段佳慧，趙冬冬，李凱新，趙曉艷，左文君，林樹梅

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866)

專論與講座

胰腺干細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞的誘導(dǎo)方法

段佳慧1，趙冬冬，李凱新，趙曉艷，左文君，林樹梅*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866)

糖尿病作為全球范圍內(nèi)的代謝性常見疾病，嚴(yán)重影響著患者的生命質(zhì)量。常規(guī)的藥物和胰島素注射并不足以根治糖尿病。近年來，逐漸發(fā)展起來的干細(xì)胞的相關(guān)研究，有望從根本上治愈糖尿病及其并發(fā)癥，因而成為治療糖尿病的研究熱點(diǎn)。而利用干細(xì)胞醫(yī)治糖尿病的關(guān)鍵點(diǎn)是明確干細(xì)胞的來源及分化為胰島細(xì)胞的誘導(dǎo)方法。論文針對胰腺干細(xì)胞存在部位及誘導(dǎo)方法的研究概況做一綜述。

胰腺干細(xì)胞；糖尿??；誘導(dǎo)分化；胰島素

近年來，隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，糖尿病(DM)患者數(shù)量也在不斷上升。有調(diào)查研究表明，2013年全世界約有8.4%的成年人糖尿病患者，高達(dá)3.82億人。與人類的發(fā)病相似，寵物糖尿病(尤其是犬貓)也呈逐年遞增趨勢，而新近統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，寵物糖尿病發(fā)病率基本在0.5%～1.5%之間。糖尿病是一種復(fù)雜的代謝性疾病，主要表現(xiàn)為血糖值高，并伴有神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、腎臟等功能障礙[1]。根據(jù)發(fā)病機(jī)制不同，糖尿病可分為1型(胰島素依賴性糖尿病)和2型(非胰島素依賴性糖尿病)糖尿病。1型糖尿病表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞胰島素分泌障礙，患者需終生依賴胰島素。2型糖尿病表現(xiàn)為胰島素抵抗，主要由遺傳因素和環(huán)境因素等引起[2]。針對于2 型糖尿病，臨床上已經(jīng)開發(fā)多種藥物并得到應(yīng)用，起到一定的控制血糖作用，但患者依然會出現(xiàn)一些急慢性并發(fā)癥。顯而易見，這不是最好的治療糖尿病的手段。2000年加拿大學(xué)者埃德蒙創(chuàng)立了“埃德蒙法”，將分離出的胰島細(xì)胞團(tuán)移植入患者體內(nèi)，是解決糖尿病問題的一大進(jìn)步。但是，由于目前胰島來源相對匱乏，并且需要患者長期使用免疫抑制劑，使其應(yīng)用受到了一定限制。近年來，逐漸發(fā)展起來的干細(xì)胞的相關(guān)研究表明，胰腺干細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)分化，將誘導(dǎo)分化形成的類胰島細(xì)胞回植到患病動物體內(nèi)，可以長期維持血糖的穩(wěn)態(tài)[3]，有望從根本上治愈糖尿病及其并發(fā)癥，為糖尿病的治療提供了新的思路。

1 胰腺干細(xì)胞

人體內(nèi)大部分細(xì)胞是已達(dá)到終末分化狀態(tài)的細(xì)胞，如胰島細(xì)胞。而胰腺干細(xì)胞是未達(dá)到終末分化狀態(tài)的細(xì)胞，是能產(chǎn)生胰島結(jié)構(gòu)、能夠進(jìn)行自我復(fù)制、定向分化的未定型細(xì)胞，是成體干細(xì)胞的一種[4]。移植胰腺干細(xì)胞，既解決了胚胎干細(xì)胞的道德倫理爭論，又不存在胰島β細(xì)胞缺乏的弊端。

2 胰腺干細(xì)胞的鑒定與分化

目前認(rèn)為胰腺干細(xì)胞主要存在于胰腺的腺泡、導(dǎo)管和胰島中，而且有能力進(jìn)一步分化為胰腺內(nèi)分泌和外分泌細(xì)胞。但胰腺干細(xì)胞的鑒定目前尚無確定一致的方法，多數(shù)依賴胰腺中的細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)作為分子標(biāo)記物，如細(xì)胞角蛋白-19(cytokeratin-19，CK-19)、胰腺十二指腸同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)、巢蛋白(nestin)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在胰島、胰腺導(dǎo)管及外分泌胰腺中均有nestin的表達(dá)[5]，研究發(fā)現(xiàn)，胰腺組織中表達(dá)nestin的細(xì)胞具備干細(xì)胞的特性，稱nestin陽性胰島前體細(xì)胞。此類細(xì)胞也表達(dá)PDX-1，它是胰島細(xì)胞發(fā)育過程中早期的分化標(biāo)志。而二者共表達(dá)被認(rèn)為是胰腺干細(xì)胞的鑒定標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠部分胰腺組織自體移植后，有CK-19和胰島素表達(dá)，而對照組無相應(yīng)抗原表達(dá)[6]。體外試驗(yàn)中胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和胰島細(xì)胞在胃泌素與表皮生長因子共同作用下可促進(jìn)分化成胰島β細(xì)胞[7]。

3 胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞的方法

3.1 化學(xué)試劑體外誘導(dǎo)分化

目前胰島細(xì)胞的獲取辦法，主要是基于Lumelsy等提出的五步誘導(dǎo)法[8]。通過分離純化胰腺干細(xì)胞，然后進(jìn)行體外培養(yǎng)，加入營養(yǎng)因子，并誘導(dǎo)分化為具有功能的胰島結(jié)構(gòu)。緊接著，改良后的Bose B的方法有效提高了誘導(dǎo)率，達(dá)到65%左右[9]。目前最主要的誘導(dǎo)分化方法是化學(xué)誘導(dǎo)法，它通過添加一些化學(xué)誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素分泌細(xì)胞[10]。Yatoh S等[11]用胰腺腸癌抗原抗體處理導(dǎo)管細(xì)胞，得到了胰島素分泌細(xì)胞。在導(dǎo)管細(xì)胞培養(yǎng)基中加入霍亂毒素或8溴環(huán)磷酸腺苷等促環(huán)磷酸腺苷生成劑，經(jīng)過長期培養(yǎng)以后，發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)的CK-19與Pdx1陽性細(xì)胞，當(dāng)轉(zhuǎn)染神經(jīng)元素3蛋白(neurogenin3，Ngn3)之后，檢測到了胰島素。在外分泌細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了Ngn3、Pdx1、肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A(MafA)，有胰島β細(xì)胞產(chǎn)生[12]。另有研究表明，成年大鼠的胰導(dǎo)管上皮細(xì)胞在體外由肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF) 介導(dǎo)下也可以分化成β細(xì)胞[13]。張慧茹等[14]采用肝細(xì)胞生長因子加煙堿加葡萄糖組合，誘導(dǎo)分化仔豬胰腺干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有胰島素產(chǎn)生，并且比用胰高血糖素肽-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的胰島素水平要高。同時誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞具有一定的葡萄糖反應(yīng)性，適當(dāng)提高葡萄糖濃度，胰島素釋放量增加。

尼克酰胺是維生素B3的一種形式，可以通過代謝產(chǎn)物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(簡稱輔酶1)廣泛介入許多生命調(diào)節(jié)過程。尼克酰胺在體外定向誘導(dǎo)分化為胰腺前體細(xì)胞被廣泛應(yīng)用[15]。此外，還可作為β細(xì)胞分化的一種成熟的促進(jìn)因子[16]。Kawakami M等[17]通過一種長春花生物堿-conophylline和尼克酰胺聯(lián)合誘導(dǎo)新生仔豬胰腺細(xì)胞3周，發(fā)現(xiàn)有新生胰島素分泌細(xì)胞產(chǎn)生，且具有較高的葡萄糖反應(yīng)性。謝謙等[18]也發(fā)現(xiàn)，化學(xué)試劑尼克酰胺定向誘導(dǎo)胰腺干細(xì)胞，可產(chǎn)生胰島樣組織結(jié)構(gòu)。

3.2 基因誘導(dǎo)方法

基因誘導(dǎo)方法通常是利用基因工程技術(shù)將與β細(xì)胞功能相關(guān)的基因或胰島發(fā)育過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入干細(xì)胞，促進(jìn)其分化，得到目的細(xì)胞的手段[19]。Blyszczuk P等[20]利用基因誘導(dǎo)方法，通過反轉(zhuǎn)錄病毒，將目的基因PDX-1和Pax-4插入小鼠干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)插入Pax-4基因的干細(xì)胞在體外培養(yǎng)后獲得了胰島樣細(xì)胞團(tuán)，并產(chǎn)生胰島素，細(xì)胞團(tuán)移植回體內(nèi)后出現(xiàn)血糖降低的情況。王鴻武等也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Mafa基因的干細(xì)胞具有向胰島素分泌細(xì)胞分化的潛能[21]。同時體外超表達(dá)Ngn3和MafA誘導(dǎo)得到的細(xì)胞團(tuán)也具有降低血糖的作用[22]。近幾年，通過microRNA方法誘導(dǎo)篩選得到的miR-26、miR-182等也能夠促進(jìn)胰島素分泌細(xì)胞形成。而miR-375則能靶向PDK1抑制胰腺干細(xì)胞分化[23]。

3.3 間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)胰腺干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化

張迪等[24]在SD大鼠胰腺被膜下多點(diǎn)注射間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胰腺干細(xì)胞標(biāo)志物nestin、PDX-1的mRNA表達(dá)量增高，并且胰島素的mRNA表達(dá)量也增高，推測可能是干細(xì)胞向β細(xì)胞方向發(fā)生分化。因此張迪等認(rèn)為，內(nèi)源性胰腺干細(xì)胞在間充質(zhì)干細(xì)胞的影響下，具有促進(jìn)胰島β細(xì)胞新生的功能，對試驗(yàn)性糖尿病大鼠有治療作用。有研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞不僅具備較強(qiáng)的增殖和分化能力外，通過細(xì)胞共培養(yǎng)，使細(xì)胞間充分接觸、融合，可促進(jìn)細(xì)胞成熟和組織修復(fù)，進(jìn)而維持正常組織細(xì)胞的功能。張育森等[25]發(fā)現(xiàn)，體外與胰島共培養(yǎng)的胰腺干細(xì)胞存活時間加長，將干細(xì)胞移植入糖尿病大鼠左腎包膜下后，血糖降低。機(jī)制的存在可能是與干細(xì)胞間相互接觸，能夠分泌各種促進(jìn)損傷修復(fù)、營養(yǎng)支持的可溶性因子有關(guān) 。

3.4 胰腺干細(xì)胞自體移植

因?yàn)榧?xì)胞的分化受細(xì)胞外基質(zhì)和胞內(nèi)基因的協(xié)同作用，所以在體外模擬活體內(nèi)干細(xì)胞巢的微環(huán)境，并促進(jìn)干細(xì)胞定向分化具有較大難度。干細(xì)胞自體移植或許是可行的辦法之一。研究人員嘗試將胰腺干細(xì)胞直接移入體內(nèi)，使其在體內(nèi)微環(huán)境的作用下進(jìn)行分化，得到胰島素分泌細(xì)胞。章樂虹等[6]切除大鼠大部分胰腺(>90%)，并將篩選出的胰腺干細(xì)胞回植入大鼠自體皮下，植入自體胰腺干細(xì)胞8周起，受體鼠血糖水平、糖刺激的耐受能力與對照組有顯著差異。受體小鼠在術(shù)后10周～12周移植物中發(fā)現(xiàn)胰腺樣結(jié)構(gòu)和胰島素染色、CK-19染色陽性細(xì)胞。說明大鼠胰腺內(nèi)存在胰腺干細(xì)胞，并在移植后能分化為胰島素陽性細(xì)胞，有效改善鼠的血糖水平，同時避免了免疫排斥反應(yīng)。張悅等[26]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)原位移植胰腺干細(xì)胞的胎鼠，血清胰島素含量上升，高血糖癥狀有所緩解，病理切片可見外源性的細(xì)胞團(tuán)，免疫組化顯示nestin、胰島素呈陽性表達(dá)。而肝及腎包膜下移植大鼠各項(xiàng)指標(biāo)未見明顯改善。提示這可能是活體內(nèi)干細(xì)胞巢促使胰腺干細(xì)胞分化，促進(jìn)胰島樣細(xì)胞團(tuán)生成。

3.5 在體激活胰腺干細(xì)胞，促其分化為胰島細(xì)胞

傳統(tǒng)的糖尿病治療藥物主要通過刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素、提高機(jī)體胰島素敏感性或延緩葡萄糖的生成來控制血糖水平，這對糖尿病有一定的緩解作用，卻未能根治糖尿病或阻止糖尿病并發(fā)癥的形成，甚至?xí)黾右葝u細(xì)胞負(fù)擔(dān)，加快胰島細(xì)胞功能衰竭。目前，最好的治療糖尿病的方法是開發(fā)一種新藥，能在活體內(nèi)促進(jìn)胰腺干細(xì)胞分化為胰島β細(xì)胞，既方便服用，又避免了胰島細(xì)胞負(fù)擔(dān)及胰島移植的免疫排斥反應(yīng)。目前科研工作者也正在不斷嘗試，我們期望在不遠(yuǎn)的將來成為現(xiàn)實(shí)。

綜上所述，目前能分化為胰島細(xì)胞的干細(xì)胞主要是胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，胰腺干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞，能夠在一定條件下誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞。研究表明，目前通過細(xì)胞共培養(yǎng)和化學(xué)法誘導(dǎo)得到胰島素分泌細(xì)胞的方法，較為常用，但轉(zhuǎn)分化效率并不高?；蛘T導(dǎo)法可直接獲得目的產(chǎn)物，有望從根本上獲取胰島素分泌細(xì)胞，但安全性上有待探討。胰腺干細(xì)胞自體移植較為安全，且無免疫排斥反應(yīng)，臨床上較為可行，有望成為糖尿病治療的主要手段。同時，服用藥物，在體激活胰腺干細(xì)胞，規(guī)避了上述多種誘導(dǎo)手段的缺點(diǎn)，且方便可行，將成為未來糖尿病治療的趨勢。

致謝：感謝沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院林樹梅副教授對文稿所提的寶貴意見。

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2017-04-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572481)

段佳慧(1993-)，女，遼寧昌圖人，碩士研究生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。*

S852.2

A

1007-5038(2017)12-0111-04