張桂枝，靳雙星*，黃炎坤，陳文萍

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物科技學院，河南鄭州 450046;2.舞陽縣動物疫病預防控制中心，河南漯河 462400)

獸醫(yī)臨床

禽白血病病毒感染對新城疫和禽流感疫苗免疫效果的影響

張桂枝1，靳雙星1*，黃炎坤1，陳文萍2

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物科技學院，河南鄭州 450046;2.舞陽縣動物疫病預防控制中心，河南漯河 462400)

為研究禽白血病病毒(ALV)感染對新城疫(ND)和禽流感(AI)疫苗免疫效果的影響，采用ELISA方法對河南省某地方品種雞場進行ALV-p27抗原檢測，同時采集試驗雞的血清樣品，檢測ND、AI(H9)和AI(H5)亞型的免疫抗體水平，并比較了ALV經(jīng)種蛋垂直傳播感染1日齡雛雞和后期感染對ND、AI疫苗免疫效果影響的差異。結果表明，ALV經(jīng)種蛋垂直傳播感染1日齡雛雞，能顯著降低ND、AI(H9)和AI(H5)疫苗免疫的抗體水平，陽性試驗組與陰性組相比血清中ND、H9、H5(Re-6)、H5(Re-7)和H5(Re-8)抗體效價分別降低1.71 log2、2.37 log2、1.59 log2、1.00 log2和1.79 log2；雞群后期感染ALV，對ND和AI疫苗的免疫沒有明顯的抑制作用，陽性試驗組與陰性組相比無顯著差異。

禽白血病病毒；新城疫疫苗；禽流感疫苗；免疫效果

禽白血病病毒(Avianleukemia virus，ALV)屬反轉錄病毒，是在雞群中普遍存在并常誘發(fā)腫瘤的三大類病毒之一[1]，幾乎波及所有的商品雞群[2-4]。有關研究表明，雞群感染ALV除引起腫瘤導致直接發(fā)病死亡外；還嚴重影響雞的生產(chǎn)性能，推遲性成熟、產(chǎn)蛋高峰維持時間縮短、產(chǎn)蛋率降低、受精率降低，尤其是祖代和父母代雞群暴發(fā)禽白血病后，ALV經(jīng)過垂直感染可嚴重影響種蛋孵化率和雛雞的質量；另外，ALV還可導致 B淋巴細胞成熟受抑制，阻斷T淋巴細胞的發(fā)育，導致胸腺和法氏囊不同程度的萎縮，使感染雞產(chǎn)生免疫抑制，造成機體抵抗力明顯下降，增加其他疾病繼發(fā)感染的幾率。迄今為止，有關ALV感染對疫苗免疫效果的影響報道較少，尤其是ALV通過種蛋垂直傳播感染和后期水平傳播感染對疫苗免疫效果影響的差異未見報道。本課題組根據(jù)對河南省地方品種雞ALV感染情況調(diào)查結果，選擇某雞場開展了禽白血病的凈化工作，在凈化試驗中重點考察了ALV感染對新城疫和禽流感兩大重要疫病疫苗免疫效果的影響，并比較了ALV垂直傳播感染1日齡雛雞和后期水平傳播感染對疫苗免疫效果影響的差異，為禽白血病的凈化及新城疫和禽流感的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑 酶標儀為Thermo公司產(chǎn)品；微量加樣器、96孔微量反應板、離心機、微量振蕩器、ALV- p27抗原檢測試劑盒均為BioChek公司產(chǎn)品；雞新城疫、禽流感H5和H9血凝抑制試驗檢測抗原和陽性血清為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.1.2 試驗雞及免疫狀況 試驗雞來源于河南省某地方品種雞場，按照本場免疫程序分別進行了雞馬立克病疫苗、新支H120二聯(lián)凍干苗、法氏囊凍干苗、新支流三聯(lián)油苗、禽流感H5N1(Re-6+Re-7+Re-8)油苗、新支H52二聯(lián)凍干苗和新支流減四聯(lián)油苗等的免疫接種。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

1.2.1.1 泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測 采樣前在樣品管中加入1 mL樣品稀釋液，用無菌棉簽采集試驗雞泄殖腔棉拭子，與稀釋液混勻后冷凍。反復凍融2次，檢測前將樣品恢復至25℃，按照BioChek公司ELISA試劑盒的操作說明進行檢測。

1.2.1.2 新城疫和禽流感抗體水平測定 采用微量血凝(HA)試驗，在96孔微量凝集反應板中，測定抗原的凝集滴度，然后配制4單位抗原；采用微量血凝抑制(HI)試驗，測定血清樣品中新城疫、禽流感H9、禽流感H5抗體效價，用n log2來表示。

1.2.1.3 經(jīng)種蛋垂直傳播1日齡雛雞感染ALV對疫苗免疫效果的檢測 出雛當天收集1日齡雛雞胎糞進行ALV-p27抗原檢測。選取抗原陽性雞50只，單獨隔離飼養(yǎng)作為試驗組；選取抗原陰性雞50只作為陰性組。2組雞的飼養(yǎng)管理和免疫程序完全一致，分別在45日齡和65日齡2個時間點，每組各隨機采集24只雞的血清，檢測新城疫(45日齡)、禽流感H9抗體效價(45日齡)和禽流感H5抗體效價(65日齡)，并進行統(tǒng)計分析比較其差異。

1.2.1.4 后期感染ALV對疫苗免疫效果的檢測 選取1日齡胎糞ALV-p27抗原陰性雞作為試驗動物，8周齡時檢測其ALV-p27抗原淘汰陽性雞，陰性雞飼養(yǎng)至23周齡再次檢測泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原，根據(jù)檢測結果將其分為兩組，抗原陽性雞為試驗組(40只)，由于經(jīng)過了1日齡和8周齡檢測淘汰陽性雞，因此該試驗組中的雞大部分是后期感染ALV所致；23周齡抗原陰性雞作為陰性組(40只)。2組雞的飼養(yǎng)管理和免疫程序完全一致，在 180日齡每組各隨機采集24只雞的血清，檢測新城疫、禽流感H5、禽流感H9抗體效價，并進行統(tǒng)計分析比較其差異。

1.2.2 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗所得的所有數(shù)據(jù)，

采用 Microsoft Excel 軟件進行整理和統(tǒng)計分析，抗體效價數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差來表示。

2 結果

2.1 經(jīng)種蛋垂直傳播1日齡雛雞感染ALV對ND和AI疫苗免疫效果的影響

2.1.1 對ND抗體效價的影響 雛雞飼養(yǎng)至45日齡時，分別采集陽性試驗組和陰性組各24只雞的血清，利用微量HA-HI試驗，測定樣品中ND抗體效價。結果顯示，陽性試驗組ND抗體效價平均值為8.29 log2，陰性組為10.00 log2，陽性試驗組的抗體水平顯著低于陰性組(P<0.05)(表1)。

2.1.2 對禽流感H9抗體效價的影響 檢測結果顯示，陽性試驗組禽流感H9抗體效價平均值為7.13 log2，陰性組為9.50 log2，陽性試驗組的抗體水平顯著低于陰性組(P<0.05)(表1)。

2.1.3 對禽流感H5抗體效價的影響 雛雞飼養(yǎng)至65日齡時，分別采集陽性試驗組和陰性組各24只雞的血清，利用微量HA-HI試驗，測定樣品中禽流感H5(Re-6)、H5(Re-7)和H5(Re-8) 抗體效價。結果顯示，陽性試驗組禽流感H5(Re-6)抗體效價平均值為8.58 log2，陰性組為10.17log2，陽性組顯著低于陰性組(P<0.05)；陽性試驗組禽流感H5(Re-7)抗體效價平均值為5.71 log2，陰性組為6.71 log2，兩組間差異極顯著(P<0.01)；陽性試驗組禽流感H5(Re-8)抗體效價平均值為8.17 log2，陰性組為9.96 log2，兩組間差異極顯著(P<0.01)(表2)。

表1 45日齡雞血清中ND、AI-H9抗體水平(n log2)

注：*表示差異顯著(P<0.05)。

Note:*Mean significant difference(P<0.05).

表2 65日齡雞血清中AI-H5抗體水平(n log2)

注：*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:*Mean significant difference(P<0.05);**Mean extremely significant difference(P<0.01).

2.2 后期感染ALV對ND和AI疫苗免疫效果的影響

2.2.1 對ND抗體效價的影響 180日齡時，分別采集陽性試驗組和陰性組各24只雞的血清，測定樣品中ND 抗體效價，結果顯示，陽性試驗組ND抗體效價平均值為10.63 log2，陰性組平均值為10.88 log2，陽性組略低于陰性組，但兩組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

2.2.2 對禽流感H9抗體效價的影響 檢測結果顯示，陽性試驗組禽流感H9抗體效價平均值為10.00 log2，陰性組平均值為10.25 log2，陽性組略低于陰性組，但兩組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

2.2.3 對禽流感H5抗體效價的影響 檢測結果顯示，陽性試驗組禽流感H5(Re-6)抗體效價平均值為8.33 log2，陰性組為8.29 log2，陽性組略高于陰性組，但兩組間差異不顯著(P>0.05)。陽性試驗組禽流感H5(Re-7)抗體效價平均值為7.79 log2，陰性組為8.33log2，陽性組低于陰性組，但兩組間差異不顯著(P>0.05)；陽性試驗組禽流感H5(Re-8)抗體效價平均值為8.25 log2，陰性組為8.46 log2，陽性組略低于陰性組，兩組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 180日齡雞血清中ND與AI-H9、H5抗體水平( log2)

2.3 垂直傳播感染ALV和后期感染ALV對ND和AI疫苗免疫效果影響的差異性比較

由表1、表2、表3檢測結果可知，經(jīng)種蛋垂直傳播1日齡雛雞感染ALV能顯著降低ND、禽流感H9和H5疫苗免疫的抗體水平，陽性組血清中ND、禽流感H9和H5抗體效價顯著低于陰性組，兩組間差異均極顯著(P<0.01)；而后期感染ALV，對ND和AI疫苗的免疫沒有明顯的抑制作用，陽性組血清中ND、禽流感H9和H5抗體效價與陰性組相比無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

由于ELISA方法檢測ALV-p27抗原，無法檢測出所有的外源性ALV[5-6]，因此，盡管雞群在1日齡和8周齡兩個時間點檢測ALV- p27抗原淘汰陽性雞，雞群中仍然存在少數(shù)抗原陰性帶毒雞，這部分雞生長到一定日齡后仍可向外排毒，導致與其接觸雞群感染ALV，這是雞群后期水平感染ALV的重要原因。根據(jù)本試驗23周齡ALV- p27抗原檢測結果，陽性率達4.73%。因此在開展禽白血病凈化工作時，一個世代需經(jīng)多次檢測淘汰抗原陽性雞并結合病毒的分離，同時要健全生物安全制度和孵化管理，經(jīng)過4～5世代凈化才能達到徹底根除目的。

本試驗研究結果表明，ALV經(jīng)種蛋垂直傳播感染1日齡雛雞能顯著降低感染雞群ND和AI疫苗的免疫效果，陽性組血清中ND、禽流感H9和H5抗體效價顯著低于陰性組，兩組間差異均極顯著(P<0.01)；而后期水平傳播感染ALV，對ND和AI疫苗的免疫沒有明顯抑制作用，陽性組血清中ND、禽流感H9和H5抗體效價與陰性組相比無顯著差異。王建新等[7]報道，1日齡肉雞人工感染ALV-J能顯著降低新城疫的抗體效價，與本試驗研究結果ALV經(jīng)種蛋垂直傳播感染1日齡雛雞能顯著抑制ND、禽流感H9和H5免疫效果相一致。司興奎等研究報道ALV感染程度與新城疫、禽流感的免疫抗體水平具有明顯的負相關性[8]。張丹俊等研究報道五華雞群感染ALV-J對247、278和337日齡雞血清中ND、禽流感H9和H5抗體效價沒有明顯影響[9]，與本試驗研究結果后期水平傳播感染ALV對疫苗的免疫效果沒有顯著影響也相符合。

研究表明ALV可以通過干擾功能性白細胞介素2(IL-2)的合成，導致B淋巴細胞成熟受抑制和阻斷T淋巴細胞的發(fā)育。商營利等研究表明，ALV-J可引起雞胸腺、法氏囊及脾臟中淋巴細胞的凋亡，凋亡現(xiàn)象主要在早期，隨日齡的增加凋亡細胞逐漸減少[10]。這可以部分解釋本試驗中ALV經(jīng)種蛋垂直傳播感染1日齡雛雞能顯著降低ND、禽流感H9和H5疫苗免疫的抗體水平，而后期水平傳播感染對ND和AI疫苗的免疫沒有明顯抑制作用。ALV感染越早對雞群的危害越嚴重[11]，因此，做好種雞AL凈化，降低雛雞ALV感染率是充分發(fā)揮ND、AI等疫苗免疫效果，有效預防新城疫和禽流感的重要措施之一。

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EffectofAvianLeukosisVirusInfectiononImmunizedEfficacyofNewcastleDiseaseandAvianInfluenzaVaccine

ZHANG Gui-zhi1,JIN Shuang-xing1,HUANG Yan-kun1,CHEN Wen-ping2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou,Henan,450046,China; 2.WuyangCountryAnimalDiseasePreventionandCountrolCenter，Luohe,Henan,462400,China)

To investigate the effect of Avian Leukosis virus (ALV) infection on immunized efficacy of newcastle disease (ND) and Avian Influenza (AI) vaccine,ALV-p27 antigen was detected in a Henan local strains chicken farm by ELISA method,and the antibody levels of ND,AI(H5)and AI(H9) in infected and non-infected groups were detected，and the different immune effects between 1-day-old vertical transmission and late infection were compared.The results showed that the antibody levels of ND,AI(H5)and AI(H9)were significantly reduced by vertical transmission.In the comparison between the positive test group and the negative control group,the antibody titers for ND,H9,H5(Re-6),H5(Re-7) and H5(Re-8) were decreased by 1.71 log2,2.37 log2,1.59 log2,1.00 log2 and 1.79 log2 respectively.Moreover,antibody titers for ND and AI didn’t show obviously drop in late ALV infection,and there was no significant difference between the positive test group and the negative control group.

ALV; ND vaccine; AI vaccine; immunized efficacy

2017-04-08

河南省重大科技專項計劃項目(161100510200)；?？萍紕?chuàng)新團隊項目(HUAHE2015003)

張桂枝(1970-)，女，河南原陽人，副教授，碩士，主要從事畜禽疫病防治的教學與科研工作。*

S813.7

B

1007-5038(2017)12-0119-04