宋昕恬，王 琳，張晶瑩，孟令儀，高 峰，張 琨

(1.吉林省疾病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春 130062；2.吉林省食品藥品認(rèn)證和培訓(xùn)中心，吉林長(zhǎng)春 130061；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春 130000)

人參三醇組皂苷對(duì)大鼠急性坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

宋昕恬1，王 琳2，張晶瑩1，孟令儀1，高 峰1，張 琨3*

(1.吉林省疾病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春 130062；2.吉林省食品藥品認(rèn)證和培訓(xùn)中心，吉林長(zhǎng)春 130061；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春 130000)

研究人參三醇組皂苷(PTS)對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)急性損傷蛋白表達(dá)的影響。建立大鼠坐骨神經(jīng)擠壓損傷模型，隨機(jī)分為PTS組，模型對(duì)照組及空白對(duì)照組，每組各10只大鼠；各組均經(jīng)腹腔注射給藥，PTS組損傷后注射PTS；模型對(duì)照組，損傷后注射同劑量生理鹽水；空白對(duì)照組，不損傷坐骨神經(jīng)，注射同劑量生理鹽水。坐骨神經(jīng)損傷術(shù)后30 d，免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè)PTS對(duì)損傷側(cè)坐骨神經(jīng)神經(jīng)絲蛋白(NF-M)、微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP-43)表達(dá)的影響，觀察PTS對(duì)損傷側(cè)神經(jīng)的影響。大鼠損傷側(cè)坐骨神經(jīng)NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度表達(dá)(9.66±0.99、12.43±1.44、0.344±0.040)與模型對(duì)照組(8.21±1.25、11.90±1.14、0.278±0.042)比較有極顯著性差異(P<0.01)。PTS可促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷大鼠NF-M，MAP-2，GAP-43的表達(dá)。

人參三醇組皂苷；坐骨神經(jīng)；蛋白表達(dá)；免疫組化；大鼠

現(xiàn)今坐骨神經(jīng)損傷是一種較為常見的外周神經(jīng)損傷性疾病，損傷后極大地降低了患者的生活質(zhì)量，損傷初期會(huì)出現(xiàn)肌肉疼痛、功能障礙等癥狀，如果未得到及時(shí)治療會(huì)相繼出現(xiàn)肌無力，肌肉萎縮等癥狀，但周圍神經(jīng)損傷與中樞神經(jīng)損傷最大的不同就是有再生的可能。研究發(fā)現(xiàn)人參三醇組皂苷(panaxtrol saponin，PTS)的主要成分Rg1、Re、Rf、Rh1是一種強(qiáng)力的神經(jīng)保護(hù)劑，可促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)，具有神經(jīng)保護(hù)作用[1]，但還未見報(bào)道過對(duì)坐骨神經(jīng)的保護(hù)作用。本試驗(yàn)通過免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè)Wistar雄性大鼠坐骨神經(jīng)擠壓損傷模型大鼠損傷側(cè)坐骨神經(jīng)NF-M、MAP-2、GAP-43的表達(dá)，觀察PTS對(duì)損傷側(cè)神經(jīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠60只，體重200 g±20 g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供(SCXK-(吉)2011-0004)；動(dòng)物室由吉林省疾病預(yù)防控制中心提供(吉?jiǎng)釉O(shè)字10-1005)；溫度21℃±1℃、相對(duì)濕度60%±5%；LEICA RM2135石蠟切片機(jī)、DM4000B顯微鏡、ASP300S脫水機(jī)，德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 60只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、PTS 100 mg/kg bw劑量組，每組20只，大鼠腹腔注射麻醉，劑量為1% 戊巴比妥鈉(5 mL/kg)，常規(guī)消毒，右下肢后外側(cè)切口，鈍性分離股外側(cè)肌和股二頭肌，游離出坐骨神經(jīng)。模型對(duì)照組、PTS 100 mg/kg劑量組兩組動(dòng)物，在距離梨狀肌下緣1 cm處，用血管鉗扣第3格垂直鉗夾神經(jīng)，保持壓迫30 s，造成坐骨神經(jīng)SunderlandⅢ度損傷模型[2]，正常對(duì)照組不做手術(shù)，手術(shù)結(jié)束30 min，PTS 100 mg/kg劑量組腹腔注射PTS，2次/d，連續(xù)30 d[3]。

1.2.2 觀測(cè)指標(biāo) PTS對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠NF-M、MAP-2、GAP-43的檢測(cè)，取坐骨神經(jīng)在40 mL/L甲醛溶液中固定48h→取材→制作蠟塊→組織塊切片。 0.01 mol/L PBS沖洗、室溫孵育、抗原修復(fù)、滴加100 mL/L山羊血清，滴加一抗體、二抗，蘇木素復(fù)染、沖洗、脫水、封片，每組染色過程中均設(shè)定不加一抗的空白對(duì)照染色。顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)中NF-M、MAP-2、GAP-43的表達(dá)情況，經(jīng)圖象分析最終計(jì)算OD值。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析進(jìn)行均值比較，方差齊時(shí)，各組間兩兩比較用LSD法；方差不齊時(shí)，各組間兩兩比較采用Tamhane′s法。

2 結(jié)果

免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè)PTS對(duì)損傷側(cè)坐骨神經(jīng)NF-M、MAP-2、GAP-43表達(dá)的影響，結(jié)果術(shù)后第30天模型對(duì)照組及PTS處理組大鼠坐骨神經(jīng)中NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度值均高于正常組，有顯著性差異(P<0.05)，PTS處理組大鼠坐骨神經(jīng)中NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度值高于模型對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.05)，說明PTS可促進(jìn)神經(jīng)損傷大鼠NF-M，MAP-2，GAP-43的表達(dá)。

表1 PTS對(duì)大鼠損傷側(cè)坐骨神經(jīng)NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度表達(dá)的影響

注：“a”模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較,P<0.05；“b”模型對(duì)照組與試驗(yàn)組比較,P<0.01。

Note:"a"Model control group compared with the blank control group,P<0.05; "b"Model control group compared with the experimental group,P<0.01.

圖1 PTS對(duì)大鼠患側(cè)坐骨神經(jīng)中NF-M表達(dá)的影響

A.空白對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.PTS處理組

A.Blank control group;B.Model control group;C.PTS group

圖2 PTS對(duì)大鼠損傷側(cè)坐骨神經(jīng)NF-M表達(dá)的影響(400×)

Fig.2 Effect of PTS on NF-M expression in injured sciatic nerve of rats(400×)

圖3 PTS對(duì)大鼠患側(cè)坐骨神經(jīng)MAP-2表達(dá)的影響

A.空白對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.PTS處理組

A.Blank control group;B.Model control group;C.PTS group

圖4 PTS對(duì)大鼠損傷側(cè)坐骨神經(jīng)MAP-2表達(dá)的影響(400×)

Fig.4 Effects of PTS on expression of MAP-2 in injured sciatic nerve of rats(400×)

圖5 PTS對(duì)大鼠患側(cè)坐骨神經(jīng)GAP-43表達(dá)的影響

A.空白對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.PTS處理組

A.Blank control group;B.Model control group;C.PTS group

圖6 PTS對(duì)大鼠損傷側(cè)坐骨神經(jīng)GAP-43表達(dá)影響(400×)

Fig.6 Effect of PTS on expression of GAP-43 in injured sciatic nerve of rats(400×)

3 討論

人參自古就是名貴中藥材，五加科植物。被譽(yù)為“滋陰補(bǔ)生，扶正固本”之極品，有補(bǔ)元?dú)?、安神智，生津養(yǎng)血之功效[4]。人參含有多種皂苷和多糖類成分，其中皂苷類能增強(qiáng)大腦皮層的興奮性，平衡中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮和抑制過程。其中人參三醇組皂苷主要包括Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、20-葡糖基-Rf、三七皂苷R1、三七皂苷R4等單體[5-6]。有研究結(jié)果表明，這些單體可以調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)等因子促進(jìn)軸突的再生，有保護(hù)神經(jīng)的作用[1]。Rb1和Rg1單體在針對(duì)應(yīng)激、缺血、缺氧等多種因素導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞的損傷也有較好的保護(hù)作用[7]。NF-M在神經(jīng)元軸突再生修復(fù)中起重要作用，它是神經(jīng)元胞體、神經(jīng)軸突細(xì)胞的主要成分，可以提示神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)。有研究表明，神經(jīng)受到損傷機(jī)體自然修復(fù)過程中，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)后，NF-M的表達(dá)明顯改變，促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)[8-9]。GAP-43是一種熱穩(wěn)定的磷酸蛋白，多分布在神經(jīng)元內(nèi)，對(duì)于損傷的神經(jīng)它可以使其再生、發(fā)育并加快結(jié)構(gòu)重建。微管結(jié)構(gòu)蛋白MAP-2是功能及結(jié)構(gòu)蛋白，又被稱為神經(jīng)生長(zhǎng)和修復(fù)相關(guān)蛋白，是神經(jīng)元軸突和樹突的組成部分，在延長(zhǎng)和增強(qiáng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和維持神經(jīng)元形態(tài)和突觸可塑性方面起到主要作用。在神經(jīng)元受損后MAP-2的表達(dá)降低，在隨后的神經(jīng)元修復(fù)和重建時(shí)MAP-2的表達(dá)明顯升高。在正常情況下神經(jīng)中的GAP-43及MAP-2表達(dá)量很小，當(dāng)神經(jīng)受到損傷時(shí)GAP-43表達(dá)開始升高，當(dāng)神經(jīng)開始自我修復(fù)時(shí)GAP-43、MAP-2表達(dá)明顯升高，這些變化發(fā)生在神經(jīng)受損后的30天內(nèi)，直至損傷神經(jīng)修復(fù)完成后GAP-43、MAP-2表達(dá)水平恢復(fù)至正常[10-13]。由此可見在研究神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性、神經(jīng)的生長(zhǎng)及再生時(shí)，常選澤GAP-43和MAP-2作為研究對(duì)象，它們?cè)谏窠?jīng)損傷修復(fù)和結(jié)構(gòu)重建時(shí)，起到重要的積極作用。

綜上所述，關(guān)于PTS在大鼠坐骨神經(jīng)損傷后的修復(fù)作用的研究目前尚未見報(bào)道。本課題組在前期通過對(duì)PTS 100、50、25 mg/kg 3個(gè)劑量組的研究，發(fā)現(xiàn)只有100 mg/kg劑量組對(duì)急性損傷的坐骨神經(jīng)有保護(hù)作用[14]，本試驗(yàn)只選用100 mg/kg劑量。本課題組還發(fā)現(xiàn)傷側(cè)腓腸肌濕重及腓腸肌恢復(fù)率PTS處理組明顯優(yōu)于模型對(duì)照組。PTS處理組與模型對(duì)照組比較，坐骨神經(jīng)神經(jīng)纖維排列更整齊，軸索更清晰，雪旺細(xì)胞基本保持正常；腓腸肌肌細(xì)胞直徑更均勻，胞核更清晰，數(shù)量增多；故PTS對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)急性病理損傷有一定的修復(fù)作用[15]。通過本試驗(yàn)的結(jié)果可以觀察到，造模后第30天模型對(duì)照組及PTS處理組大鼠坐骨神經(jīng)中NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度值均高于正常組，有顯著性差異(P<0.05)，PTS處理組大鼠坐骨神經(jīng)中NF-M、MAP-2、GAP-43平均光密度值高于模型對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.05)，說明人組皂苷可促進(jìn)神經(jīng)損傷大鼠NF-M、MAP-2、GAP-43的表達(dá)。因此，PTS對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)急性損傷有一定的修復(fù)作用，這不僅填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)相關(guān)外研究的空白，同時(shí)為PTS在坐骨神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)時(shí)的臨床輔助治療提供科學(xué)依據(jù)。

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2017-05-22

吉林省衛(wèi)生計(jì)生委科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012Z026)

宋昕恬(1979-)，女，吉林長(zhǎng)春人，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事食品毒理學(xué)研究。*

S852.2

A

1007-5038(2017)12-0078-04