徐晴晴，孫 培，褚仁忠，王文秀，王金良，肖躍強(qiáng)，王 艷，魏 鳳，莫 玲，苗立中*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開(kāi)發(fā)推廣中心，山東濱州 256600；2.濱州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)農(nóng)村工作部，山東濱州 256600；3.陽(yáng)信縣畜牧獸醫(yī)局，山東濱州 256600；4.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600)

2016年魯北地區(qū)雞群病毒性腫瘤病例的檢測(cè)分析

徐晴晴1△，孫 培2△，褚仁忠3，王文秀4，王金良4，肖躍強(qiáng)4，王 艷4，魏 鳳1，莫 玲4，苗立中4*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開(kāi)發(fā)推廣中心，山東濱州 256600；2.濱州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)農(nóng)村工作部，山東濱州 256600；3.陽(yáng)信縣畜牧獸醫(yī)局，山東濱州 256600；4.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600)

為了解雞馬立克病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)在魯北地區(qū)雞群中的感染情況，對(duì)來(lái)自21個(gè)雞群的送檢病例進(jìn)行了病原核酸的PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示， MDV陽(yáng)性率為28.5%，ALV-J陽(yáng)性率為23.8%，REV陽(yáng)性率為14.3%，腫瘤病毒的二重感染率為28.6%。結(jié)果表明，3種腫瘤病毒在魯北地區(qū)蛋雞和地方品種雞群中的感染嚴(yán)重，病毒的混合感染較多。因此，做好MD的疫苗防護(hù)，對(duì)ALV-J及REV的感染狀況要進(jìn)行定期檢測(cè)，控制好養(yǎng)殖環(huán)境，盡量避免3種腫瘤病毒的繼發(fā)感染。

雞馬立克病病毒；禽白血病病毒；禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒；PCR檢測(cè)

外源性禽白血病病毒(ALV)、馬立克病病毒(MDV)和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生癥病毒(REV)是引起雞產(chǎn)生腫瘤的3種最常見(jiàn)病毒。這3種病毒不同程度的存在我國(guó)雞群中，常呈混合感染[1-3]，均能導(dǎo)致雞體產(chǎn)生免疫抑制，引起生產(chǎn)性能下降、繼發(fā)感染和致死性腫瘤，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對(duì)ALV和REV沒(méi)有商品化的疫苗來(lái)免疫預(yù)防，MDV感染主要靠免疫弱毒疫苗來(lái)預(yù)防，包括MDV-1型的CVI988株、MDV-2型的SB-1株和HVT型疫苗的FC126株，一般通過(guò)皮下或肌肉接種于1日齡雛雞。免疫接種后7 d才能產(chǎn)生保護(hù)力，所以如果早期接觸了MDV野外強(qiáng)毒也能引起免疫雞群發(fā)病。近年來(lái)，從一些癥狀不典型或者病變多樣化的病雞中經(jīng)常檢測(cè)到這3種腫瘤病毒的感染。魯北地區(qū)是黃河三角洲高效生態(tài)農(nóng)業(yè)核心規(guī)劃區(qū)，本研究通過(guò)剖檢診斷和PCR檢測(cè)對(duì)2016年來(lái)自魯北地區(qū)的21份病料進(jìn)行了3種常見(jiàn)腫瘤病毒的檢測(cè)，為了解當(dāng)前3種腫瘤病毒的感染情況及其防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例 2016年2月至12月送至本單位門診進(jìn)行診斷的病雞，包括肉雞和蛋雞，30日齡～360日齡不等。根據(jù)發(fā)病的臨床癥狀初步判斷為雞3大常見(jiàn)腫瘤病毒感染的共有21份病例，這其中有5次送檢的為病死雞。對(duì)發(fā)病雞的來(lái)源、品種、癥狀等進(jìn)行記錄。

1.1.2 主要試驗(yàn)材料 病毒RNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Thermo公司產(chǎn)品；2 ×TaqPCR Star Mix with Loading Dye為Gen Star公司產(chǎn)品；DNA Marker和pMD18-T載體為TaKaRa公司產(chǎn)品；SPF雞胚購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司；高糖DMEM、胎牛血清均為Gibco公司產(chǎn)品；ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒為美國(guó)IDEXX公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物信息 參考文獻(xiàn)中報(bào)道的檢測(cè)雞3種主要致腫瘤病毒(ALV、MDV、REV)的6對(duì)引物[4-7](表1)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病例剖檢 對(duì)剖檢后發(fā)現(xiàn)有內(nèi)臟腫瘤的病雞剪取腫瘤部位的組織，提取該組織的RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用表1的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.2 PCR檢測(cè) 合成的6對(duì)特異性引物中，B1/B2擴(kuò)增的目的基因?yàn)? 100 bp是這些目的基因中最長(zhǎng)的。分別用本單位從病料中提取的ALV-A/B/J、MDV和REV陽(yáng)性DNA進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，優(yōu)化試驗(yàn)條件后這6對(duì)引物可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)程序擴(kuò)增:提取病料組織中的DNA為模板，用2 ×TaqPCR Star Mix with Loading Dye 按說(shuō)明書配置20 μL反應(yīng)體系，按照如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 鑒別診斷引物信息

注：M1/M2引物擴(kuò)增毒株的毒力不同，目的基因大小不同。含2～3個(gè)重復(fù)序列的為高毒力毒株(即目的基因?yàn)?00 bp或400 bp時(shí))。

Note:The sizes of target genes which M1/M2 primer amplified are different because of different strains virulence.High virulent strains usually have 2-3 repeats (i.e.,the target gene is around 300 bp or 400 bp).

1.2.3 病毒分離與鑒定 將檢測(cè)為ALV-J陽(yáng)性的相應(yīng)病變組織研磨，反復(fù)凍融后，0.22 μm無(wú)菌濾器過(guò)濾后接種9日齡SPF雞胚制備的成纖維細(xì)胞(CEF)，感作2 h后，無(wú)血清DMEM洗滌2次，換含50 mL/L胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)6 d。用ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CEF上清。提取上清為ALVp27抗原陽(yáng)性的CEF RNA，反轉(zhuǎn)錄后用針對(duì)ALV-J gp85基因的特異性引物(表1中的ALV-J P1/P2)擴(kuò)增目的基因后連接克隆載體pMD18-T并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 病例剖檢

送檢的21份懷疑為致腫瘤病毒感染的病雞剖檢后發(fā)現(xiàn)有典型內(nèi)臟腫瘤病變的有5份，其中肝臟、脾臟、腎臟有明顯大小不一的腫瘤結(jié)節(jié)，5份腫瘤病例中的典型腫瘤病變見(jiàn)圖1。

A.360日齡蘆花蛋雞種公雞，腎臟充滿了黃豆粒大小的白色腫瘤結(jié)節(jié)(濟(jì)南商河)；B.150日齡蘆花蛋雞，脾臟表面有綠豆樣腫瘤結(jié)節(jié)(濱州惠民)；C.120日齡海蘭褐病死蛋雞，脾臟高度腫脹，花白相間，布滿了白色的腫瘤小結(jié)節(jié)(濱州無(wú)棣)；D.179日齡病死海蘭褐蛋雞，肝臟腫大且破裂出血(德州慶云)；E.60日齡柴雞，肝臟布滿了大小不一界限清晰的腫瘤結(jié)節(jié)(濱州里則)

A.White tumor nodules of soybean grain size filled with kidney in 360-days old breeder cock of Luhua layers (Jinan Shanghe); B.Mung bean-like tumor nodules in spleen surface of 150-days old Luhua layers (Binzhou Huimin ); C.The spleen swells severely,gray and white,full of white tumor nodules (Binzhou Wudi) of Hyline brown layers which dead at 120-days old; D.Swelling and rupture hemorrhage in liver of Hyline layers which dead at 179-days old (Dezhou Qingyun); E.The liver is covered with different sizes of tumor nodules with clear boundaries of 60-days old Domestic chicken (Binzhou Lize)

圖1病例剖檢的典型腫瘤病變

Fig.1 The pathological lesions of typical tumorous

2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果

采用PCR方法檢測(cè)了21份送檢病例MDV、ALV和REV感染情況(表2)。其中有9份病例檢測(cè)結(jié)果顯示存在3種病毒的感染(表3)。圖2為典型病例的檢測(cè)結(jié)果，其中圖2a顯示病雞存在ALV-J感染，圖2b中病雞存在MDV和REV的混合感染，圖2c中病雞存在REV和ALV-J的混合感染，圖2d中存在MDV和ALV-J的混合感染。

表2 腫瘤病毒單純/混合感染的檢測(cè)結(jié)果

表3 9份腫瘤病毒感染病例的PCR檢測(cè)結(jié)果

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.544 bp的ALV-J基因片段；2.434 bp的MDV基因片段；3.300 bp的REV基因片段；4.300 bp的REV基因片段；5.544 bp的ALV-J基因片段；6.434 bp的MDV基因片段；7.544 bp的ALV-J基因片段

M.DNA Marker DL 2 000 ; 1.ALV-J 544 bp; 2.MDV 434 bp; 3.REV 300 bp; 4.REV 300 bp; 5.ALV-J 544 bp; 6.MDV 434 bp; 7.ALV-J 544 bp

圖2目的基因的PCR檢測(cè)

Fig.2 PCR detection of target gene

2.3 病毒分離與鑒定

9份腫瘤病毒感染的病例中有MDV、ALV-J、REV單獨(dú)感染的，也有兩兩混合感染的，混合感染的病料不適合分離純病毒，單獨(dú)感染MDV的有2例，都是病死雞不適合該細(xì)胞結(jié)合型病毒的分離，故最終只從感染了ALV-J并引起腎臟、脾臟腫瘤的病雞中分離到了一株ALV-J命名為BZ-0415，將BZ-0415分離株的gp85基因克隆測(cè)序后與部分國(guó)內(nèi)外ALV-J毒株的gp85基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明該毒株與中國(guó)黑龍江ALV-J分離株HLJ13SH01的同源性最高，達(dá)92.8%(圖3)。

圖3 BZ-0415分離株與部分國(guó)內(nèi)外ALV-J毒株核苷酸同源性比較

3 討論

用PCR檢測(cè)病料中是否存在某種病原的感染，無(wú)論是準(zhǔn)確性還是敏感性，都是一種快速方便的方法。21份病例的檢測(cè)結(jié)果顯示，有9份中檢測(cè)到致腫瘤病毒，這3種常見(jiàn)的雞腫瘤病毒檢出率分別為ALV-J 23.8%、MDV 28.5%和REV 14.3%，且多數(shù)情況下是2種病毒的混合感染。在6份的腫瘤病毒混合感染病例中，MDV的檢出率為66.7%，在9份的腫瘤病毒感染的病例中，MDV的檢出率也高達(dá)66.7%，高于其他2種腫瘤病毒的檢出率(表2)，這種情況應(yīng)該引起足夠重視。近年來(lái)，MDV毒株的毒力不斷增強(qiáng)，免疫失敗時(shí)有發(fā)生[8]。疫苗只能降低宿主的感染率不能阻止病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，感染宿主后病毒能在體內(nèi)持續(xù)存在[9]。MDV毒株的毒力進(jìn)化趨勢(shì)分析表明，其毒力大約十幾年就發(fā)生一次躍遷[10]，這可能是MDV危害加重的原因之一。因此，在新型疫苗的研發(fā)過(guò)程中，必須要考慮到MDV毒株毒力的進(jìn)化態(tài)勢(shì)，采取有效手段阻止病毒毒力增強(qiáng)，開(kāi)發(fā)出當(dāng)下需要的高效疫苗。

國(guó)內(nèi)外育種公司經(jīng)過(guò)十幾年的努力，已經(jīng)在白羽肉雞中完成了ALV的凈化工作。近年來(lái)，關(guān)于白羽肉雞ALV感染鮮有報(bào)道。但ALV-J在我國(guó)蛋雞和地方品種雞中卻普遍存在。由于我國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)量多、養(yǎng)殖模式多樣化、分布散、規(guī)模參差不齊，且ALV-J的凈化工作需要若干世代，周期長(zhǎng)。因此，我國(guó)雞群要實(shí)現(xiàn)ALV-J的凈化，任務(wù)艱巨。在自然、免疫、宿主適應(yīng)性、抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物等選擇壓下，ALV-J囊膜蛋白基因(env)變異迅速，導(dǎo)致其毒力和致瘤性增強(qiáng)，感染的宿主范圍擴(kuò)大，也可能是宿主細(xì)胞表面存在未發(fā)現(xiàn)的新受體。研究表明，以ALV-J為模型，通過(guò)免疫共沉淀、質(zhì)譜分析、熒光定量PCR等技術(shù)鑒定出78 ku葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)和膜聯(lián)蛋白(ANXA2)是ALV-J的新受體[11]。病毒的抗原能夠變異但是靶細(xì)胞表面的受體分子是保守的，因此可以利用細(xì)胞受體研制保護(hù)性抗體或疫苗抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞從而降低被感染的風(fēng)險(xiǎn)。

據(jù)報(bào)道，臨床上經(jīng)常檢測(cè)到REV與ALV-J、MDV、雞傳染性貧血病毒(CAV)和傳染性法氏囊病病毒(IBDV)等免疫抑制性病毒的混合感染的病例[12-14]。REV已成為威脅我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的重要病原。在當(dāng)前生物制品污染概率較低的情況下REV陽(yáng)性率仍然較高，說(shuō)明養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)該病的發(fā)生與傳播有重要影響，已證明野鳥也能攜帶該病毒[15]。由于對(duì)REV在雞群中的危害性認(rèn)識(shí)不夠，目前我國(guó)尚無(wú)檢測(cè)REV的商品化產(chǎn)品。研發(fā)REV相關(guān)的檢測(cè)方法與產(chǎn)品，既滿足我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的技術(shù)需求，也擁有巨大的市場(chǎng)潛力。

MDV、ALV-J、REV等免疫抑制性病毒的流行，必將會(huì)增加雞場(chǎng)中各種疾病的危害程度[16]。ALV-J和 REV感染目前尚無(wú)商品化疫苗可用，只能通過(guò)雞場(chǎng)凈化從源頭上阻斷這兩種病毒的傳播。對(duì)于這3種常見(jiàn)腫瘤病毒感染的防控，一方面要加強(qiáng)綜合管理，另一方面要加快表位疫苗等新型疫苗的研發(fā)，通過(guò)免疫預(yù)防將疾病控制在最低水平。

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DetectionandAnalysisofNeoplasticDiseaseCasesinChickensfromLubeiAreain2016

XU Qing-qing1,SUN Pei2,CHU Ren-zhong3,WANG Wen-xiu4,WANG Jin-liang4, XIAO Yue-qiang4,WANG Yan4,Wei Feng1,MO Ling4,MIAO Li-zhong4

(1.ShandongBinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineAcademy,ShandongBinzhouResearch,DevelopmentandPromotionCenterforLivestockandPoultryPropolisVaccine,Binzhou，Shandong，256600,China; 2.RuralWorkDepartmentofBinzhouEconomicandTechnologicalDevelopmentZone,Binzhou，Shandong，256600,China; 3.YangxinAnimalScienceandVeterinaryMedicineBureau,Binzhou，Shandong，256600,China; 4.ShandongBinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineAcademy,Binzhou，Shandong，256600,China)

In order to know the infection status of chicken Marek's disease virus,avian leukemia virus and reticuloendotheliosis virus in chicken farms of Lubei area,the PCR detection was carried out in 21 cases of inspection from various chicken flocks.The results showed that the positive rate of MDV was 28.5%,23.8% of ALV-J and 14.3% of REV.Dual infections were accounted for 28.6% positive.Infection of three kinds of tumor viruses in hens and local chicken breeds was becoming more and more serious,meanwhile,mixed infection of two viruses was more common.Obviously,chickens in related areas have to be immunized for MDV,and carrying out regular testing for ALV-J and REV.The breeding environment should be controlled well to avoid infections of these three tumor viruses and the incidence of secondary infections.

Chicken Marek's disease virus; Avian leukemia virus; Reticuloendotheliosis virus; PCR detection

2017-05-09

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2016CB32)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)濱州試驗(yàn)站(SDAIT-11-16)

徐晴晴(1986-)，女，山東淄博人，助理研究員，主要從事禽免疫抑制病毒分子生物學(xué)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者，*

S852.659.3

B

1007-5038(2017)12-0123-05