注射液色譜圖

2.2 蒿甲醚的標準曲線

表1為測定的蒿甲醚標準品的質(zhì)量濃度和平均峰面積，以平均峰面積(y)為縱坐標，以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，進行線性回歸，得到回歸方程y=302.36x-682.02(圖3)。可見，蒿甲醚質(zhì)量濃度為100～800 μg/mL時，線性關(guān)系良好。

表1 蒿甲醚標準品各質(zhì)量濃度梯度及平均峰面積

圖3 蒿甲醚的標準曲線

2.3 精密度試驗結(jié)果

由表2、表3可知，蒿甲醚日內(nèi)精密度、日間精密度的RSD分別為1.29%、0.46%，均小于5%，符合方法學驗證對精密度的要求。

2.4 加樣回收率試驗結(jié)果

由表4可知，含量為80%、100%、120%的蒿甲醚新型注射液中，蒿甲醚的回收率在95.87%～98.82%，總平均回收率為97.58%，RSD為1.58%。說明建立的含量測定方法準確度高，且符合回收率在80%～120%的要求。

表2 日間精密度試驗結(jié)果

表3 日內(nèi)精密度試驗結(jié)果

2.5 樣品中蒿甲醚含量測定結(jié)果

對3批蒿甲醚新型注射液產(chǎn)品進行含量測定，蒿甲醚的含量在97.27%～99.31%，RSD為1.42%(表5)。

表5 樣品中蒿甲醚含量測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗色譜條件參考《中華人民共和國藥典(二部)》中人藥蒿甲醚注射液的色譜條件，并依據(jù)藥物注射液本身的特點和試驗條件進行優(yōu)化。由于蒿甲醚注射液主要輔料為醫(yī)用注射茶油，用流動相溶解注射液并不完全，會形成乳濁液，影響含量測定的準確性，有研究報道，使用無水乙醇并超聲約2 min能形成澄清的溶液[5]。本試驗發(fā)現(xiàn)，單一使用無水乙醇并超聲只是將乳濁液油滴由大變小，并不能徹底溶解；先用四氫呋喃溶解茶油，再加入乙醇稀釋至刻度，可完全溶解注射液中的油劑，且無需超聲溶解。同時使用四氫呋喃和乙醇2種溶劑，所以在色譜出峰前2.5 min會有部分溶劑峰?！吨腥A人民共和國藥典(二部)》中規(guī)定的HPLC法測定蒿甲醚的流動相為乙腈-水(體積比為62∶38)，為了溶解注射液中的茶油，溶劑中含有四氫呋喃，故本試驗將流動相組分中加入了1%的四氫呋喃，流動相為乙腈-水-四氫呋喃(體積比為62∶37∶1)。加入四氫呋喃后，蒿甲醚出峰時間提前約0.5 min。前人也有研究報道[11-15]，適當增大有機相比例，減小水相比例可避免蒿甲醚色譜峰峰形拖尾。

注射液中90%成分是醫(yī)用注射茶油，茶油屬不干性油，主要由油酸甘油酯構(gòu)成，飽和酸構(gòu)成的酯(固體酯)含量較少，茶油中容易自動氧化的多不飽和脂肪酸含量較低(碘價較低)，比其他液態(tài)油穩(wěn)定，對皮膚的剌激小[16-20]。茶油本身也會出現(xiàn)色譜峰，但色譜出峰時間與蒿甲醚不同，因而不影響后期的蒿甲醚含量測定。

由本試驗結(jié)果可知，試驗中蒿甲醚的含量測定方法的方法學驗證符合要求，方法可靠、選擇性好、重現(xiàn)性好、操作簡便，可用于蒿甲醚注射液中蒿甲醚的含量測定，為注射液的質(zhì)量評價和質(zhì)量標準的制定奠定了基礎(chǔ)，并為其進一步研究和開發(fā)提供了依據(jù)。

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Determination of Artemether Content in Artemether Injection by HPLC

WANG Sihan1,2,LI Bing2,ZHOU Xuzheng2,YANG Xiaopu1,ZHANG Jiyu1,2*

(1.College of Veterinary Medicine,Gausu Agricultural University,Lanzhou 730070,China; 2.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of New Animal Drug Discovery,Ministry of Agriculture,Lanzhou 730050,China)

To establish high performance liquid chromatography(HPLC)detection method for the determination of artemether in the artemether injection,the Hypersil ODS C18 chromatographic column(5 μm,4.6 mm×150 mm) was used.The component of mobile phase,column temperature,flow rate and the detection wave length were optimized.The results showed that the acetonitrile-water-tetrahydrofuran(62∶37∶1,V/V)was as mobile phase,the column temperature was 30 ℃,the flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 216 nm.The HPLC detection system adaptability of artemether was good.In 100—800 μg/mL concentration range,the linearity was well,the regression equation wasy=302.36x-682.02,R2=0.999 8.Overall average recovery was 97.58% andRSDwas 1.58%.RSDof 3 batches of samples of artemether content determination was 1.42%.The method could be used to detect the content of artemether in artemether injection.

artemether injection; HPLC; content determination

2017-02-20

甘肅省科技支撐計劃項目(1604NKCA069-02)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CAR-38)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(301303038-4)

王嗣涵(1991-)，男，甘肅蘭州人，在讀碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)藥理學。E-mail:wangshjaz@hotmail.com

*通訊作者：張繼瑜(1967-)，男，甘肅慶陽人，研究員，博士，主要從事獸醫(yī)藥理學研究。E-mail:infzjy@sina.com

S859.1

A

1004-3268(2017)08-0156-05